梁鰍雙 ，劉明 ，陶現(xiàn)明 ，劉凡 ，曾發(fā)明 ，李彩霞 ，趙雯婷

（1.公安部物證鑒定中心 現(xiàn)場物證溯源技術(shù)國家工程實驗室 法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點實驗室 北京市現(xiàn)場物證檢驗工程技術(shù)研究中心，北京 100038；2.廣西玉林市公安局，廣西 玉林 537000；3.昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；4.中國科學(xué)院北京基因組研究所 中國科學(xué)院精準(zhǔn)基因組醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100101）

色素表型主要包括眼睛（虹膜）顏色、發(fā)色、膚色等，是一種具有顯著人群差異性的外貌特征。根據(jù)法醫(yī)人類學(xué)研究[1]，東亞黃種人（蒙古人種）的眼睛顏色多呈深褐色或黑色，頭發(fā)多為黑色，膚色在黃色的基礎(chǔ)上存在深淺差異。歐洲白種人（高加索人種）的色素特征個體差異較大，頭發(fā)包括淺金色、棕色、紅色和黑色等，眼睛顏色包括藍(lán)色、綠色、棕色等，膚色存在從極淺到較深的變化。非洲黑種人（尼格羅人種）的色素特征最為單一，眼睛顏色多為黑褐色，頭發(fā)為黑色，膚色多呈黑色和深褐色。過渡人種同時具有兩種及以上人種的色素特征。色素特征受到遺傳背景、環(huán)境選擇等多重影響[2]，如人群的膚色特征具有明顯的地理分布差異，與紫外線照射強度相關(guān)，距離赤道越遠(yuǎn)的人群膚色越淺[3-4]。

在法庭科學(xué)領(lǐng)域，色素表型不僅被用于法醫(yī)人類學(xué)人種判別，也是法醫(yī)遺傳學(xué)推斷現(xiàn)場生物物證DNA來源人外貌特征的重要組成信息[5-7]。色素特征的遺傳推斷研究主要基于單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）。2010年，通過對歐洲人群的遺傳研究，荷蘭的Kayser實驗室研發(fā)了由6個SNP位點構(gòu)成的IrisPlex眼睛顏色推斷體系[8]。隨后，他們在此基礎(chǔ)上添加了18個頭發(fā)顏色相關(guān)位點，構(gòu)建了包含24個SNP位點的HIrisPlex眼睛及頭發(fā)顏色推斷體系[9]。通過對全球59個人群的膚色遺傳學(xué)研究[10]，CHAITANYA等[11]在2018年又建立了基于41個SNP位點的HIrisPlex-S系統(tǒng)，在HIrisPlex系統(tǒng)中添加了ANKRD11、OCA2、SLC24A4等7個膚色相關(guān)基因中的17個SNP位點，可實現(xiàn)對三類眼睛顏色、四類頭發(fā)顏色和五類皮膚顏色的推斷。這三個色素表型體系在歐美人群中表現(xiàn)出很高的推斷準(zhǔn)確性[12-16]。國際上針對東亞人群尤其是中國人群的色素遺傳研究較少。

中國人群絕大多數(shù)屬于蒙古人種。按照語系劃分，分屬漢藏、阿爾泰、印歐、南亞、侗臺、苗瑤、南島語系[17]，各語系人群呈現(xiàn)出地域分布和色素特征的差異。已有研究[18]表明，東亞人群的遺傳結(jié)構(gòu)與語系分布具有對應(yīng)關(guān)系。本研究利用HIrisPlex-S體系，對分布在中國7大地理區(qū)域的6個語系的17個人群進(jìn)行眼睛、頭發(fā)、皮膚顏色相關(guān)SNP位點的分型檢驗和表型推斷分析，旨在為我國法醫(yī)人類學(xué)提供各語系人群的色素表型參考數(shù)據(jù)，并為法醫(yī)遺傳學(xué)的外貌推斷技術(shù)提供人群及色素表型的劃分依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究人群

