張 琰 石夢琪 吳 群 劉慜妮 張玉梅

鈦作為一種牙科種植材料廣泛應(yīng)用于臨床，已經(jīng)獲得了較高的成功率。由于鈦是一種惰性金屬，缺乏生物活性，所以在臨床應(yīng)用過程中仍然存在愈合時間長，種植體骨結(jié)合不良等問題[1]。種植體與骨組織之間良好的骨結(jié)合是種植體行使功能的基礎(chǔ)，也是種植成功的關(guān)鍵，為了獲得更快更好的骨結(jié)合，學(xué)者們對鈦表面進(jìn)行各種表面改性以提高鈦的生物學(xué)活性[2]。微米坑復(fù)合TiO2納米管形貌(micropit/nanotube topography，MNT)高度模擬了天然骨組織結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的誘導(dǎo)成骨能力[3]。大量研究發(fā)現(xiàn)，不同尺寸納米管管徑的微納米形貌其誘導(dǎo)成骨能力存在一定差異[4]，但目前還缺乏納米管管徑對接種在經(jīng)過微納米處理的純鈦種植體表面細(xì)胞生物學(xué)行為的影響的系統(tǒng)評價及相關(guān)報道。本研究采用酸蝕后在不同電壓下陽極氧化的方法制備了具有不同納米管管徑的MNT 鈦試樣，以原代培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBMMSCs)為研究對象，采用掃描電鏡，體式顯微鏡，CCK-8，qRT-PCR，ALP、膠原、礦化結(jié)節(jié)染色及半定量等方法系統(tǒng)地研究了不同管徑的微納米形貌對rBMMSCs 生物學(xué)行為的影響，以便為種植體表面優(yōu)化設(shè)計及提高骨結(jié)合提供依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取自1 周齡SD 大鼠(空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)。純鈦試樣(99.8%,10mm×10mm×1mm，西北有色金屬研究院)；400-7000 目碳化硅水砂紙(MATADOR，德國)；改良型α-MEM 培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；胎牛血清(四季青，浙江天杭生物科技有限公司)；4%多聚甲醛、維生素C、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、1%茜素紅試劑(Sigma，美國)；細(xì)胞計數(shù)測試盒(Cell counting kit-8，CCK-8，碧云天，中國)；TRIzol RNA 提取試劑(Invitrogen，美國)；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR 試劑盒(Takara，日本)；引物合成(奧科生物技術(shù)公司，北京)；5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氯化硝基四氮唑藍(lán)(5-bromo-4-chloro-3-indolyl posphate/tetranitroblue tetrazolium chloride，BCIP/NBT)堿性磷酸酶(ALP)顯色試劑盒、天狼星紅-苦味酸溶液(雷根生物技術(shù)有限公司，北京)；堿性磷酸酶測試盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Micro BCA 蛋白檢測試劑盒(Thermo Scientific Pierce,美國)。陽極氧化電源(DH1720A-6，北京大華無線電儀器)；場發(fā)射掃描電鏡(S-4800，Hitachi，日本)；CFX96 實時熒光定量PCR 儀(Bio-Rad，美國)；體視顯微鏡(Lecia M125，德國)；紫外線分光光度儀(Eppendorf，德國)；酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo，美國)。

1.2 試樣制備與表面形貌觀察 純鈦試樣用400-7000 目SiC 水砂紙順次拋光，制備光滑對照組(Polished Ti，PT)。將拋光后的鈦試樣浸于0.5wt%HF 酸蝕20min 后，在0.5wt%HF 電解液中陽極氧化1h，其中以鈦試樣為陽極，以石墨棒為陰極，陽極氧化電壓分別設(shè)為5V、10V 和20V，制備不同納米管管徑的微納米形貌組：MNT5、MNT10和MNT20。所有鈦試樣順次在丙酮、無水乙醇和去離子水中超聲清洗15min 后，酒精浸泡，紫外線照射消毒以備用。

PT、MNT5、MNT10 和MNT20 試樣經(jīng)超聲清洗、室溫干燥后，隨機(jī)各抽取6 個，在場發(fā)射掃瞄電鏡下觀察試樣表面形貌，并比較納米管管徑的差異。

1.3 rBMMSCs 分離培養(yǎng) 無菌條件下解剖分離SD 大鼠的股骨與脛骨，切斷骨骺端，用含青/鏈霉素及10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)液將骨髓沖出，收集于15ml 離心管，800rpm 離心5min，細(xì)胞重懸后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在含5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。當(dāng)細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底面積的75%-85%時，用含有EDTA 的胰蛋白酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)液終止消化，離心棄上清，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，放入75cm2的培養(yǎng)瓶中，完成傳代。第2-4代細(xì)胞用于實驗。

