廖啟超 張弦 郝澍

摘 要：將丁香干粉提取成石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相，通過對實驗小鼠進行高脂飲食飼養(yǎng)建立模型，再利用原代脾細胞培養(yǎng)對高脂模型中各種丁香有效成分對免疫細胞的保護效果進行篩選，選擇出對抗高脂類的主要活性成分，觀察丁香有效成分對高脂小鼠脾細胞活性、MDA和T-SOD水平及血清中細胞因子IL-2的影響。結(jié)果表明，丁香中提取出的石油醚相和乙酸乙酯相均可以提高高脂小鼠總膽固醇值，而且還可以增強高脂小鼠脾細胞的抗氧化能力和IL-2的水平。

關(guān)鍵詞：丁香;高脂;抗氧化;脾細胞;免疫

中圖分類號 R285.5文獻標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）23-0018-04

1 引言

丁香（別名公丁香），為桃金娘科植物丁香（Eugenia caryophyllata Thunb）的干燥花蕾，是國家公布的藥食兩用植物。自20世紀60年代以來，丁香的藥理作用和化學(xué)成分已被廣泛研究證實，它具有保肝、止瀉、解毒、抑菌殺蟲等作用[1]，有巨大的開發(fā)潛力和研究價值。本實驗室先前對國家公布的87種藥食兩用植物進行了篩選，證實了丁香的抗氧化活性最強[2]。

丁香有效成分分為揮發(fā)性和非揮發(fā)性2種成分。相關(guān)研究顯示[3，4]，揮發(fā)油性成分含有萜烯類、酸、醇、醛、酯、酚等物質(zhì)，經(jīng)GS-MC分析，主要包括23種化學(xué)成分，其中含量最高的是丁香酚（62.21%）[5]，其功能活性已被充分研究開發(fā)。丁香的非揮發(fā)性成分的研究相對較少，但春[6]用乙醇提取丁香，從提取液中分離純化出34個化合物，并運用質(zhì)譜、紅外光譜、紫外光譜以及核磁共振等現(xiàn)代光譜學(xué)技術(shù)闡明了其結(jié)構(gòu)，其中有11個黃酮及其苷、7個三萜、3個鞣質(zhì)、2個酚苷、2個色酮苷、2個神經(jīng)酰胺，另外還有β-谷甾醇、胡蘿卜苷、對羥基-反式肉桂酸、香草酸、阿魏醛、對羥基苯乙酮以及5-羥甲基糠醛。最新研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)丁香非揮發(fā)性成分同樣具有較強的抗氧化活性，國外的研究者則發(fā)現(xiàn)丁香中的水相和乙醇相均可以降低小鼠巨噬細胞中NO的產(chǎn)量，同時抑制LPS刺激后IL-1β、IL-6、IL-10的分泌[7，8]。Hemalatha等[9]采用丙酮、氯仿或甲醇等不同溶劑提取丁香非油類成分，發(fā)現(xiàn)甲醇提取物抑制DPPH自由基清除活性最強。張小霞[10]發(fā)現(xiàn)在丁香非油類成分中乙酸乙酯相對LDL氧化抑制作用最強，且抑制作用與濃度成正相關(guān)。但是，丁香不同極性部位在抑制肝損傷所致氧化應(yīng)激的差異還尚不清楚，且鮮有將揮發(fā)性與非揮發(fā)性物質(zhì)的活性進行比較的研究。

2 材料與方法

2.1 丁香有效成分的提取 公丁香，購于江西黃慶仁棧九江華氏大藥房，由江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司分裝，產(chǎn)自廣西。產(chǎn)品批號1509006，生產(chǎn)日期2015年9月30日。材料先進行機械粉碎，再過40目篩后放置于冰箱。采用圖1所示方法提取丁香有效成分。量取1/10提取液制備丁香粗提物。剩余9/10提取液濃縮后加入適量蒸餾水混懸后，分別利用溶劑極性逐漸增大的溶劑石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，和剩水相共4個極性分別濃縮，與上述粗提物濃縮液一起凍干后獲得干粉，置真空干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 建立高脂模型小鼠 清潔級小鼠（18.5±0.54g，6周齡，雌雄各半），購于南昌大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于標(biāo)準塑料鼠籠（30×20×13cm3），放置于12h明暗交替、溫度（22±2℃）、濕度50%的普通無特定病原菌動物房。小鼠適應(yīng)1周后隨機分成5組，每組10只。整個實驗期間小鼠自由飲水和攝取日糧，每周稱重1次?；A(chǔ)日糧和高脂日糧購自北京華阜康生物科技股份有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2009-0008]。高脂日糧配方：基礎(chǔ)日糧中添加 20.0%蔗糖、15%豬油、1.2%膽固醇和 0.2%膽酸鈉。每日觀察小鼠的健康狀況，包括精神、食欲和墊料更換情況等。第60天，眼球采血，一部分血液保存于離心管中，37℃，2h后，3000rpm離心10min，獲得血清。將血清保存于-20℃。采完血后，頸椎脫臼處死小鼠。