中國漢族（廣東、河北、四川）、哈薩克族、蒙古族等共17個人群2666份男性DNA樣本，生物樣本來源于公安部物證鑒定中心國家科技資源共享服務(wù)平臺計劃項目（YCZYPT[2017]01-3）的人群樣本庫，所有志愿者均依照公安部物證鑒定中心倫理委員會規(guī)定簽署知情同意書。2666份樣本的人群和語系等信息見表1。

17個人群樣本分屬六大語系七大地理區(qū)域：西北地區(qū)印歐語系的塔吉克族、阿爾泰語系的維吾爾族、哈薩克族；東北地區(qū)阿爾泰語系的蒙古族、錫伯族；華南地區(qū)苗瑤語系的苗族、瑤族，侗臺語系的侗族、壯族以及漢藏語系的廣東漢族；華東地區(qū)苗瑤語系的畬族；華北地區(qū)漢藏語系的河北漢族；西南地區(qū)漢藏語系的四川漢族、藏族、彝族以及南亞語系的佤族。

表1 17個人群的樣本信息

1.2 DNA提取、定量

采用QIAamp DNA Blood Mini試劑盒（德國Qiagen公司）提取DNA，使用NanoDrop 2000c分光光度計（美國Thermo Scientific公司）進(jìn)行DNA定量。以去離子滅菌水調(diào)整DNA質(zhì)量濃度至5ng/μL。

1.3 HIrisPlex-S復(fù)合體系的構(gòu)建

根據(jù)已報道的引物序列和體系構(gòu)建方法[11，19]，在實驗室構(gòu)建HIrisPlex-S復(fù)合擴增體系用于DNA樣本的分型檢驗。41個SNP位點分為24和17兩個體系（圖1），其中S1-EX、S3-EX、S4-EX、S10-EX、S21-EX、S22-EX、S24-EX共7個位點的延伸引物改變了多聚t數(shù)目。

圖1 HIrisPlex-S的41個SNP位點基因分型圖譜

1.4 人群樣本的DNA分型檢測

PCR擴增使用ABI PRISM?SNaPshotTMMultiplex試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），5 μL反應(yīng)體系包含：10×PCR緩沖液（15mmol/L Mg2+）0.5μL、MgCl2（25 mmol/L Mg2+） 0.7 μL、dNTP（10 mmol/L）0.05 μL、PCR 引物混合物 0.5 μL、HotstarTaq plus（5 U/μL）（德國 Qiagen 公司） 0.2 μL、DNA（5 ng/μL）2 μL、ddH2O 1.05 μL。在 96 孔 PCR 儀 Mastercycler Pro Eppendorf?熱循環(huán)儀（德國Eppendorf公司）上進(jìn)行熱循環(huán)實驗，條件為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃30s，72℃ 1min，40個循環(huán)；72℃ 10min。PCR擴增結(jié)束后，將核酸外切酶Ⅰ（Exo Ⅰ）（10U/μL）0.2μL、蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP；美國 Affymetrix公司）（1 U/μL） 1 μL、10×SAP 緩沖液0.3μL、去離子水1.5μL加入2μL PCR產(chǎn)物中。將混合物37℃孵育30 min，96℃酶純化10 min，去除過量引物和未結(jié)合脫氧核苷酸。

純化后的產(chǎn)物進(jìn)行延伸反應(yīng)，在5 μL反應(yīng)體系下，用單堿基延伸（single base extension，SBE）實現(xiàn)SNP基因座的微測序。包括2.5 μL的反應(yīng)混合物、1.5 μL純化PCR純化產(chǎn)物、0.3 μL SBE引物混合物、0.7 μL ddH2O。熱循環(huán)參數(shù)：96 ℃ 2 min；50℃ 5 s，60℃ 30 s，25個循環(huán)。延伸產(chǎn)物需經(jīng)SAP純化。用0.5 μL SAP在37℃孵育60 min，再用75℃的酶滅活15min，滅活過量熒光標(biāo)記的dNTPs。

