曲笑鋒 ，于艷輝 ，唐曉桐 ，吳 萍 ，王雅儷 ，王明鑫 ，蔡秀華 ，趙伯友

（1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司，吉林省中藥標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長春130103；2.修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，通化134100）

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

丹七片，淺黃棕色薄膜衣片，批號：20180705，由修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)前研磨成粉，0.4%羧甲基纖維素鈉配置成混懸液，濃度分別為0.675、1.35、2.7 g/kg （相當(dāng)與臨床成人用量的 1、2、4 倍），4℃保存?zhèn)溆?；鹽酸腎上腺素注射液，購自天津金耀藥業(yè)有限公司，批號：1805201；復(fù)方丹參滴丸，棕色薄膜衣滴丸，批號171222，天士力制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，實(shí)驗(yàn)前配制成濃度含生藥0.1548g/kg混懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動物

SPF級Wistar大鼠180只，雌雄各半，體重200~220g，購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司。生產(chǎn)許可證編號：SCXK（吉）-2016-0003。

1.3 試劑

羧甲基纖維素鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20181009；醫(yī)用酒精：德州德新康消毒制品有限公司，批號：150809；肌酸激酶（CK）ELISA 檢測試劑盒，生產(chǎn)批號：JL21154；肌酸激酶同工酶（CK-MB）ELISA檢測試劑盒，生產(chǎn)批號：JL12296；Na+-K+-ATP酶ELISA檢測試劑盒，生產(chǎn)批號：JL11832；內(nèi)皮素-1（ET-1）ELISA 檢測試劑盒，生產(chǎn)批號：JL10931；一氧化氮（NO）ELISA檢測試劑盒，生產(chǎn)批號：JL13431。均購自上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司。

1.4 儀器

酶標(biāo)儀，廠家：Manufactured in China Designed in California USA，型號：SMP500-18272-LSIO；全自動血液流變儀，廠家：北京普利生儀器有限公司，型號：LBY-N6；電子天平，廠家：美國雙杰兄弟有限公司，型號：T1000。

1.5 方法[1]

1.5.1 分組給藥

取檢疫合格的Wistar大鼠60只，雌雄各半。隨機(jī)設(shè)立6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為空白對照組、模型對照組、復(fù)方丹參滴丸組（陽性組）以及丹七片高、中、低（2.7、1.35、0.675 g/kg/d）劑量組，每組10只大鼠，雌雄各半，給藥組給予相對應(yīng)藥物，模型對照組給予純化水，各組動物均每天灌胃給藥1次，給藥體積為10mL/kg。

1.5.2 模型制備

氣滯血瘀模型：給藥組連續(xù)給藥1周，除空白對照組外，其余各組分別于給藥0.5h后給予鉗尾刺激，每次維持10min，每隔2h鉗尾一次，一天4次，連續(xù)剌激一周。第2周于給藥半小時(shí)后行鉗尾刺激，每次維持10min，每隔1小時(shí)剌激1次，每天鉗尾8次，于第4次鉗尾之后皮下注射鹽酸腎上腺素0.8 mg/kg（與生理鹽水1∶3），間隔4小時(shí)后再次注射鹽酸腎上腺素，空白對照組注射生理鹽水，如此連續(xù)刺激1周[2]。

氣虛血瘀模型[3～4]：給藥組連續(xù)給藥1周，除空白對照組外，其余各組每日游泳至力竭(以頭沉入水中5～10s為準(zhǔn))連續(xù)7d制備氣虛血瘀模型?？瞻讓φ战M從實(shí)驗(yàn)開始至結(jié)束正常飲水、喂食。各組動物在實(shí)驗(yàn)第7 d下午禁食不禁水12 h，第8 d上午，除空白對照組外，其余各組均皮下注射鹽酸腎上腺素注射液(0.8 mg/kg)制備模型，注射1 h后開始取材。

寒凝血瘀模型[5～6]：將碎冰放入水深 15～20 cm 內(nèi)壁光滑的塑料圓桶中，待冰水溫度至0～1℃，除空白對照組外，將各組大鼠放入圓桶，10 min后，將全身僵直大鼠取出。每天冰水浴后給予鼠糧正常飼養(yǎng)，各組大鼠每天按照上述造模方法造模，連續(xù)造模10d。實(shí)驗(yàn)開始1~5d只造模不給藥，5~10d給藥組給予相對應(yīng)藥物。