2.3 培養(yǎng)原代小鼠脾細胞 脾臟從小鼠體內(nèi)分離并無菌收集放置在磷酸鹽緩沖液中（PBS，0.1M磷酸鹽緩沖液，0.85% NaCl，pH7.2）。通過輕輕的壓脾臟通過不銹鋼絲網(wǎng)空隙大小為100μM來懸浮單細胞。用5mL無菌的PBS洗和重懸細胞，然后用5mL的淋巴分離液分層。通過離心（2，000×g）15min在18℃來得到脾淋巴細胞。收集接觸面的細胞，重懸和用8mL的細胞培養(yǎng)液洗2次。細胞懸浮在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，均加入刺激劑植物血凝素（PHA）調(diào)整刺激劑的終濃度為80ng/mL。脾臟淋巴細胞的密度為1.5×106cells/mL。測定新分離細胞的活力在95%以上。最后將培養(yǎng)板置于40.5℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60h。

2.4 ELISA法測定高脂小鼠總膽固醇 收集血液待凝固后，取血清，用ELISA法測定小鼠總膽固醇（TC）值。相關(guān)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2.5 MTT測定細胞活力 在96孔細胞培養(yǎng)板中，加入細胞培養(yǎng)液200μL，待細胞貼壁后，更換成5%FBS的RPMI培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，56h后于各管中加入20μL5mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清，加入200μL的DMSO后，置于酶標(biāo)儀上測定OD490nm。每個處理組4個重復(fù)。

2.6 脾細胞抗氧化能力的測定

2.6.1 總超氧化物歧化酶（T-SOD）的測定 細胞培養(yǎng)結(jié)束后，移至1.5mL離心管中，于低溫離心機4000rpm離心10min，棄去上清液，PBS重復(fù)洗滌2次，加入細胞裂解液，輕輕吹打后4000rpm離心15min。吸取上清液轉(zhuǎn)移至EP管中，得到細胞提取液，應(yīng)用南京建成生物科技有限公司總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒（羥胺法）測定。

2.6.2 還原性谷胱甘肽（GSH）的測定 細胞培養(yǎng)結(jié)束后，移至1.5mL離心管中，于低溫離心機4000rpm離心10min，棄去上清液，PBS重復(fù)洗滌2次，加入細胞裂解液，輕輕吹打后4000rpm離心15min。吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，得到細胞提取液，應(yīng)用南京建成生物科技有限公司還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（分光光度法）測定。

2.7 血清中細胞因子的表達檢測 收集血液待凝固后，取上層血清吸出，用ELISA法測定IL-2，相關(guān)試劑盒購自R&D Systems。具體操作步驟詳見試劑盒。

3 結(jié)果與分析

3.1 丁香有效成分的提取優(yōu)化 丁香有效成分的提取結(jié)果如下，得率從大到小依次分別是：丁香正己烷相（17.41%）>丁香乙酸乙酯相（5.9%）>丁香正丁醇相（4.76%）>丁香水相（4.58%）。

3.2 對高脂小鼠總膽固醇的影響 由圖2可得，高脂組的TC值與對照組相比極為顯著（P<0.01），而加入石油醚相或乙酸乙酯相后，TC值顯著降低且與高脂組對比差異極顯著（P<0.01），而在加入正丁醇相后，TC值有所降低且與高脂組對比差異顯著（P<0.05），在入水相后，TC值略有降低但不具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，高脂小鼠模型建立成功。

（*表示與對照組對比差異顯著，P<0.05，**表示與對照組對比差異極顯著，P<0.01;#表示與高脂組對比差異顯著，P<0.05，##表示與高脂組對比差異極顯著，P<0.01;下同）

