（中山大學中山醫(yī)學院法醫(yī)學系，廣東 廣州 510089）

祖先信息標記（ancestry informative marker，AIM）是人類基因組中在族群之間顯示出分布模式差異的遺傳標記，其等位基因頻率與基因型頻率在不同地域或民族群體間差異明顯，因而可用作祖先信息推斷。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）[1]、插入/缺失（insertion/deletion，InDel）多態(tài)性[2]、Y染色體短串聯(lián)重復（Y chromosomal short tandem repeat，Y-STR）[3]、線粒體 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）[4]、微單倍型（microhaplotype）[5]等均可作為AIM，其中SNP因為在人類基因組中數(shù)量豐富且有國際人類基因組單體型圖計劃、千人基因組計劃等相應的數(shù)據(jù)庫支持，成為近年來篩選AIM的主要對象，這類SNP被稱為祖先信息SNP（ancestry informative SNP，aiSNP）[6]。在法醫(yī)學應用中，對aiSNP分析可以在重大災害事件或案件調查中縮小調查范圍，加快失蹤人員或災害受害者的識別進程，在缺乏目擊證人證詞或數(shù)據(jù)庫無法比對時提供調查線索，因此被法醫(yī)學界關注和重視[7-8]。目前已陸續(xù)報道了一些基于毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）平臺的aiSNP分型體系用于預測個體祖先和進行族群推斷[7，9]。

二代測序（second generation sequencing，SGS）技術革新了傳統(tǒng)的Sanger測序方法，其基本原理是邊合成邊測序，能夠同步對多樣本、多遺傳標記進行較高覆蓋度的分析，近年來在法醫(yī)學領域的應用逐漸增多[10-11]。其中，MiSeq FGx法醫(yī)基因組學系統(tǒng)（美國Illumina公司）是目前在法醫(yī)學領域常用的二代測序技術平臺之一，基于此平臺的ForenSeqTMDNA Signature Prep試劑盒系統(tǒng)能夠同時擴增231個法醫(yī)學檢驗相關的DNA遺傳標記，包括58個STR、Amelogenin、94個個體識別 SNP（individual identification SNP，iiSNP）、56個aiSNP和24個表型信息SNP（phenotype informative SNP，piSNP）（aiSNP和piSNP有兩個位點重疊）[12-13]。

我國是一個多民族國家，根據(jù)第六次全國人口普查數(shù)據(jù)顯示，除了漢族人口占多數(shù)以外，蒙古族、藏族、維吾爾族3個少數(shù)民族的人口均超過500萬，有比較集中的居住地，語言、服飾和習俗標識明顯[14]。此外，作為對外開放程度高、經濟較發(fā)達的城市，廣州近年居住有數(shù)十萬非洲人，其中尼日利亞裔約占1/3[15]。因此，本研究基于MiSeq FGx法醫(yī)基因組學系統(tǒng)二代測序平臺，采用ForenSeqTMDNA Signature Prep試劑盒的aiSNP標記，以尼日利亞群體和中國的4個群體（漢族、蒙古族、藏族和維吾爾族）作為研究對象，評估其推斷祖先來源的效果。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

根據(jù)知情同意原則采集志愿者外周血，置于濾紙片或FTA卡上制備為血痕。5個群體共計85個樣本，其中包括：河北漢族個體23個，編號為H1～H23；內蒙古自治區(qū)蒙古族個體13個，編號為M1～M13；西藏自治區(qū)藏族個體12個，編號為Z1～Z12；新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾族個體15個，編號為W1～W15；尼日利亞個體22個，編號為N1～N22。本研究經中山大學中山醫(yī)學院倫理委員會批準。