V（內(nèi)標(biāo)LIZ 120）∶V（甲酰胺）為30∶1000的混合液9μL與1μL的DNA產(chǎn)物混合，在3130xl基因分析儀（美國AB公司）上進(jìn)行電泳，結(jié)果采用GeneMapper?IDv3.2軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行基因分型。分型圖譜如圖1所示。采用Modified-PowerStates軟件[20]計算Hardy-Weinberg平衡檢驗。

1.5 色素表型在線推斷

將檢測出的SNP分型按照色素表型在線推斷模型（https://HIrisPlex.erasmusmc.nl/）要求的格式整理上傳，計算后得到每個樣本眼睛顏色（藍(lán)色、中間色、棕色）、頭發(fā)顏色（紅色、金色、棕色、黑色）、膚色（極白色、白色、中等色、深色、較黑-黑色）的概率。參照推斷模型使用說明及相關(guān)文獻(xiàn)[9，11，21]，對眼睛、頭發(fā)顏色、膚色進(jìn)行判讀。

眼睛顏色推斷：輸入分型后，模型會對每個樣本輸出3種眼睛顏色概率數(shù)據(jù)（P值）。選取P值最大的表型為推斷結(jié)果。

頭發(fā)顏色推斷：輸入分型后，模型會對每個樣本輸出4種頭發(fā)顏色概率數(shù)據(jù)（P值）和頭發(fā)深淺概率數(shù)據(jù)（P值）。使用分步推斷法，綜合4種顏色中的最大P值和顏色深淺P值進(jìn)行判讀。

皮膚顏色推斷：輸入分型后，模型會對每個樣本輸出5種皮膚顏色的概率數(shù)據(jù)（P值）。膚色顏色判讀比較復(fù)雜，需要使用分步推斷法，綜合較大的前兩位膚色P值進(jìn)行綜合推斷。一般來說，當(dāng)?shù)诙籔值膚色比第一位P值膚色更深時，會對結(jié)果產(chǎn)生影響；第二位P值膚色較淺時不對第一位P值膚色產(chǎn)生影響。對于中等及更淺的膚色，第二位P值是否大于0.15也會對判讀結(jié)果有影響。

采用SPSS 17.0軟件分別對阿圖什和伊寧的維吾爾族頭發(fā)顏色以及對于不同人群、語系、地域的皮膚顏色進(jìn)行χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.01。

2 結(jié) 果

2.1 眼睛顏色的推斷結(jié)果

運用自主構(gòu)建的HIrisPlex-S復(fù)合擴增體系檢測2666份樣本。41個SNP位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），共獲得109 306個SNP位點的分型結(jié)果，上傳至HIrisPlex-S在線推斷模型。參照色素表型分類標(biāo)準(zhǔn)對輸出的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析判讀，獲得所有個體的色素表型推斷結(jié)果。從眼睛顏色的推斷結(jié)果（表2）來看：印歐語系和阿爾泰語系突厥語族的4個亞歐混合人群（塔吉克族、阿圖什維吾爾族、伊寧維吾爾族和哈薩克族）有18個藍(lán)色眼睛的個體，占1.917%；其他人群眼睛均為棕色，沒有表型差異。

