劉玥欣，徐 巖 ，趙昕彤 ，李 鑫 ，周 佳 ，律廣富 ，林 賀 ，許佳明 ，黃曉巍 ，2

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春130117；2.吉林省中藥生物大分子重點實驗室，長春130117）

輕度認(rèn)知功能障礙 （Mild Cognitive Impairment，MCI）是正常人腦老化發(fā)展為阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）的過渡狀態(tài)，提早干預(yù)MCI對于降低AD的發(fā)病率具有重要意義[1]。中醫(yī)理論認(rèn)為：腎藏精，主骨生髓，腦為髓海，年邁體弱，久病及腎，腎精虧虛，髓海失充，腦萎髓空，腦失所養(yǎng)，神機(jī)失用而出現(xiàn)呆證，宜采用填精補髓法治療腦病[2]。鹿茸為“生精補髓”之要藥，具有壯腎陽，補精髓等功效，主要有效物質(zhì)為鹿茸多肽等[3]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF）是成熟的中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元維持生存及正常生理功能的必需因子[4～5]，神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor，NGF）含對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用[6～7]。本研究采用單側(cè)頸總動脈結(jié)扎法復(fù)制輕度認(rèn)知功能障礙動物模型，通過觀察鹿茸多肽對模型大鼠行為學(xué)指標(biāo)、血清、海馬組織中BDNF、NGF含量及表達(dá)水平的影響，探討鹿茸多肽對模型大鼠的保護(hù)作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 動物及飼料

Wistar大鼠60只，體質(zhì)量220±20g，由長春億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，許可證號碼：SCXK（吉）-2018-0007；鼠維持顆粒料，由長春億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，批號：20190322。

1.2 藥物及試劑

鹿茸多肽，由長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理學(xué)實驗室提供；吡拉西坦，東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，批號：6171256；BDNF、NGF、GAPDH 及 HRP 二抗，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：11527-1-AP、13621-1-AP、10494-1-AP、15134-1-AP； 彩虹 245 廣譜蛋白Marker、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司，批號：PR1920、BC3710、PC0020、P1200、SW2010。

1.3 儀器

跳臺儀，上海欣曼科教設(shè)備有限公司，型號：DTT-2；4℃低溫離心機(jī)，德國Eppendorf艾本德股份公司，型號：Centrifuge 5810 R；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司，型號：DHG-9245A；酶標(biāo)儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司，型號：Multiskan FC；電泳儀，伯樂bio-rad有限公司，型號：BE6085；凝膠成像儀，英國UVItec有限公司，型號：Alliance Q9。

2 實驗方法

2.1 動物分組及模型復(fù)制[8]

60只大鼠隨機(jī)分為：假手術(shù)組，模型組，陽性對照組，鹿茸多肽高、中、低劑量組，每組10只。單側(cè)頸總動脈結(jié)扎法復(fù)制MCI動物模型具體方法如下：大鼠腹腔注射水合氯醛（0.35g·kg-1）麻醉后固定，頸前區(qū)刮毛、消毒，縱行切開皮膚后分離筋膜、肌肉、左側(cè)頸總動脈，用1號手術(shù)絲線永久性結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，局部給予青霉素預(yù)防感染，縫合皮膚，假手術(shù)組不進(jìn)行頸總動脈結(jié)扎其余手術(shù)同上。給予正常食水，飼養(yǎng)3d。

2.2 給藥方法[9～10]

假手術(shù)組、模型組給予同體積蒸餾水，陽性對照組給予500mg·kg-1吡拉西坦，鹿茸多肽高、中、低劑量組分別給予 300mg·kg-1、200mg·kg-1、100mg·kg-1鹿茸多肽。各組大鼠均給予正常食水，連續(xù)給藥18d。

2.3 鹿茸多肽對MCI模型大鼠行為學(xué)指標(biāo)的影響[11]

利用跳臺實驗檢測各組模型大鼠行為學(xué)指標(biāo)，具體方法：將大鼠放于避光箱中適應(yīng)5min，通電（36V，3min），以受到電刺激作為錯誤反應(yīng)評判標(biāo)準(zhǔn)，記錄各組大鼠逃避潛伏期、3min內(nèi)錯誤次數(shù)。