1.2 文庫構建

使用1.2 mm直徑打孔器取血痕2片，使用ForenSeqTMDNA Signature Prep試劑盒（美國Illumina公司）的B系列引物（DNA Primer Mix B，DPMB）進行文庫構建。PCR組分包括DPMB 5.0μL，PCR反應混合液1 4.7 μL，酶混合物0.3 μL。熱循環(huán)條件為：98℃變性3 min；96℃ 45 s，54℃ 2 min，68℃ 2 min，共8個循環(huán)；68℃末次延伸3min，10℃保存。對以上擴增產物添加樣本特異標簽（i5和i7）并實現(xiàn)靶點富集，熱循環(huán)參數(shù)為：98℃ 30 s；98℃ 20 s，66℃ 30 s，68℃ 90s，共循環(huán)15次；68℃ 10min，10℃保存。利用樣品純化微珠（sample purification beads，SPB）和標準化文庫珠（library normalization beads，LNB）對文庫進行純化和標準化。最后將每個樣品的文庫5μL混合到一個微量離心管中。

1.3 DNA測序

將7 μL混合后的文庫、951 μL雜交緩沖液（hybridization buffer，HT1）、2μL稀釋后的人類測序對照（human sequencing control，HSC）混合，使用 MiSeq FGxTMReagent試劑盒在MiSeq FGxTM測序儀上進行測序。每批檢測均設置2800M為陽性對照DNA（美國Promega公司），無菌水為陰性對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測序原始數(shù)據(jù)自動導入ForenSeqTM通用分析軟件（universal analysis software，UAS）v1.2.16173（美國Illumina公司）進行分析，按照默認分析閾值和解釋閾值進行56個aiSNP位點的等位基因判讀。選擇UAS的“Phenotype Estimation”分析頁面進行個體表型和生物地理祖先推斷。UAS祖先分析模塊主要利用千人基因組計劃的四大群體（歐洲、東亞、非洲和混合美洲）作為訓練樣本集，包括歐洲個體321個、東亞個體251個、非洲個體209個、混合美洲個體156個。根據(jù)56個aiSNP基因型數(shù)據(jù)與每個待檢樣本進行主成分分析（principle component analysis，PCA）。此外，本研究以三個非混合人群（歐洲、東亞和非洲人群）作為參考群體，基于56個aiSNP等位基因頻率數(shù)據(jù)（http://spsmart.cesga.es/），對本研究中每個個體分別計算在三個參考群體的群體匹配概率（assignment match probability，AMP）和似然比（likelihood ratio，LR），根據(jù)最大群體匹配概率和似然比確定其祖先分配區(qū)域[16-17]，按照江麗等[16]設定的判斷方法：LR＞100時，AMP值排第一位的人群為未知個體的來源人群；當LR≤100時，AMP值的前兩位人群均不排除。參考千人基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.internationalgenome.org/）中歐洲、東亞和非洲人群的56個aiSNPs的分型，采用PAST v3.10進行PCA[18]。利用Structure 2.3.4軟件（http://pritchardlab.stanford.edu/structure.html）分析本研究5個群體的祖先組成成分，設置0.70作為歸屬到某種人群的標準。設置運行長度為10 000，迭代次數(shù)為10 000，選擇相關等位基因頻率模型[19]，通過Structure Harvester（http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/）確定最佳K值[20]，采用 Distruct 1.1（https://web.stanford.edu/group/rosenberglab/distruct.html）生成最終圖形[21]。

2 結 果

2.1 測序質量

本次研究按照群體類別共進行了5批測序，每批實驗的2800M陽性對照DNA的分型均與試劑盒標準分型結果一致，顯示該體系的準確性和穩(wěn)定性。85個樣本的測序深度（depth）見圖1A，從圖中可以看出最低的兩個位點是rs310644和rs3811801，但都大于UAS中默認的分析閾值（10×）和解釋閾值（30×），所有位點的平均測序深度為566×。圖1B為雜合子等位基因覆蓋比（allele coverage ratio，ACR），從該圖中可以看出除位點rs1426654低于默認閾值（0.5）外，其他位點均較高，均值為0.86，整體測序質量良好。

