車環(huán)宇 趙凌志 倪 雪 滕國生 車 翀

(通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，通化 134002)

帕金森病是除阿爾茨海默病之外最常見的一種神經(jīng)退行性疾病，主要癥狀表現(xiàn)在身體和精神兩方面，包括運(yùn)動遲緩、震顫、肌強(qiáng)直、行走困難以及認(rèn)知、睡眠和感覺障礙[1]。帕金森病的兩個突出病理學(xué)特征就是中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的死亡和缺失，以及多巴胺神經(jīng)元胞質(zhì)包涵體路易小體的出現(xiàn)[2,3]。多巴胺神經(jīng)元在帕金森病發(fā)展過程中的重要作用已被諸多研究所證實(shí)，但由于神經(jīng)元的損傷是不可逆轉(zhuǎn)的，對疾病的早期預(yù)防和治療無益，因此，越來越多的研究開始關(guān)注引起多巴胺神經(jīng)元損傷的原因。研究發(fā)現(xiàn)，多巴胺神經(jīng)元的損傷與路易小體的形成密切相關(guān)，而路易小體的主要組成部分就是alpha-synuclein (α-syn)[4]。α-syn和帕金森病相關(guān)聯(lián)的直接證據(jù)來自于α-syn蛋白中獨(dú)立氨基酸位點(diǎn)的突變會引起家族性帕金森病[5,6]。遺傳學(xué)證據(jù)表明，α-syn基因位點(diǎn)的復(fù)制同樣會導(dǎo)致帕金森病的早期發(fā)生[6,7]。此外，某些易引起帕金森病的高危常染色體基因位點(diǎn)，和一些家族性PD相關(guān)的隱性基因位點(diǎn)通常位于α-syn基因的上游，它們的突變會導(dǎo)致α-syn蛋白的累積和毒性作用的增強(qiáng)，從而造成家族性和散發(fā)性帕金森病[8-11]。

在疾病的發(fā)展過程中，α-syn單體蛋白受內(nèi)外因素影響產(chǎn)生錯誤折疊，繼而發(fā)展成神經(jīng)毒性較強(qiáng)的可溶性寡聚體，并最終聚合形成不溶的纖維前體和纖維體，從而引起腦內(nèi)免疫紊亂，過度激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子，損傷神經(jīng)元細(xì)胞，導(dǎo)致帕金森病的產(chǎn)生[12-14]。因此，如何通過藥物來抑制α-syn聚合，并通過藥物介導(dǎo)α-syn聚合體在腦內(nèi)的清除，就成為了預(yù)防和治療帕金森病的新方向。但由于α-syn單體結(jié)構(gòu)的多變性和α-syn聚合過程的復(fù)雜性，導(dǎo)致通過傳統(tǒng)雜交瘤免疫和基因工程方法得到的抗體藥物靶向性不強(qiáng)且藥效不佳。為了獲得真正具有療效的帕金森病治療性抗體，本文通過從外周血中分離培養(yǎng)B細(xì)胞的方法，對外周血中B細(xì)胞分泌的α-syn自身抗體進(jìn)行了生物學(xué)功能方面的探索研究。

1 材料與方法

1.1材料 生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)、酶標(biāo)儀和384孔酶標(biāo)板購自Thermo公司。洗板機(jī)購自Biotek公司。倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和酶標(biāo)板購自Corning公司。臺盼藍(lán)染料和IMDM 完全培養(yǎng)基購自Hyclone公司。胎牛血清購自Gibco公司。TMB、吐溫-20購自Sigma公司。IL-2購自Sino biological公司。IL-21購自Thermo公司。無脂奶粉購自BD公司。慶大霉素購自Quality Biological公司。SepMateTM密度梯度離心管和EasySepTMHuman B Cell Enrichment 試劑盒購自Stem cell公司。Ficoll-Paque Plus購自GE公司。人α-synuclein單體、α-synuclein聚合體、β-synuclein、γ-synuclein和硫黃素T購自Abcam公司。羊抗人IgG Fc-HRP抗體購自Bethyl公司。

