黃志鋒 羅文婷 廖陳喜 陳 浩 胡海圣 孫寶清

(廣州呼吸健康研究院，呼吸疾病國家重點實驗室，國家呼吸臨床研究中心，廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應科，廣州醫(yī)科大學，廣州 510120)

Ⅰ型過敏性疾病是一類由IgE介導的全身性疾病，涉及多器官和多系統(tǒng)[1]。過敏性鼻炎和哮喘是最常見的氣道過敏性疾病，因它們屬于同一個氣道，具有一些共同的臨床特征被稱為聯(lián)合呼吸道疾病(United Airways Diseases,UADs)[2,3]。世界衛(wèi)生組織報告稱，全世界約有3億和4億患者分別患有哮喘和過敏性鼻炎[4,5]，并且這一患病人數(shù)還在不斷增長，尤其是在發(fā)達國家[6]。而病因診斷的局限性導致過敏性鼻炎和哮喘患者的癥狀反復發(fā)作，嚴重影響生活質(zhì)量，因此明確氣道過敏原在UADs診治防治中起著非常重要的作用。目前已經(jīng)確定免疫球蛋白E(Immunoglobulin E,IgE)在Ⅰ型過敏疾患中顯著升高[7,8]。過敏原的篩查可以通過血清特異性IgE(specific IgE,sIgE)的濃度或使用高純度過敏原提取物進行皮膚點刺試驗(Skin Prick Test,SPT)來確定，而體外血清sIgE測試不受患者皮膚、服藥等因素的干擾，有效避免了個體差異帶來的結果不確定性及不良反應的發(fā)生，已成為過敏原檢測的最主要工具[7]。

長期以來，臨床應用的sIgE定量檢測系統(tǒng)較少，以Thermo Fisher的ImmunoCAP系統(tǒng)較為常見，該系統(tǒng)采用熒光酶聯(lián)免疫法，是目前國際認可的過敏原sIgE檢測方法[10]；但該系統(tǒng)花費成本較高，在國內(nèi)很難大范圍推廣。微陣列化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)(BioIC chemiluminescence immunoassay,BioIC)因其血清樣品需求量少，檢測成本低，可同時檢測多種過敏原sIgE的特點而具有良好的臨床應用前景[11]；高通量檢測過敏原的sIgE可以提供與臨床診斷相關的過敏原信息，并可以幫助患者預知某些還沒有出現(xiàn)臨床癥狀低水平sIgE陽性過敏原的風險。本研究首次采用微流控技術搭載化學發(fā)光應用于檢測過敏原sIgE，檢測19項過敏原sIgE，結合本地區(qū)過敏原分布特點分析過敏原譜及共致敏現(xiàn)象，為臨床診斷提供相關信息。

1 材料與方法

1.1實驗材料 2016年1月～2018年12月就診于廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，確診為過敏性鼻炎和(或)哮喘患者，并經(jīng)ImmunoCAP 1000系統(tǒng)檢測血清sIgE為多重過敏原陽性(包括塵螨，蟑螂、動物毛發(fā)和蝦蟹等常見過敏原)的患者血清245例。其中男143例、女102例，年齡分布為23(8,23)(中值，25%，75%)，年齡<18歲110例，≥18歲為135例。包括過敏性鼻炎患者92例，過敏性哮喘患者117例，過敏性鼻炎合并哮喘患者36例，三組患者的總IgE水平分布分別為322(198,741)，552(218,917)，781(301,1230)(見表1)。本研究及患者血清的使用經(jīng)廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準：GYYY-2016-73。

表1 根據(jù)不同疾病類型描述患者基本信息Tab.1 Patient demographic characteristics based on different diseases

1.2實驗方法 本研究采用BioIC檢測系統(tǒng)以利用類似ELISA微量孔盤內(nèi)進行的間接酶聯(lián)免疫冷光分析技術對血清過敏原sIgE進行檢測，使用BioIC系統(tǒng)檢測19種sIgE過敏原僅需100 μl血清。所有患者均使用含分離凝膠的真空采血管抽取靜脈血5 ml，3 000 r/min離心10 min，取上層血清后檢測，剩余血清標本收集置于-80℃冰箱長期存儲，避免反復凍融。進行檢測前，將待檢血清提前取出于室溫放置約30 min，并使用震蕩儀混勻。