圖1 本研究85個樣本56個aiSNP的測序質量

2.2 ForenSeqTMUAS分析

經MiSeq FGx法醫(yī)基因組學系統(tǒng)配套的UAS生物地理祖先分析模塊，獲得每個樣本基于非洲、東亞、歐洲、混合美洲4個參考人群的PCA位置圖以及每個樣本與最近的群體聚集中心（centroid）的距離、千人基因組中與待測樣本距離最近的群體樣本列表、離檢測樣本最近的聚集中心的參考樣本列表。85個樣本通過UAS分析的PCA疊加圖見圖2，可以看到：河北漢族、西藏自治區(qū)藏族個體通常落入東亞群體內，也有個體處于東亞和混合美洲群體的邊緣；內蒙古自治區(qū)蒙古族個體主要聚集在東亞群體內，但也有少數(shù)樣本處于東亞和混合美洲群體之間；新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾族則主要聚集到東亞群體和混合美洲群體之間的位置；而尼日利亞個體則全部聚集在非洲群體內。

圖2 UAS分析獲得的本研究5個群體樣本與祖先預測PCA疊加圖

2.3 PCA

如圖3所示，主成分1（PC1）、主成分2（PC2）分別占總變化的49.53%和7.38%?；谇皟蓚€因素，河北漢族、西藏自治區(qū)藏族和內蒙古自治區(qū)蒙古族聚為一簇，新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾族單獨為一簇，并且4個群體都處于同一側，而尼日利亞群體處于另外一側，與中國的4個群體相距較遠。該分析結果與UAS祖先分析結果一致。

2.4 AMP和LR

以歐洲、東亞和非洲三個非混合種群作為參考群體，根據(jù)最大群體匹配概率和似然比確定本研究每個個體的祖先分配區(qū)域，結果如表1所示，河北漢族、西藏自治區(qū)藏族、內蒙古自治區(qū)蒙古族中的所有個體均被分配到東亞種群（100%），來自尼日利亞的群體被分配到非洲種群（100%）。新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾族與其他4個研究群體的祖先地理分配比例有明顯的差異，主要預測來源于東亞和歐洲群體，其分配比例分別為60%和40%。

圖3 本研究5個群體樣本的PCA圖

表1 根據(jù)AMP和LR推斷生物地理祖先 [n（%）]

2.5 祖先成分分析

由圖4A可見，在本研究中獲得最佳K值為3的Structure分析圖，歐洲、東亞和非洲群體可以顯現(xiàn)和區(qū)分。圖4B顯示，本研究5個群體最佳K值為3，主要分為三個聚類，其中河北漢族、新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾族和尼日利亞群體各自的祖先成分相對比較集中，內蒙古自治區(qū)蒙古族和西藏自治區(qū)藏族的少數(shù)個體含有極少比例的混合成分。結合表2可見：本研究中河北漢族、西藏自治區(qū)藏族群體的東亞成分比例分別為0.987和0.960；內蒙古自治區(qū)蒙古族主要含有東亞成分（88.4%），含有較少比例的歐洲成分（10.0%）；尼日利亞群體的非洲群體成分比例為99.7%；而新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾族則明顯表現(xiàn)出東亞和歐洲的混合成分，其比例分別為53.3%和45.7%。

圖4 本研究的5個群體與3個參考群體56個aiSNP分型的Structure分析圖

表2 本研究的5個群體的祖先成分比例

表3顯示了本研究每個個體的祖先成分分析結果，設定0.70作為判定混合人群的標準，結果顯示尼日利亞個體中非洲群體成分全部大于0.980，100%的個體顯示出非洲群體來源（22/22）；河北漢族、內蒙古自治區(qū)蒙古族、西藏自治區(qū)藏族個體中東亞人群成分全部大于0.700，100%被歸入東亞群體來源。而新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾族個體中僅有2個樣本（W4和W14）的東亞成分比例大于0.700，即只有13.3%（2/15）的樣本被歸入東亞群體來源，其余樣本同時具有相對較高比例的歐洲來源（0.294～0.649），顯示出明顯的混合遺傳的特點。

表3 本研究85個樣本的祖先成分分析

續(xù)表3

3 討 論

本研究用于祖先推斷的56個aiSNP位點最早由KIDD等[17]所報道，被美國Illumina公司整合入ForenSeqTMDNA Signature Prep試劑盒?；诙鷾y序平臺能在檢測STR、SNP分型進行個體識別時同步進行族群推斷，提高了單一檢測體系獲得的遺傳信息。