表2 眼睛顏色表型推斷結(jié)果 （例）

2.2 頭發(fā)顏色的推斷結(jié)果

從頭發(fā)顏色的推斷結(jié)果（表3）來看，只有亞歐混合人群具有頭發(fā)顏色表型多樣性，除了蒙古族人群有2個深棕色-黑色頭發(fā)個體，其他人群的頭發(fā)顏色均為黑色。從圖2可以看出4個亞歐混合人群的頭發(fā)顏色分類比例。塔吉克族黑色頭發(fā)個體最少，約占41.414%，棕色、深棕色（包括深棕色-黑色和棕色-深棕色兩類）約占57.576%，金色、深金色約占1.010%；阿圖什維吾爾族黑色頭發(fā)約占75.758%，棕色、深棕色約占24.242%；伊寧維吾爾族黑色頭發(fā)約占72.052%，棕色、深棕約占27.948%；哈薩克族黑色頭發(fā)個體最多，約占84.615%，棕色、深棕色約占14.835%，金色、深金色約占0.549%。南疆（阿圖什）和北疆（伊寧）的維吾爾族人群頭發(fā)顏色表型分類沒有差異（χ2=0.819，P=0.366）。

圖2 4個亞歐混合人群的頭發(fā)顏色分類比例

表3 頭發(fā)顏色表型預(yù)測分類結(jié)果 （例）

2.3 皮膚顏色的推斷結(jié)果

從皮膚顏色推斷結(jié)果（表4）來看，中國不同人群的膚色具有明顯的表型多樣性（圖3），塔吉克族、阿圖什維吾爾族、伊寧維吾爾族、哈薩克族有白色至中等偏淺膚色個體，其他各人群自中等膚色至較黑-黑膚色個體均有一定的分布比例。結(jié)果呈現(xiàn)出顯著的人群、語系和地域的差異分布（P＜0.01）。

在本研究的2 666個樣本中，白膚色個體共有5例，來自塔吉克族和伊寧維吾爾族。從17個人群的膚色分類比例柱狀圖來看（圖3A），只有4個亞歐混合人群存在淺膚色（白+中等偏淺膚色）個體，且呈現(xiàn)出典型的混合人群特點：各類皮膚顏色的個體都占有一定比例，分布較為平均。苗、畬、瑤、侗、壯族及不同地區(qū)的3個漢族人群都以中等+中等偏深膚色為主，占人群總數(shù)的56.768%，深膚色占比較低。藏、彝、佤族人群膚色較深，以較黑-黑膚色為主；其中佤族的較黑-黑膚色比例占到57.426%。蒙古族人群中等+中等偏深、深+深-較黑膚色和較黑-黑膚色人群為38.519%、30.000%和31.481%，約各占1/3；錫伯族人群膚色分布比例與蒙古族相似，但中等膚色比例略高，為49.444%。

從語系和地理分布上來看（圖3B、3C），西北地區(qū)的印歐語系白+中等偏淺膚色個體最多（9.091%），較黑-黑膚色個體比例與淺膚色相近（11.448%）；同屬西北地區(qū)亞歐混合人群的阿爾泰語系突厥語族有少數(shù)淺膚色個體（5.296%），膚色整體更深，與印歐語系之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=19.437，P=0.002）。阿爾泰語系的通古斯與蒙語族同屬東北地區(qū)，膚色比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.819，P=0.366）。生活在華南地區(qū)及華東南部的苗瑤語系和侗臺語系中等膚色比例過半，是整體膚色較淺的兩個群體。同為漢藏語系的藏緬語族與漢語族差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=179.189，P＜0.001），漢語族多數(shù)人為中等膚色（53.823%），而藏緬語族以深膚色、深-較黑膚色和較黑-黑膚色為主（83.186%）。藏緬語族（藏族、彝族）和南亞語系（佤族）所生活的四川、西藏、云南等地同屬于西南地區(qū)。南亞語系人群膚色更深，以較黑-黑膚色個體居多（57.426%），與藏緬語族膚色比例差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=16.510，P=0.002）。17個人群之間的卡方檢驗結(jié)果為χ2=667.506，P＜0.001；六大語系人群之間的χ2檢驗結(jié)果為χ2=615.558，P＜0.001；七大地理區(qū)域人群之間的χ2檢驗結(jié)果為χ2=570.975，P＜0.001。