使用BioIC化學發(fā)光分析儀和過敏原特異性IgE抗體檢測試劑盒(洹藝科技，中國臺灣)測量血清過敏原sIgE，包括屋塵螨(d1)、粉塵螨(d2)、熱帶無爪螨(d201)、貓毛(e1)、狗毛(e5)、狗牙根草(g2)、梯牧草(g6)、蟑螂(i6)、煙曲霉菌(m3)、白色念珠菌(m5)、矮豚草(w1)、雞蛋(f1)、牛奶(f2)、小麥(f4)、大豆(f13)、花生(f14)、杏仁(f20)、蟹(f23)、蝦(f24)。

1.3統(tǒng)計學處理 對于未稀釋的血清樣品，檢測范圍為0.21～100 U/ml。使用0.35 U/ml作為陰陽性閾值，sIgE結果≥ 0.35 U/ml則為陽性。按RAST(Radioallegrosorbent test，RAST)分級標準將sIgE陽性結果分為1～6級：級別1(0.35～0.70 U/ml)，級別2(0.70～3.50 U/ml)，級別3(3.50～17.50 U/ml)，級別4(17.50～50.00 U/ml)，級別5(50.00～100.00 U/ml)，級別6(≥100.00 U/ml)。

使用Excel 2016(Microsoft?Excel?2016)和SPSS 23.0(IBM Corp.,Armonk,NY)進行數(shù)據(jù)分析。采用柱狀圖表示各項過敏原的陽性率分布，組間陽性率差異采用卡方檢驗(理論頻數(shù)出現(xiàn)<5則用fish確切概率法校準)，并采用Bonferroni法校正顯著性水平的事后兩兩比較；以折線圖表示不同疾病人群合并致敏分布；對全部過敏原進行標準化后系統(tǒng)聚類分析[12]，并以合適的界限將過敏原分為若干類；使用Kendall`s Tau方法分析各項過敏原相關性。統(tǒng)計時，< 0.21 U/ml，> 100 U/ml分別采用0，101進行統(tǒng)計。P< 0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.119項過敏原sIgE致敏率分布情況 本研究招募的245例多過敏原致敏過敏性鼻炎/哮喘患者人群中，以塵螨(包括屋塵螨、粉塵螨、熱帶無爪螨)和蟑螂為主要的吸入性過敏原，而蝦蟹和牛奶作為主要的食物過敏原。粉塵螨(86.94%)的陽性率最高，其次為屋塵螨(84.49%)；吸入性過敏原中曲霉菌(1.63%)的陽性率最低。食物過敏原中蟹(21.63%)陽性率最高，雞蛋白(2.04%)的陽性率最低(見圖1)。吸入性過敏原(91.02%)總體陽性率顯著比食物過敏原(35.92%)總體陽性率高，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=160.417,P<0.01)。

2.2不同疾病患者人群致敏差異分析 按不同疾病類型將研究患者分為鼻炎組、哮喘組和鼻炎合并哮喘組，觀察三組患者的各項過敏原致敏差異，并建立合并致敏項數(shù)折線圖。結果顯示(見圖2)，三種疾病組的主要致敏過敏原均為三種螨蟲和蟑螂，鼻炎合并哮喘組患者的貓毛、狗毛、蟑螂、蝦蟹過敏原陽性率高于其他兩組疾病患者?？ǚ綑z驗結果顯示，鼻炎組、哮喘組、鼻炎合并哮喘組的狗毛陽性率分別為14.13%，23.08%，38.89%，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=9.371,P=0.009)；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，鼻炎合并哮喘組和鼻炎組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。鼻炎組、哮喘組、鼻炎合并哮喘組的蟑螂陽性率分別為26.09%、30.77%、52.78%，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=8.66,P=0.013)；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，鼻炎合并哮喘組與鼻炎組、哮喘組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。鼻炎組、哮喘組、鼻炎合并哮喘組的大豆陽性率分別為1.09%、6.84%、11.11%，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=6.713、P=0.026)；兩兩比較用Bonferroni法調(diào)整α水平后結果顯示，三種疾病組兩兩之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.022)。其余過敏原三種疾病組間差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 呼吸道過敏性疾病患者各項過敏原陽性率分布Fig.1 Positive rate of allergens in patients with respiratory allergic diseasesNote:d1-Der.Pteronyssinus;d2-Der.Farina;d201.Blomia tropicalis;e1.Cat dander;e5.Dog dander;g2.Bermuda grass;g6.Timothy grass;i6.Cockroach;m3.Aspergillus fumigatus;m5.Candida albicans;w1.Ragweed;f1.Egg white;f2.Milk;f4.Wheat;f13.Peanut;f14.Soybean;f20.Almond;f23.Crab;f24.Shrimp.