1.2方法

1.2.1人B細(xì)胞分離培養(yǎng) 首先按照Huang等[15]文章中提供的方法準(zhǔn)備3T3-msCD40L滋養(yǎng)層細(xì)胞并凍存待用。健康人全血由捐贈者捐贈并通過項(xiàng)目倫理委員會批準(zhǔn)。當(dāng)獲得健康人全血后，通過SepMateTM密度梯度離心管，按照使用說明，從全血中分離人外周血單核細(xì)胞(PBMC)，并進(jìn)行PBMC細(xì)胞計數(shù)。隨后使用EasySepTMHuman B Cell Enrichment試劑盒，按照試劑盒使用說明從PBMC中分離并富集B細(xì)胞，進(jìn)行B細(xì)胞計數(shù)。計數(shù)后參照Huang等[15]文章中提供的方法，按照5 000個3T3-msCD40L滋養(yǎng)層細(xì)胞和4個B細(xì)胞每孔的密度鋪于120塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并在每孔中加入200 μl 含104U/ml IL-2和100 μg/ml IL-21的IMDM完全培養(yǎng)基，將96孔板放置在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)13 d，取上清進(jìn)行ELISA檢測。

1.2.2ELISA檢測B細(xì)胞上清和人α-syn單體和聚合體蛋白的結(jié)合活性 用pH9.2的包被緩沖液分別稀釋α-syn單體和聚合體蛋白至1 μg/ml,以50 μl/孔包被于384孔酶標(biāo)板，4℃孵育過夜。用110 μl/孔PBST(PBS+1%Tween-20)洗板1次后加入100 μl/孔的2% milk-PBS，在室溫下封閉2 h。洗板3次后加入B細(xì)胞培養(yǎng)上清(20 μl/孔)，在室溫條件下孵育1 h。隨后洗板3次，再加入2% milk-PBS稀釋10 000倍的山羊抗人IgG Fc-HRP二抗 (50 μl/孔)，室溫下孵育1 h。洗板6次后用TMB顯色試劑盒顯色(30 μl/孔)，在室溫條件下避光顯色5 min后加2 mol/L H2SO4(30 μl/孔)終止顯色。終止顯色后立即用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測OD值。

1.2.3ELISA檢測B細(xì)胞上清與人α、β、γ-synuclein蛋白家族的交叉實(shí)驗(yàn) 用pH9.2的包被緩沖液分別稀釋α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein蛋白至1 μg/ml,包被于384孔板，4℃孵育過夜。洗板并封閉后加入B細(xì)胞培養(yǎng)上清(20 μl/孔)，在室溫條件下孵育1 h。洗板后加入2% milk-PBS稀釋10 000倍的山羊抗人IgG Fc-HRP二抗(50 μl/孔)，室溫下孵育1 h。洗板后加30 μl/孔TMB顯色液在室溫避光條件下顯色5 min，再加30 μl/孔H2SO4(2 mol/L)終止。隨后立即用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測OD值。

1.2.4硫黃素T(ThT)法檢測B細(xì)胞上清對α-syn單體聚合的抑制作用 參照Abcam提供的硫黃素T檢測法，將新鮮配制的終濃度分別為10 nmol/L的α-syn聚合體、100 μmol/L的α-syn單體、25 μmol/L的硫黃素T及50 μl B細(xì)胞上清或同型對照抗體(人IgG1)或空白對照(PBS緩沖液)混勻于PBS(pH7.4)緩沖液中，以100 μl/孔(2復(fù)孔)加于96孔酶標(biāo)板中，將板密封后置于振蕩器上，以600 r/min的速率在室溫孵育24 h。隨后在酶標(biāo)儀(激發(fā)光450 nm/發(fā)射光485 nm)上讀取熒光值，通過以下公式計算檢測的B細(xì)胞上清對α-syn單體聚合的抑制率，并通過graphpad6.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。抑制率=[(ThTblank-ThTsup)/(ThTblank)]×100%。