1.4 不同管徑的MNT 對rBMMSCs 形態(tài)的影響 將PT、MNT5、MNT10 和MNT20 鈦試樣置于24 孔培養(yǎng)板，細(xì)胞接種密度為2×104個/ml、1ml/孔(每組設(shè)置6 個試樣)。細(xì)胞接種12h 后，PBS 漂洗3 次，2.5%戊二醛固定，4℃過夜。依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%乙醇梯度脫水8～10min。臨界點干燥后即刻噴金，掃描電鏡下觀察不同鈦試樣表面的細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5 不同管徑的MNT 對rBMMSCs 細(xì)胞活力的影響 試樣放置與細(xì)胞接種同1.4。每組設(shè)置12個試樣(分別用于檢測細(xì)胞在試樣表面接種3d 和7d 后的細(xì)胞活力)。分別在細(xì)胞接種3d 和7d，將鈦試樣轉(zhuǎn)移至新的24 孔培養(yǎng)板，PBS 漂洗3 次，采用CCK-8 測試盒檢測rBMMSCs 細(xì)胞活力，加入CCK-8 檢測液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h，使用酶標(biāo)儀在450nm 處測定吸光度值。

1.6 不同管徑的MNT 對rBMMSCs 成骨功能的影響

1.6.1 鈦試樣表面成骨相關(guān)基因表達(dá) 試樣放置和細(xì)胞接種同1.4(每組設(shè)置6 個試樣)。細(xì)胞接種12h 后，將試樣轉(zhuǎn)移至新的24 孔培養(yǎng)板，PBS漂洗3 次，采用TRIzol 法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，測定各RNA 樣品濃度和純度。使用cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 第一鏈。采用qRT-PCR 試劑盒檢測成骨相關(guān)基因Runx-2、ALP、OCN 和BMP2 的表達(dá)水平。相關(guān)PCR 引物序列見表1。

表1 成骨分化相關(guān)基因的引物序列

1.6.2 鈦試樣表面ALP 合成水平檢測 試樣放置和細(xì)胞接種同1.4(每組設(shè)置6 個試樣)。細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)(成骨誘導(dǎo)液為含有10%胎牛血清、10%青/鏈霉素、10mM β-甘油磷酸鈉、0.2mM維生素C、0.1μM 地塞米松的α-MEM)7d 后，PBS漂洗3 次，4%多聚甲醛固定20min。使用BCIP/NBT 堿性磷酸酶活性試劑盒進(jìn)行染色，體式顯微鏡觀察并拍照。同時，胰蛋白酶消化液消化并收集試樣表面的細(xì)胞于1ml EP 管，棄上清，加入RIPA 裂解液后冰上裂解30min。4℃、12000rpm離心20min，吸取上清液，用BCA 蛋白定量測試盒檢測蛋白濃度，用堿性磷酸酶測試盒檢測AKP活力。

1.6.3 鈦試樣表面膠原分泌檢測 試樣放置和細(xì)胞接種同1.4(每組設(shè)置6 個試樣)。細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14d 后，PBS 漂洗3 次，4%多聚甲醛固定20min，天狼星紅-苦味酸溶液室溫孵育18h，體式顯微鏡下觀察膠原分泌情況并拍照。將鈦試樣移至新的24 孔培養(yǎng)板，加入0.2mol/L NaOH/甲醇溶液處理3min。使用酶標(biāo)儀在540nm 處測定吸光度值。

1.6.4 鈦試樣表面ECM 礦化檢測 試樣放置和細(xì)胞接種同1.4(每組設(shè)置6 個試樣)。細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21d 后，PBS 漂洗3 次，4%多聚甲醛固定20min，1%茜素紅染色液室溫孵育3min，體式顯微鏡下觀察形成的礦化結(jié)節(jié)并拍照。將鈦試樣移至新的24 孔培養(yǎng)板，加入10%氯化十六烷基吡啶洗脫3min，使用酶標(biāo)儀在620nm 處測定吸光度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗至少獨立重復(fù)3 次。檢驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊，計量數(shù)據(jù)以平均值±SD 表示。采用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey’s 檢驗，進(jìn)行組間兩兩比較，以雙側(cè)P＜0.05、0.01、0.001、0.0001 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 試樣表面形貌比較 掃描電鏡觀察鈦試樣表面形貌如圖1 所示。1000 倍下，PT 表面相對光滑，隱約可見少量相對平行的細(xì)小拋光劃痕，MNT5、MNT10 和MNT20 表面均可見酸蝕微米坑結(jié)構(gòu)；100000 倍下，PT 表面未觀察到明顯的納米級結(jié)構(gòu)；MNT5、MNT10 和MNT20 表面可見分布均勻的納米管，且隨著陽極氧化電壓的升高，納米管管徑逐漸增大，依次在30、50 和100nm 左右。