圖2 基于三種疾病人群的各項過敏原陽性率分布Fig.2 Percentages of multiple allergen sensitization to Rhinitis,Asthma,Rhinitis with asthma groups

本研究納入的呼吸道過敏性疾病患者中有86.12%的患者為多過敏原致敏(合并過敏原陽性項數(shù)≥2)；三組疾病患者多過敏原致敏百分比分別為鼻炎88.04%，哮喘84.62%，鼻炎合并哮喘86.11%，三組間差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。合并致敏項數(shù)折線圖結果顯示(見圖3)，鼻炎合并哮喘組患者比單純鼻炎或單純哮喘的患者更可能同時對多種過敏原致敏。

圖3 基于三種疾病人群的多過敏原致敏百分比分析Fig.3 Number of multiple sensitization to AR,AS,AR&ASNote:*.P<0.05;d1.Der.Pteronyssinus;d2-Der.Farina;d201.Blomia tropicalis;e1.Cat dander;e5.Dog dander;g2.Bermuda grass;g6.Timothy grass;i6.Cockroach;m3.Aspergillus fumigatus;m5.Candida albicans;w1.Ragweed;f1.Egg white;f2.Milk;f4.Wheat;f13.Peanut;f14.Soybean;f20.Almond;f23.Crab;f24.Shrimp.

2.3多重致敏的鼻炎/哮喘患者致敏模式和共同致敏現(xiàn)象探究 基于探索呼吸道疾病各種過敏原的內(nèi)在聯(lián)系，對BioIC系統(tǒng)檢測的245例患者19項過敏原sIgE進行系統(tǒng)聚類分析，19項過敏可歸類為5類不同致敏模式：第一類：屋塵螨/粉塵螨/熱帶螨/蟹/蝦/蟑螂；第二類：狗牙根草/梯牧草/小麥/大豆/花生/矮豚草/杏仁；第三類：貓毛/狗毛/牛奶；第四類：曲霉菌/白色念珠菌；第五類：雞蛋白(見圖4)。結合相關性分析結果：屋塵螨/粉塵螨/熱帶螨/蟹/蝦/蟑螂的相關性在0.857≥ rk.≥0.222,P<0.01，其中三項螨蟲之間相關性較好，rk.≥0.553,P<0.01；狗牙根草/梯牧草/小麥/大豆/花生/矮豚草/杏仁的相關性在0.837≥ rk.≥0.232,P<0.01，該類的所有過敏原同源于植物界；貓毛/狗毛/牛奶的相關性在0.432≥ rk.≥0.284,P<0.01；曲霉菌/白色念珠菌相關性為rk.= 0.302,P<0.01。

圖4 系統(tǒng)聚類分析譜系圖及Kendall`s Tau相關性分析Fig.4 Hierarchical cluster analysis dendrogram and Kendall`s Tau correlation analysisNote:d1.Der.Pteronyssinus;d2.Der.Farina;d201.Blomia tropicalis;e1.Cat dander;e5.Dog dander;g2.Bermuda grass;g6.Timothy grass;i6.Cockroach;m3.Aspergillus fumigatus;m5.Candida albicans;w1.Ragweed;f1.Egg white;f2.Milk;f4.Wheat;f13.Peanut;f14.Soybean;f20.Almond;f23.Crab;f24.Shrimp.

表2 各類致敏模式共致敏現(xiàn)象分析Tab.2 Analysis of co-sensitization phenomena in various sensitization modes

進一步分析各類致敏模式中過敏原共致敏情況(見表2)，四類致敏模式中，類別內(nèi)任一項過敏原合并其他過敏原陽性的百分率分別為95.35%(205/215),67.44%(29/43),43.53%(37/85)和16.67%(2/12)；而類別內(nèi)全部過敏原同時陽性的百分率則一般，均<16.67%。

3 討論

本研究結果顯示塵螨(包括屋塵螨、粉塵螨和熱帶無爪螨)是呼吸道過敏癥患者的主要過敏原，其次是蟑螂，貓毛和狗毛過敏原，這與先前研究的結果報道基本一致[13-15]。Li等[16]在一項全國多中心研究報道塵螨是中國最常見的室內(nèi)氣傳播過敏原，并且在其入選的所有過敏性疾病患者中對1種或多種塵螨過敏原SPT陽性率達87.2%。本研究中的患者均來自廣東省會城市廣州(南部沿海地區(qū))，屬高溫高濕的亞熱帶季風氣候，這種環(huán)境適合塵螨的生長繁殖[17]，這也解釋了本研究患者中塵螨過敏原的普遍高致敏性，因此對于所有過敏性鼻炎和/或哮喘患者進行塵螨過敏原規(guī)避的教育也是非常必要的。此外，蟑螂和貓狗毛過敏原在鼻炎和或哮喘患者中也有較高的陽性率，并以吸入性過敏原(占91.02%)為主要引起呼吸道過敏癥，少數(shù)食物過敏原(35.92%)也參與這些疾病的發(fā)生。