2 結(jié)果

2.1B細(xì)胞上清和人α-syn單體和聚合體蛋白的結(jié)合活性 從外周血分離的B細(xì)胞培養(yǎng)13 d后，離心將約200 μl的B細(xì)胞上清按照同樣的順序轉(zhuǎn)到新的96孔板中用于ELISA和生物學(xué)活性檢測。首先通過ELISA檢測B細(xì)胞上清和α-syn單體蛋白的結(jié)合活性。ELISA共檢測10 530個樣品，其中OD450>0.5和OD450>1.0的B細(xì)胞上清樣品分別有48和22個(圖1A)。取α-syn單體蛋白結(jié)合OD450>0.5的48個上清樣品進(jìn)行和α-syn聚合體蛋白結(jié)合活性的ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)其中12個樣品表現(xiàn)出只和α-syn單體結(jié)合，而不和α-syn聚合體結(jié)合。因?yàn)楸敬螜z測是基于α-syn單體檢測陽性的基礎(chǔ)上，因此所有剩余的36個樣品既可以結(jié)合α-syn單體，也可以結(jié)合α-syn聚合體(圖1B)。

圖1 ELISA檢測B細(xì)胞上清和α-syn單體和聚合體的結(jié)合活性Fig.1 ELISA test of binding of B cell supernatant to α-syn monomer and aggregateNote:A.48 in total 10 530 samples were able to bind to α-syn monomer and 36 of which bound to α-syn aggregate；B.There are 12 samples that bound to α-syn monomer only，but 36 samples bound to both α-syn monomer and α-syn aggregate.

2.2B細(xì)胞上清與人α、β、γ-synuclein家族蛋白的交叉結(jié)合活性 選取與α-syn單體和聚合體結(jié)合呈陽性的36個B細(xì)胞上清樣品，通過ELISA檢測上清樣品是否和α-syn家族蛋白β-syn和γ-syn結(jié)合，以確定待測的上清樣品是否具有α-syn結(jié)合特異性。檢測結(jié)果表明，所有檢測樣品均與α-syn結(jié)合，但不結(jié)合β-syn和γ-syn蛋白，表明檢測的上清樣品具有α-syn結(jié)合特異性。

2.3B細(xì)胞上清中α-syn自身抗體對α-syn聚合的抑制作用 選取與α-syn單體和聚合體結(jié)合呈陽性，且無家族蛋白交叉活性的36個B細(xì)胞上清樣品，通過硫黃素T法檢測B細(xì)胞上清中α-syn自身抗體是否具有抑制α-syn單體聚合的生物學(xué)活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所檢測的36個樣品中有9個樣品(18B03、24D09、25G07、41H11、55F02、84C06、85F02、87C04、96C05)能夠抑制α-syn單體的聚合，且具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。其中如表1所示，25G07和55F02的抑制率可以達(dá)到50%。

圖2 硫黃素T法檢測B細(xì)胞上清中α-syn自身抗體對α-syn聚合的抑制作用Fig.2 Inhibition test of α-syn aggregation by α-syn autoantibody in B cell supernatant using ThT assayNote:*.P<0.05，**.P<0.01,****.P<0.000 1.

表1 所檢測的B細(xì)胞上清對α-syn聚合的抑制率(%)Tab.1 Inhibition ratio (%) of α-syn aggregation by α-syn autoantibody in B cell supernatant

3 討論

本文通過從外周血中分離培養(yǎng)B細(xì)胞并檢測B細(xì)胞上清中α-syn自身抗體和α-syn單體、聚合體、家族蛋白β-syn和γ-syn的結(jié)合，確認(rèn)了外周血中α-syn自身抗體能夠特異地和α-syn單體和聚合體結(jié)合。通過抑制α-syn單體聚合的生物學(xué)活性檢測，發(fā)現(xiàn)α-syn自身抗體具有一定的生物學(xué)功能，在體外條件下能夠抑制α-syn單體的聚合，證明了α-syn自身抗體具有潛在的治療PD的應(yīng)用價值。