圖1 掃描電鏡觀察鈦試樣表面形貌

2.2 不同管徑的MNT 對rBMMSCs 細(xì)胞活力的影響 rBMMSCs 在鈦試樣表面接種3d 和7d 后，細(xì)胞活力檢測結(jié)果如圖2 所示。細(xì)胞接種3d 后，各組間的細(xì)胞活力無顯著性差異；細(xì)胞接種7d 后，各組的細(xì)胞活力相對于接種3d 均有所升高，且MNT5、MNT10 和MNT20 組的細(xì)胞活力顯著高于PT 組。

圖2 CCK-8 法檢測rBMMSCs 在PT、MNT5、MNT10、MNT20 鈦試樣表面培養(yǎng)3d 和7d 后的細(xì)胞活力

2.3 不同管徑的MNT 對rBMMSCs 形態(tài)的影響 rBMMSCs 在PT、MNT5、MNT10 和MNT20表面接種12 h 后，掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)果如圖3 所示。細(xì)胞在PT 表面伸展良好，呈略微伸長的不規(guī)則多邊形，細(xì)胞邊緣僅見少量短小的偽足。相對于PT 表面，MNT5、MNT10 和MNT20 表面的細(xì)胞明顯伸長，呈不規(guī)則梭形，在伸長的兩極可見大量絲狀偽足，且隨著納米管管徑的增大絲狀偽足更明顯。

2.4 不同管徑的MNT 對rBMMSCs 成骨相關(guān)基因表達(dá)水平的影響 rBMMSCs 在鈦試樣表面接種7d 后，采用qRT-PCR 檢測成骨相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果如圖4 所示?？傮w而言，微納米形貌顯著上調(diào)了成骨相關(guān)基因的表達(dá)，并且隨著納米管管徑的增大，這種促進(jìn)作用更加明顯。3d 時，MNT5、MNT10 和MNT20 表面Runx2 的表達(dá)水平明顯高于PT 表面，且隨著納米管管徑的增大而增高，但各MNT 組之間并無顯著性差異。ALP 和BMP2的表達(dá)水平隨時間的延長而增高，3d 時MNT10、MNT20 組明顯上調(diào)了ALP 和BMP2 的活性，d時MNT5、MNT10 和MNT20 表面都上調(diào)了ALP活性，MNT15、MNT20 組上調(diào)了BMP2 的表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)7d 時，OCN 在4 組試樣表面的表達(dá)水平?jīng)]有明顯的差別。

圖3 掃描電鏡觀察不同鈦試樣表面rBMMSCs 細(xì)胞形態(tài)，rBMMSCs 接種于分別PT、MNT5、MNT10、MNT20表面12h 后，掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化

2.5 不同管徑的MNT 對rBMMSCs 內(nèi)ALP合成水平的影響 rBMMSCs 在鈦試樣表面成骨誘導(dǎo)7d 后，ALP 染色和半定量結(jié)果如圖5 所示。體式顯微鏡下可見各組鈦試樣表面均出現(xiàn)不同程度著色的藍(lán)紫色ALP 顆粒，MNT5、MNT10 和MNT20組相對于PT 組著色均加深，且MNT20 組著色最明顯。ALP 半定量分析顯示：MNT5、MNT10 和MNT20 組ALP 合成水平均顯著高于PT 組，且隨著納米管管徑的增大而逐漸升高。

2.6 不同管徑的MNT 對rBMMSCs 膠原分泌水平的影響 rBMMSCs 在鈦試樣表面成骨誘導(dǎo)14 d 后，膠原染色及半定量結(jié)果如圖6 所示。體式顯微鏡下可見各組鈦試樣表面均出現(xiàn)不同程度著色的紫紅色絲絮狀分泌物，其中PT 組著色最淺，MNT5、MNT10 和MNT20 組相對于PT 組明顯加深，MNT20 組著色最明顯。半定量分析顯示：MNT5、MNT10 和MNT20 組膠原分泌水平均顯著高于PT 組，且MNT20 組明顯高于MNT5 組與MNT20 組。

圖4 qRT-PCR 技術(shù)檢測rBMMSCs 在不同形貌鈦試樣表面成骨相關(guān)基因表達(dá)