表4 膚色表型預(yù)測分類結(jié)果 （例）

圖3 各人群膚色推斷表型分布

3 討 論

國際上已有的關(guān)于色素表型的研究大多基于歐洲人群，對于東亞人群的研究較少。本研究通過構(gòu)建包含41個色素表型相關(guān)位點的HIrisPlex-S體系，對中國7大地理區(qū)域6個語系17個人群樣本進(jìn)行了DNA分型檢測和色素表型推斷。研究結(jié)果較全面地呈現(xiàn)了中國各語系人群的色素表型分布及差異情況，為我國法醫(yī)人類學(xué)和法醫(yī)遺傳學(xué)表型推斷研究提供了人群的色素表型參考信息。

根據(jù)本研究的結(jié)果，通過HIrisPlex-S體系推斷出的人群色素表型與對各人群色素特征的常識認(rèn)知、法醫(yī)人類學(xué)對各人群色素特征的描述基本一致。中國僅有印歐語系和阿爾泰語系中的亞歐混合人群在眼睛和頭發(fā)顏色方面存在明顯分類差異，其中塔吉克族的歐源成分最高，其黑發(fā)個體占比最少，淺膚色個體占比最多。哈薩克族的歐源成分最低，黑發(fā)個體最多，沒有白膚色個體。通常認(rèn)為南疆和北疆的維吾爾族人群存在外貌表型的差異，本研究中北疆伊寧維吾爾族推斷為棕色頭發(fā)個體更多且有白膚色個體，但總體而言與南疆阿圖什維吾爾族人群的色素表型十分接近。其他語系、語族的人群僅有膚色表型的多樣性，眼睛和頭發(fā)顏色沒有明顯差異。以上結(jié)果表明，眼睛、頭發(fā)顏色主要與遺傳背景及族源成分相關(guān)。

中國人群的膚色表型比較復(fù)雜，不僅與遺傳背景相關(guān)，還與中國獨特的地理環(huán)境相關(guān)。中國地區(qū)的全球水平輻照度（global horizontal irradiation，GHI）[22]顯示，喜馬拉雅山脈及與之緊鄰的青藏高原是平均輻照度最高的地方，其次是云貴高原及內(nèi)蒙古高原，華東、華南地區(qū)輻照度較低，四川盆地則是全國輻照度最低的地區(qū)。本研究結(jié)果與膚色是紫外線輻照的適應(yīng)性進(jìn)化理論一致[23]，即生活在高輻照地區(qū)的人群膚色深，生活在低輻照地區(qū)的人群膚色淺。阿爾泰語系的蒙古族和錫伯族的膚色、遺傳背景和地理區(qū)域都比較相近，但生活在內(nèi)蒙古高原的蒙古族人群深膚色的比例更高。漢藏語系中藏族、彝族兩個人群的采集地都位于川藏高原，以深膚色為主，居住海拔更高區(qū)域的藏族人群膚色更深。低輻照區(qū)域的四川及廣東漢族比華北地區(qū)的河北漢族膚色淺，華南地區(qū)的苗瑤、侗臺語系人群的膚色也較為白皙。南亞語系的佤族人在17個人群中膚色最深，除了其居住區(qū)域為云貴高原，也與南亞語系人群的族源歷史相關(guān)。

本研究結(jié)果證實，HIrisPlex-S色素推斷體系在中國人群中具有一定的適用性，中國不同語系和地域人群的色素表型有一定差異，其中膚色表型的差異更大。由于眼睛和頭發(fā)顏色相關(guān)位點是基于歐洲人群挖掘的，對亞歐混合人群有一定應(yīng)用價值，但在東亞人群中的應(yīng)用受限。后續(xù)研究基礎(chǔ)上需要進(jìn)一步篩選和驗證中國人群色素相關(guān)的遺傳位點，確定適合中國人群的色素分類標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化預(yù)測模型，使該技術(shù)可以更廣泛地用于我國的法醫(yī)物證學(xué)鑒定實踐。