2.4 鹿茸多肽對MCI模型大鼠血清中BDNF、NGF含量的影響

各組大鼠進(jìn)行腹主動脈取血，4℃低溫離心機(jī)離心（4000r·min-1，5min），取上層血清，備用。依照 ELISA 試劑盒內(nèi)說明檢測各組大鼠血清中BDNF、NGF含量。

2.6 鹿茸多肽對MCI模型大鼠海馬組織中BDNF、NGF表達(dá)水平的影響

將各組大鼠處死后，提取海馬組織-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。依照全蛋白提取試劑盒?nèi)說明提取各組大鼠海馬組織總蛋白，依照BCA蛋白濃度測定試劑盒內(nèi)說明調(diào)節(jié)樣品蛋白濃度（濃度為2g·L-1），加入2倍體積樣品緩沖液后水浴 （100℃，5min），冷卻后備用。依照SDS-PAGE凝膠制備試劑盒內(nèi)說明制備SDS-PAGE凝膠，在加樣孔中加入樣品 （20μL/孔），電泳（90V，30min；110V，60min），轉(zhuǎn)膜（100V，60min），洗滌 3 次后封閉（搖床60min），洗滌3次后封閉一抗（4℃過夜），洗滌3次后封閉二抗（搖床60min），洗滌3次后加入ECL發(fā)光液（孵育1min），取膜放置于凝膠成像儀中，記錄實驗結(jié)果，計算目標(biāo)蛋白表達(dá)水平（目標(biāo)蛋白表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值）。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 實驗結(jié)果

4.1 鹿茸多肽對MCI模型大鼠行為學(xué)指標(biāo)的影響

跳臺實驗結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組逃避潛伏期明顯升高 （P＜0.01）、3min內(nèi)錯誤次數(shù)明顯增多（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組逃避潛伏期明顯降低 （P＜0.05或P＜0.01），陽性對照組、鹿茸多肽高、中劑量組3min內(nèi)錯誤次數(shù)明顯減少（P＜0.01）。結(jié)果見表1。0.05， P＜0.01。

表 1 跳臺實驗結(jié)果（n=10，x±s）

4.2 鹿茸多肽對MCI模型大鼠血清中BDNF、NGF含量的影響

ELISA實驗結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組BDNF、NGF 含量均明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組血清中BDNF含量明顯增多（P＜0.01），NGF 含量明顯增多（P＜0.05 或P＜0.01）。 結(jié)果見表 2。

表 2 血清中 BDNF、NGF 含量比較（n=10，x±s）

4.3 鹿茸多肽對MCI模型大鼠海馬組織中BDNF、NGF表達(dá)水平的影響

Western Blot實驗結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組 BDNF、NGF表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組BDNF、NGF表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。 結(jié)果見表 3、圖1。

表 3 海馬組織中 BDNF、NGF 表達(dá)水平比較（n=10，x±s）

圖1 海馬組織中BDNF、NGF表達(dá)水平

5 結(jié)論

鹿茸為名貴中藥材，是吉林省道地藥材，資源極為豐富，在中醫(yī)腦病的治療方面具有悠久的歷史。明代李時珍在《本草綱目》中記載“鹿茸，生精補髓，養(yǎng)血益陽，強筋壯骨。治一切虛損，耳聾，目暗眩暈，虛痢”[12]。研究[13]表明，由大腦免疫系統(tǒng)引發(fā)的炎癥機(jī)制驅(qū)動了AD的惡化，也就是說MCI的發(fā)生與發(fā)展可能與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)息息相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，采用單側(cè)頸總動脈結(jié)扎法復(fù)制的MCI模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低，血清、海馬組織中BDNF、NGF含量及表達(dá)水平明顯降低；而陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組均有所改善，說明鹿茸多肽對單側(cè)頸總動脈結(jié)扎法復(fù)制的MCI模型大鼠具有保護(hù)作用，作用機(jī)制可能與調(diào)控模型大鼠血清、海馬組織中BDNF、NGF含量及表達(dá)水平有關(guān)。