本研究基于MiSeq FGx法醫(yī)基因組學系統(tǒng)檢測平臺，對中國河北漢族、內蒙古自治區(qū)蒙古族、西藏自治區(qū)藏族和新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾族以及居住在廣州的尼日利亞個體進行56個aiSNP位點測序和基因分型，并采用了該體系配套的UAS及其他公共軟件通過PCA、AMP、LR計算，Structure分析對各個樣本的生物地理祖先進行推斷。其中PCA分析顯示：河北漢族和西藏自治區(qū)藏族人群與東亞參考群體聚集在一起；尼日利亞人群與非洲參考群體聚集在一起；內蒙古自治區(qū)蒙古族主要聚集在東亞參考群體，少數(shù)個體位于東亞和混合美洲參考種群之間；新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾族人群則與混合美洲聚集在一起并處于東亞和歐洲群體之間。在UAS軟件中混合美洲群體作為一種特殊的混合人群，主要包括洛杉磯的墨西哥人、波多黎各的波多黎各人、麥德林的哥倫比亞人和秘魯利馬的秘魯人等混合群體。有文獻[19]報道，該混合種群的祖先成分包括東亞和歐洲的混合組成，通過Structure分析具有與南亞和中亞相似的遺傳成分[22]。為了獲得較明確的預測，本研究選擇東亞、歐洲、非洲3個非混合人群作為洲際參考群體，根據(jù)群體匹配概率和似然比推斷祖先來源的結果，顯示河北漢族、內蒙古自治區(qū)蒙古族、西藏自治區(qū)藏族個體100%被歸入東亞祖先來源，100%的尼日利亞個體被歸入非洲來源。通過Structure分析獲得每個樣本的祖先成分比例，若參考RAMANI等[23]的報道，設定0.75作為判定歸屬到某種人群的標準，河北漢族、西藏自治區(qū)藏族個體也將100%被歸入東亞祖先來源，但內蒙古自治區(qū)蒙古族中只有76.9%（10/13）的個體被歸入東亞人群，與通過AMP和LR的預測結果存在差異。結合本研究UAS和LR法的分析結果，嘗試以0.70作為標準，則可將內蒙古自治區(qū)蒙古族個體100%劃分到東亞來源。而在上述幾種方法中，新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾族均明顯地表現(xiàn)出東亞和歐洲的混合來源特點，與已有文獻報道[22，24]新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾族祖先組成成分是東亞和歐洲的混合相一致。文獻[24]指出，預測祖先來源分析時，特別是對于混合群體的祖先來源推斷及祖先成分分析，如果只考慮似然比的值，對地理位置相近的種群，由于持續(xù)的人口遷移和通婚就會導致分類錯誤。在這種情況下，Structure分析祖先成分可以較明確地體現(xiàn)其混合來源構成，更客觀地判斷個體的祖先起源。因此，在進行祖先來源預測中可結合兩種方法進行分析。

本研究采用上述方法對5個群體的分析結果一致，即：尼日利亞群體與中國的4個民族群體之間具有明顯的遺傳差異，通過該檢測體系全部歸屬到非洲種群；河北漢族、西藏自治區(qū)藏族和內蒙古自治區(qū)蒙古族的祖先預測顯示主要來源于東亞；新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾族預測為東亞和歐洲的混合成分。通過該體系可將新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾族與我國其他3個民族（河北漢族、西藏自治區(qū)藏族、內蒙古自治區(qū)蒙古族）進行區(qū)分，但尚不能更進一步具體地明確河北漢族、西藏自治區(qū)藏族、內蒙古自治區(qū)蒙古族之間的遺傳差異。

綜上所述，F(xiàn)orenSeqTMDNA Signature Prep試劑盒中的aiSNP體系從洲際群體水平對本研究的5個群體之間的遺傳關系和祖先預測的效能是可靠的，但尚不能區(qū)分種群中的亞群體之間的遺傳關系和祖先來源，需要開發(fā)驗證更多的參考種群數(shù)據(jù)和更高差異的東亞特定aiSNP標記，以便在法醫(yī)祖先推斷中提供更高的族群分辨率，進行更精細的祖先推斷[22]。