3.3 對高脂小鼠脾細胞活力的影響 由圖3可得，與正常對照組相比，高脂飲食組小鼠的脾細胞活力顯著降低（P<0.05），在加入丁香中提取出的石油醚相后小鼠脾細胞活力則有顯著差異（P<0.05），加入乙酸乙酯相后小鼠脾細胞活力也有顯著升高，而加入正丁醇相或水相后小鼠脾細胞活力均有提升但無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.4 對高脂小鼠脾細胞抗氧化能力的影響 由圖4可得，與正常對照組相比，高脂飲食組小鼠的脾細胞抗氧化能力顯著降低（P<0.05）。GSH的測定，在加入公丁香中提取出的水相成分后，測試效果依舊與對照組對比差異顯著（P<0.05），而在加入石油醚相或乙酸乙酯相后則與高脂飲食組測試結(jié)果對比差異顯著（P<0.05），加入正丁醇相則有提升但無統(tǒng)計學(xué)意義。T-SOD的測定，在加入公丁香中提取出的水相或正丁醇相后測試效果仍與對照組具有顯著差異（P<0.05），而在加入乙酸乙酯相后對比差異顯著（P<0.05），加入石油醚相則有提升但無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.5 對高脂小鼠血清中細胞因子IL-2的影響 由圖5可得，與正常對照組相比，高脂飲食組血清中細胞因子IL-2的含量對比差異顯著（P<0.05），且在加入公丁香中提取出的正丁醇相或水相依舊與對照組對比差異顯著（P<0.05），而在加入石油醚相或乙酸乙酯相后可發(fā)現(xiàn)測試結(jié)果與高脂飲食組對比差異顯著（P<0.05）。

4 討論

研究表明，無論是體液的還是細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)都依賴于輔助性細胞的激活，這個過程嚴格的依賴于細胞所處的氧化還原微環(huán)境[12]。還原性的微環(huán)境可能是為了防止細胞在激活的過程中遭受氧化應(yīng)激損傷。不同亞型的細胞具有不同的氧化還原水平，對于外界應(yīng)激的敏感性也不同，因此能夠調(diào)節(jié)多種狀態(tài)下免疫反應(yīng)。細胞外部的氧化還原環(huán)境可以通過多種方式與細胞內(nèi)部的氧化還原分子相互作用。如果長時間暴露于大量的環(huán)境中，則會超越細胞自身抗氧化系統(tǒng)的耐受能力進而造成氧化應(yīng)激，影響細胞功能，甚至導(dǎo)致細胞的凋亡[13]。氧化還原環(huán)境同樣也會影響細胞的分化作用?？傊?，氧化還原調(diào)節(jié)作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)的手段可以應(yīng)用到多種疾病的治療過程中，長期高脂膳食可誘發(fā)大量的產(chǎn)生并累積，進而導(dǎo)致氧化應(yīng)激，而補充具有清除自由基的功能因子可以顯著改善長期高脂膳食誘導(dǎo)的免疫功能損傷。用天然的抗氧化劑干預(yù)則可以通過清除自由基來防止細胞損傷的形成。因此本課題組在前期實驗基礎(chǔ)上，選擇使用丁香作為實驗原料。根據(jù)試驗結(jié)果可以得知，高脂膳食可以減低小鼠脾細胞的細胞活力，降低T細胞分泌白介素-2（IL-2）的能力。IL-2的產(chǎn)量常常被認為是體外試驗中測定T細胞功能的評判標(biāo)準。而丁香的石油醚相和乙酸乙酯相均可以拮抗高脂降低的細胞活力和分泌IL-2的能力，同時也可以提高脾細胞的抗氧化能力（反映在T-SOD和GSH的指標(biāo)上）。丁香的石油醚相主要成分為丁香酚，是目前丁香作為藥材的主要功能分子，而丁香的乙酸乙酯相含有最多的總黃酮，而黃酮類成分具有良好的抗氧劑活性，因此丁香的石油醚相和乙酸乙酯相均具有拮抗高脂降低脾細胞功能的作用。因此我們推測，石油醚相和乙酸乙酯相可能是通過提高細胞的抗氧化能力，從而增強脾細胞的免疫功能。

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（責(zé)編：王慧晴）