對三組疾病人群陽性率分析，發(fā)現(xiàn)鼻炎合并哮喘組患者對于大部分過敏原有較高的陽性水平以及更有可能合并更多項次的過敏原同時致敏。應用酶聯(lián)免疫捕獲法檢測廣州地區(qū)年齡1個月至86歲6419例患者變應原sIgE水平，發(fā)現(xiàn)哮喘組、鼻炎組、哮喘合并鼻炎組的屋塵螨、粉塵螨、熱帶螨、蟑螂的致敏陽性率差異具有統(tǒng)計學意義[14]；本研究哮喘患者屋塵螨、粉塵螨、熱帶螨的致敏陽性率均低于其他兩組患者，但差異無統(tǒng)計學意義，對于大部分常見過敏原，三組患者均具有相似的陽性率，提示過敏性鼻炎和哮喘兩者在病因、免疫學和發(fā)病機制等方面均非常相似，在過敏原分布上也具有一定的相似性。值得注意的是，過敏性鼻炎合并哮喘患者的貓毛、狗毛和蟑螂過敏原陽性率顯著高于其他兩組患者，提示這三項過敏原可能會使得呼吸道過敏癥病程加重，或是引起多種呼吸道過敏癥同時發(fā)病。本研究未對患者的疾病嚴重程度進行評定，因此未能結合病情嚴重程度進一步分析。對三組疾病的多致敏情況進行分析，過敏性鼻炎，哮喘，過敏性鼻炎合并哮喘患者的多致敏百分比分別為88.04%，84.62%、86.11%，并且鼻炎合并哮喘組患者比單純鼻炎或單純哮喘的患者更可能同時對多種過敏原致敏，提示有大部分過敏性鼻炎合并哮喘患者可同時對多種過敏原過敏，因此多過敏原致敏增加疾病的嚴重性。

多過敏原致敏可能由某些具有高度同源的過敏原之間的共同致敏或交叉反應引起。我們通過系統(tǒng)聚類分析和Kendall`s Tau相關分析將19種常見過敏原分為5類，以觀察各項過敏原之間的相似性。其中三種螨蟲以及蟑螂和蝦蟹被納為第一類，并且相關性分析結果顯示相關系數(shù)rK在0.222到0.857之間(P<0.01)；該類中5項過敏原也是本研究中呼吸道過敏癥患者的主要吸入性過敏原和主要食物過敏原，并且已經(jīng)證實蝦蟹的主要致敏蛋白原肌球蛋白和螨的Der p10組分蛋白之間存在交叉過敏反應[18,19]。狗牙根草、梯牧草、小麥、大豆、花生、矮豚草、杏仁同屬于第二類過敏原，相關性rK在0.232至0.837之間；它們都屬于植物來源的花粉或食物過敏原，以往也有研究報道部分花粉過敏并伴發(fā)植物來源的食物過敏患者病例，并通過RAST抑制試驗提示絕大多數(shù)花粉與植物來源的食物過敏原之間具有交叉反應性[20]。貓狗毛和牛奶過敏原作為第三類，其相關性也一般，貓毛和牛奶，狗毛和牛奶的Kendall`s Tau相關系數(shù)分別為0.284，0.364。目前國內(nèi)外較少報道寵物與牛奶過敏原之間的交叉過敏現(xiàn)象，在Mamikoglu等[21]的研究中，對已知寵物過敏的患者建議進一步篩查對肉類和牛奶過敏原。系統(tǒng)聚類分析產(chǎn)生的5類過敏原致敏模式中，類別內(nèi)全部過敏原同時陽性的百分率較低，而是表現(xiàn)為類別內(nèi)某一項過敏原合并其他過敏原陽性。

本研究存在一定的局限性，沒有收集患者病程病情等信息，無法將患者的患病嚴重與致敏模式進行聯(lián)合討論，對于過敏原存在的交叉過敏探究也只停留在粗提物過敏原層面，在后續(xù)的研究中將引入組分診斷解決方案進一步探討過敏原之間的平行致敏和交叉過敏現(xiàn)象。