在本研究中，出于B細(xì)胞存活率考慮，B細(xì)胞的鋪板密度維持在4個B細(xì)胞每孔。在早期研究中，嘗試過0.5、1和2個B細(xì)胞每孔的鋪板密度，但是過少的B細(xì)胞會造成細(xì)胞增殖困難。在2個B細(xì)胞每孔的鋪板條件下，B細(xì)胞增殖率(細(xì)胞增殖孔/總鋪板孔數(shù))可以達(dá)到70%～80%，但后期上清IgG濃度檢測發(fā)現(xiàn)2個B細(xì)胞每孔的上清IgG濃度在10～80 ng/ml之間，抗體量不足以進(jìn)行生物學(xué)活性檢測。即使在4個B細(xì)胞每孔的條件下，上清中的抗體量也不足以支撐9個生物學(xué)陽性樣品的進(jìn)一步檢測。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，可以通過B細(xì)胞永生化的途徑，在篩選前期，即對α-syn結(jié)合陽性的B細(xì)胞進(jìn)行Epstein-Barr virus(EBV)轉(zhuǎn)染，使B細(xì)胞成為可以持續(xù)分泌抗體的永生化細(xì)胞[16]。此外，也可以通過流式細(xì)胞儀對B細(xì)胞進(jìn)行抗原特異性分選，收集能夠和α-syn抗原特異性結(jié)合的記憶B細(xì)胞，通過RT-PCR和測序的方法獲得抗體序列，進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和表達(dá)來獲得足量的抗體[17-20]。如果能夠獲得足夠的抗體，下一步可以繼續(xù)研究外周B細(xì)胞分泌的α-syn自身抗體是否可以介導(dǎo)α-syn聚合體在體內(nèi)的清除，從而進(jìn)一步分析α-syn自身抗體的生物學(xué)功能，為PD治療性抗體的研發(fā)打下基礎(chǔ)。此外，本研究所采集的血液樣本來自于健康人捐獻(xiàn)者，后期研究可以考慮應(yīng)用不同年齡階層的健康人和PD患者。從而比較健康人和PD患者之間，以及不同年齡健康人群之間產(chǎn)生自身抗體的差別。這些差別將有助于分析自身抗體產(chǎn)生的機(jī)制，并深入研究PD疾病的發(fā)生機(jī)理，從而對PD抗體藥物的研發(fā)起到推動作用。

在其他領(lǐng)域的研究中，有大量利用自身抗體創(chuàng)制出治療性抗體的成功經(jīng)驗(yàn)[16,17]。從機(jī)制上說，在正常生理?xiàng)l件下，自身抗體作為固有免疫的產(chǎn)物，起到維持體內(nèi)生理平衡、清除循環(huán)系統(tǒng)中的異常蛋白和死亡細(xì)胞及保護(hù)機(jī)體的作用[21,22]。但是在病理?xiàng)l件下，自身抗體的產(chǎn)生很可能是源于體內(nèi)的異常蛋白，并且具有清除異常蛋白的生理功能。而且，本文也通過技術(shù)手段，證明了通過分離培養(yǎng)外周血B細(xì)胞獲得的α-syn自身抗體是具有一定生物學(xué)功能的。總體來說，自身抗體作為創(chuàng)制α-syn治療抗體的新途徑，較其他途徑有著獨(dú)特的優(yōu)勢。首先，自身抗體靶向體內(nèi)α-syn異常蛋白，對正常α-syn蛋白不結(jié)合或較弱結(jié)合，不會影響正常α-syn蛋白的生理功能。其次，對于α-syn蛋白來說，蛋白的缺失只造成了α-syn基因敲除小鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺途徑的微弱障礙，并沒有影響到基因敲除小鼠的其他生理功能[23]。由此推測，α-syn抗體的應(yīng)用不會造成對正常神經(jīng)組織的副作用。綜上所述，來源于自身抗體的PD治療抗體相對于目前市面上治療PD的藥物來說，將具有更高的靶向性和安全性，是研究治療PD疾病藥物的新方向。