周 佳 ，徐 巖 ，律廣富 ，韓 冬 ，趙昕彤 ，王晉冀 ，王亞杰 ，王 宇 ，黃曉巍 ,2

（1.長春中醫(yī)藥大學，長春130117；2.吉林省中藥生物大分子重點實驗室，長春130117）

近年來，隨著生活節(jié)奏的提速，生活水平的提高，由于人們飲食結構不合理、生活習慣不規(guī)律等因素導致的心腦血管疾病患病幾率連年上升[1]。冠狀動脈粥樣硬化引起的缺血性心臟病嚴重威脅了人類的身心健康。心臟依賴血液的灌注來維持正常的生理活動，當血液的灌注減少或停止時，會導致心肌組織缺血缺氧、心肌細胞代謝紊亂、心肌功能異常甚至死亡。鹿茸作為我國傳統滋補類中藥，在保護心肌損傷、促進骨折愈合、提高機體免疫力、延緩衰老、改善記憶力等多方面具有良好的效果[2]?！侗静萁浭琛酚涊d鹿茸入心包，入心經；現代研究表明，鹿茸是哺乳動物中唯一可以完全再生的器官，可用于改善心臟功能；已有研究表明，鹿茸多肽可明顯緩解阿霉素所致的大鼠心肌損傷[3]。目前鹿茸多肽對冠脈結扎所致大鼠心肌缺血損傷研究較少。本實驗從鹿茸多肽影響心肌特異性轉錄因子NK型同源盒基因轉錄因子2.5(NKx2.5)、鋅指蛋白轉錄因子4（GATA4）、激活轉錄因子 2（ATF-2）、肌細胞特異性增強因子-2C(MEF-2C)表達水平的角度出發(fā)，對鹿茸多肽預防和治療冠脈結扎大鼠心肌缺血的作用機制進行研究。

1 材料

1.1 實驗動物

標準Ⅱ導聯心電圖正常的Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質量（270±20）g，長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(吉)-2016-0003。常規(guī)飼養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)3d后用于實驗。

1.2 實驗藥物

鹿茸多肽：長春中醫(yī)藥大學提供；輔酶Q10膠囊：海上藥信誼藥廠有限公司 （國藥準字H19999132）；Nkx 2.5Elisa kit：上海酶聯生物科技有限公司（批號：ml2227618）；GATA4、ATF-2、MEF-2CElisa kit：酶免生物科技有限公司 （MM-20697R1、MM-0837R1、MM-0834R1）；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒：上海碧云天生物科技有限公司，貨號：C0105。

2 儀器

大鼠固定器、ML870PowerLab數據采集分析系統、Multiskan FC酶標儀、生物組織自動脫水機、生物組織自動包埋機。

3 實驗方法

3.1 動物分組及給藥

隨機將大鼠分成6組，即假手術組、模型組、陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組，每組10只。假手術組、模型組給予等體積蒸餾水，陽性對照組給予輔酶Q10膠囊3mg·kg-1，鹿茸多肽高、中、低劑量組大鼠分別給予鹿茸多肽 300、200、100mg·kg-1。 實驗動物自由飲食飲水，連續(xù)給藥28d。

3.2 模型復制

參照文獻[4]，大鼠稱重后，腹腔注射水合氯醛麻醉后結扎心臟左冠狀動脈前降支，對比大鼠術前術后心電圖，符合典型心梗表現者視為手術成功，存活者列入模型組、給藥組。假手術組僅開胸，不結扎冠狀動脈[5]。

3.3 檢測指標

3.3.1 心電檢測[6]

末次給藥30min后，乙醚麻醉大鼠，固定于大鼠固定器上，連接八通道生物信號采集處理系統，記錄2min內的大鼠心電圖和心率，心電圖基線設為PR段，比較各組心電圖ST段的變化和心率變化。

3.3.2 Elisa法檢測各組大鼠血清中 Nkx2.5、GATA4、ATF-2和MEF-2C含量

檢測心電30min后，4%水合氯醛麻醉大鼠，打開腹腔，腹主動脈取血[7]，靜置 20min，3 500r·min-1離心15 min，取血清，按照試劑盒說明書檢測大鼠血清中Nkx2.5、GATA4、ATF-2和 MEF-2C 的含量。