1.5.3 檢測指標(biāo)

檢測時(shí)間：試驗(yàn)結(jié)束解剖當(dāng)天；

檢測動物：各組待解剖動物；

采血方法：樣本采集前所有動物禁食至少12小時(shí)但不禁水。經(jīng)1.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉 （腹腔注射1.5mL/kg）后自腹主動脈采血約3.0 mL用于血流變學(xué)檢測，約2mL用于血清生化學(xué)指標(biāo)檢測。

血樣處理方法：血流變學(xué)檢測將血液置于枸櫞酸鈉抗凝管，立即檢測；血清生化學(xué)指標(biāo)檢測將血液3000r/min離心10min，取上清液置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

具體檢測指標(biāo)：全血黏度（低切、高切）；ELISA法檢測血清中肌酸激酶 （CK）、肌酸激酶同工酶 （CKMB）、鈉-鉀-三磷酸腺苷酶（Na+-K+-ATP）、內(nèi)皮素（ET-1）和一氧化氮（NO）。

1.5.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)數(shù)資料組間比較采用t檢驗(yàn)分析法，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 動物一般狀態(tài)觀察

三種血瘀模型動物造模前，各組大鼠發(fā)育正常，皮毛有光澤，無脫毛等現(xiàn)象；自主活動正常；大小便無異常；攝食、飲水正常；對外界刺激反應(yīng)靈敏。表明所選Wistar大鼠符合實(shí)驗(yàn)要求。

造模后，均出現(xiàn)皮毛無光澤，豎毛，脫毛，以及不同程度稀便現(xiàn)象，以模型對照組最為嚴(yán)重，并且氣滯血瘀模型中，除空白對照組外其余各組大鼠存在不同程度廝打所致傷痕。陽性組、丹七片高、中劑量組體質(zhì)量下降不明顯，一般狀態(tài)良好，其次為丹七片低劑量組。

2.2 丹七片對三種血瘀模型大鼠血流變學(xué)的影響

三種血瘀模型對照組與空白對照組比較，全血黏度（低切、高切）均有明顯差異（P<0.05，P<0.01）。氣滯血瘀模型陽性組、丹七片高、低劑量組與模型對照組比較全血黏度（高切）均有明顯差異（P<0.05）；氣虛血瘀模型與模型對照組比較，丹七片高劑量組全血黏度 （低切、高切）有明顯差異（P<0.05），陽性組全血黏度（高切）有明顯差異（P<0.05）；寒凝血瘀模型陽性組、丹七片高劑量組與模型對照組比較全血黏度（低切、高切）均有明顯差異（P<0.05），丹七片中、低劑量組與模型對照組比較全血黏度（低切）均有明顯差異（P<0.05），詳見表1。

2.3 丹七片對三種血瘀模型大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的影響

2.3.1 氣滯血瘀模型

模型對照組與空白對照組比較，各項(xiàng)指標(biāo)均有極明顯差異（P<0.01，P<0.001）；與模型對照組比較，陽性組、丹七片高劑量組NO、Na+-K+-ATP含量明顯升高（P<0.05），CK、CK-MB、ET-1 含量均明顯降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001），丹七片中劑量組除 NO、Na+-K+-ATP外其余各項(xiàng)指標(biāo)均有明顯降低 （P<0.05，P<0.01，P<0.001），Na+-K+-ATP 含量有明顯升高（P<0.05），丹七片低劑量組CK、CK-MB含量均明顯降低 （P<0.05，P<0.01），詳見表 2。

表2 丹七片對大鼠氣滯血瘀模型相關(guān)指標(biāo)的影響（x±SD）

2.3.2 氣虛血瘀模型

模型對照組與空白對照組比較各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著差異（P<0.01，P<0.001）；與模型對照組比較，陽性組各項(xiàng)指標(biāo)均有明顯差異（P<0.05，P<0.01，P<0.001），丹七片高、中、低劑量組除NO外各項(xiàng)指標(biāo)均有不同程度升高或降低， 且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05，P<0.01，P<0.001），詳見表 3。