3.3.3 HE染色觀察大鼠心肌組織損傷情況

將固定后的心肌組織脫水、石蠟包埋，切成5μm薄片，HE染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)學變化[8]。

3.4 統計學方法

采用SPSS17.0統計分析軟件進行數據處理，計量資料均采用表示，多組均數組間比較采用單因素方差分析，顯著性水準P=0.05。

4 實驗結果

4.1 各組大鼠心率及心電圖ST段變化

與假手術組比較，模型組心率明顯上升、ST段明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組明顯降低，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01），結果見表1。

表1 各組大鼠心率及心電圖ST段變化（x±s）

4.2 各組大鼠血清中Nkx 2.5、GATA4、ATF-2和MEF-2C含量變化

與假手術組比較，模型組大鼠血清中Nkx 2.5、GATA4和MEF-2C含量顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組、鹿茸多肽高、中、低劑量組大鼠血清中Nkx 2.5、GATA4和MEF-2C含量顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01），其中鹿茸多肽低劑量組與陽性對照組比較，血清中Nkx 2.5和MEF-2C含量顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，各組大鼠血清中ATF-2含量無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05），結果見表 2。

表2 各組大鼠血清中Nkx 2.5、GATA4、ATF-2和MEF-2C 含量變化（x±s）（ng/L）

4.3 各組大鼠心肌組織病理學觀察

HE染色結果表明，假手術組大鼠心肌組織結構規(guī)則，紅色部分心肌組織排列整齊，細胞核大小、形態(tài)無明顯差別，清晰可見，心肌細胞間隙均勻，無炎性細胞浸潤。與假手術組比較，模型組組織壞死比例較高，心肌纖維排列紊亂并有溶解斷裂，核細胞深染，可見明顯炎性細胞浸潤，成纖維細胞增生明顯。隨著鹿茸多肽給藥劑量的增加，心肌細胞溶解減輕，心肌纖維排列較為整齊，細胞間隙變小，炎性細胞浸潤減少。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織HE染色結果（×200）

5 討論

據統計[9]，我國14億人口中約有2.9億人患有心血管疾病，城鄉(xiāng)居民死亡原因中，有40%以上是由于心血管病死亡，高于腫瘤等其他疾病。防治心血管病已經成為中國目前重大的公共衛(wèi)生問題，對心血管疾病的防治迫在眉睫[10]。

在探討藥物在治療心肌梗死的療效及作用機制中，復制相對精準的心肌梗死動物模型至關重要，本研究采用結扎大鼠左冠狀動脈前降支的方法復制心肌缺血的發(fā)生發(fā)展，可以保證梗死部位相對固定，在盡量避免個體差異的同時，提高模型動物的成活率，并最大限度地模擬臨床上心肌梗死的病理過程[11]。實驗結果表明，對比假手術組和模型組，大鼠心率和心電圖ST段的變化符合心肌缺血造模的各項指標，表明實驗造模成功[12]。

《神農本草經》中將鹿茸列為中品，中醫(yī)使用鹿茸防治各類疾病已有兩千余年的歷史[13]。現代藥理學研究表明，鹿茸中含有多種有效成分，其中多肽、蛋白質在鹿茸的藥用中占有重要的地位[14]。已有研究證實，鹿茸多肽能夠有效減少心肌梗死面積，使缺血區(qū)域血管收縮程度減輕，改善血液循環(huán)，從而減少心肌梗死后缺血缺氧對心肌細胞的損傷[15～16]。 Nkx2.5，GATA4，ATF-2，MEF-2C是心臟在早期發(fā)育過程中表達的轉錄因子[17]，起到調控心臟結構蛋白基因表達、促進細胞分化方向的作用，在心臟的發(fā)育過程中起著重要作用[18]。其中，Nkx2.5在環(huán)化、分化、間隔功能成熟、維持傳導系統等過程中參與了心臟的形成[19]；GATA4在心肌存活和心臟肥大中起重要作用；ATF-2、MEF-2C可以在自身維持、損傷修復等方面調控心臟特異性調控蛋白。

本研究以鹿茸多肽為研究對象，觀察其對冠脈結扎大鼠心肌損傷的修復作用。結果表明，鹿茸多肽可明顯保護冠脈結扎大鼠的心肌損傷，恢復心率，調整ST段上調幅度，其作用機制可能與提高Nkx 2.5、GATA4和MEF-2C的水平有關，而ATF-2無明顯變化。