表3 丹七片對大鼠氣虛血瘀模型相關(guān)指標(biāo)的影響（x±SD）

2.3.3 寒凝血瘀模型

模型對照組與空白對照組比較，各項(xiàng)指標(biāo)均有明顯差異（P<0.01，P<0.001）；陽性組與模型對照組比較，除ET-1外，其余各項(xiàng)指標(biāo)均有明顯差異（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；丹七片高劑量組與模型對照組比較，各項(xiàng)指標(biāo)均有明顯差異（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；丹七片中劑量組與模型對照組比較，NO含量明顯升高（P<0.01），CK、CK-MB 含量均明顯降低（P<0.05，P<0.001）；丹七片低劑量組與模型對照組比較，NO含量有明顯升高（P<0.05，P<0.01），CK 含量明顯降低（P<0.001），詳見表4。

表4 丹七片對大鼠寒凝血瘀模型相關(guān)指標(biāo)的影響（x±SD）

3 討論

CK是一種與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶。CK活性測定可以用于骨骼肌疾病及心肌疾病的診斷。CK-MB在臨床診斷中也有十分重要的意義，在各種病變包括肌肉萎縮和心肌梗塞發(fā)生時(shí)，人血清中CK水平迅速提高，認(rèn)為在心肌梗塞的診斷中測定CK的活性比做心電圖更為可靠，其中CK的同工酶CK-MB診斷的特異性最高。

血瘀證是臨床常見的病癥，其發(fā)病是由于多種致瘀因素導(dǎo)致血行緩慢、脈道壅塞而致。根據(jù)致病因素不同，可分為寒凝血瘀、氣滯血瘀、氣虛血瘀等類型，病變可累及心、腦、肺、腎、肝、生殖等多個(gè)系統(tǒng)，輕者可影響患者的日常生活，重則危及患者生命[7]。因此，對血瘀證及活血化瘀藥物的相關(guān)研究是中醫(yī)臨床與理論研究中最受國內(nèi)外關(guān)注的領(lǐng)域之一[8]，對降低由于血瘀引起的各類病癥諸如心腦血管疾病的發(fā)生率和死亡率具有重大意義。血瘀證由于病因不同，其處方用藥也不盡相同，因此對血瘀證不同證型的研究，更具臨床意義。本研究以此為出發(fā)點(diǎn)，意在探究丹七片對不同血瘀證的治療作用，明確其療效，為臨床用藥提供保障。根據(jù)中醫(yī)學(xué)“氣溫則血滑，氣寒則血凝”、“氣結(jié)則血凝”、“氣虛則血瘀”等病因理論，本實(shí)驗(yàn)采用持續(xù)性鉗尾刺激、游泳力竭以及冰浴聯(lián)合腎上腺素注射復(fù)合因素制備三種血瘀的大鼠模型。結(jié)果顯示，造模后模型組大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量明顯減輕、懶散倦怠、毛色枯黃、稀便等血瘀的證候，符合中醫(yī)學(xué)宏觀指標(biāo)。同時(shí)通過血流變學(xué)檢測全血黏度的增高，也提示了血瘀模型微觀指標(biāo)的出現(xiàn)[9]。

丹七片為理血劑，具有活血化瘀，通脈止痛之功效。用于瘀血閉阻所致的胸痹心痛，眩暈頭痛，經(jīng)期腹痛。方中以丹參微寒，活血養(yǎng)血，化瘀通脈；三七性溫，活血止血，祛瘀定痛。二者合用可增加冠狀動脈血流量；改善心肌收縮力，調(diào)整心率，調(diào)節(jié)血壓；改善微循環(huán)系統(tǒng)，抑制血小板凝聚；降低血漿粘稠度，增加纖維蛋白溶解，是治療心脈瘀阻、胸痹絞痛的良藥[10～12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹七片給藥組可降低三種血瘀模型的全血黏度（高切、低切），以高劑量組效果最為顯著可能與抑制紅細(xì)胞變形性等因素有關(guān)[13]。與空白對照組比較，模型對照組三種血瘀模型的各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著升高或降低。與模型對照組比較，三種血瘀模型丹七片高劑量組的各項(xiàng)指標(biāo)均有明顯升高或降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）； 丹七片中、 低劑量組 CK、CK-MB等主要指標(biāo)有明顯升高或降低 （P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。本研究獲得結(jié)論：丹七片能夠降低氣滯、氣虛、寒凝血瘀模型大鼠的全血黏度，并可通過調(diào)節(jié)CK、CK-MB、Na+-K+-ATP等相關(guān)指標(biāo)抑制三種血瘀的發(fā)生和發(fā)展，為丹七片的臨床用藥提供理論保障。