圖5 鈦試樣表面rBMMSCs 細(xì)胞ALP 染色及半定量分析

圖6 鈦試樣表面rBMMSCs 成骨誘導(dǎo)14d 后膠原染色及半定量分析

2.7 不同管徑的MNT 對rBMMSCs 細(xì)胞外基質(zhì)礦化水平的影響 rBMMSCs 在鈦試樣表面成骨誘導(dǎo)21d 后，礦化結(jié)節(jié)染色及半定量結(jié)果如圖7 所示。體式顯微鏡下可見各組鈦試樣表面均出現(xiàn)不同程度紅染的礦化結(jié)節(jié)，其中PT 組著色最淺，形成的礦化結(jié)節(jié)最少；MNT5 組和MNT10 組比PT 組稍有加深，MNT20 組著色最明顯。半定量分析顯示：隨著納米管管徑的增大ECM 礦化水平逐漸升高，MNT10、MNT20 組顯著高于PT 組，MNT20組顯著高于MNT5 組。

3.討論

圖7 鈦試樣表面rBMMSCs 成骨誘導(dǎo)21d 后礦化結(jié)節(jié)染色及半定量分析

鈦憑借優(yōu)良的生物相容性、抗腐蝕性和突出的機(jī)械性能廣泛用于種植領(lǐng)域。但是鈦屬于惰性材料，直接植入體內(nèi)往往存在骨結(jié)合強(qiáng)度低、愈合時間長等問題[5]。為了提高材料表面活性、增強(qiáng)骨結(jié)合，通常需要對鈦種植體表面形貌進(jìn)行優(yōu)化處理[6]。大量研究表明，生物材料表面的物理形貌可優(yōu)化材料的潤濕性、粗糙度、表面能等特性，調(diào)控組織或細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)[7]。而且相對于生物學(xué)改性及化學(xué)改性而言，表面形貌設(shè)計具有更突出的穩(wěn)定性、持久性和可控性[8]。

鑒于天然骨組織是由骨陷窩等微米結(jié)構(gòu)和羥基磷灰石晶體、膠原纖維、骨小管等納米結(jié)構(gòu)有序組裝而成，細(xì)胞所處的體內(nèi)微環(huán)境也富含微、納米成分，因此從仿生學(xué)角度出發(fā)，種植體表面微米及納米化處理成為種植體表面形貌設(shè)計的方向[9,10]。大量研究發(fā)現(xiàn)，一定尺寸的微米形貌可以增加骨植入材料與骨組織之間的機(jī)械嵌合，提高骨接觸比，進(jìn)而促進(jìn)骨生成，實現(xiàn)種植體的初期穩(wěn)定性[11]。種植體納米形貌除了可進(jìn)行細(xì)胞水平的調(diào)控，還可進(jìn)行蛋白水平的調(diào)節(jié)，直接影響細(xì)胞的生物學(xué)行為或通過改變細(xì)胞外基質(zhì)的組成與結(jié)構(gòu)間接調(diào)控細(xì)胞行為[12]。然而，單純的納米形貌尚不足以誘導(dǎo)出理想的骨結(jié)合，微米形貌對種植體初期穩(wěn)定性的影響至關(guān)重要[13]。因此材料表面微米-納米復(fù)合形貌設(shè)計一度成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。本研究中我們采用酸蝕結(jié)合陽極氧化的方法制備了微米坑復(fù)合TiO2納米管的微米-納米復(fù)合形貌MNT，課題組前期的研究已證實MNT 兼具微米形貌的促細(xì)胞粘附、成骨相關(guān)基因表達(dá)與納米形貌的促細(xì)胞增殖、細(xì)胞外總蛋白合成、ALP 分泌、細(xì)胞外基質(zhì)沉積與礦化等功能[3,13-15]。而MNT 設(shè)計的關(guān)鍵是達(dá)到微米形貌的促細(xì)胞成骨分化與納米形貌的促細(xì)胞增殖、膠原分泌、基質(zhì)礦化間的平衡，使分化與增殖同時得到較大程度的增強(qiáng)[16]。其中改變TiO2納米管管徑大小是調(diào)節(jié)該平衡的較為簡單、有效的方法之一，不同管徑的納米管可對細(xì)胞的粘附、增殖、分化等生物學(xué)行為會產(chǎn)生不同的影響[4]。為了揭示納米管管徑對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，該實驗中我們通過調(diào)節(jié)陽極氧化電壓制備出不同納米管管徑的MNT 鈦試樣，系統(tǒng)地檢測了MNT 中的納米管管徑對rBMMSCs 生物學(xué)行為的影響。

掃描電鏡結(jié)果顯示，與PT 組相比，MNT 表面的細(xì)胞明顯伸長，在伸長的兩極可見大量絲狀偽足，而且隨著納米管管徑的增大，細(xì)胞形態(tài)伸長更明顯，絲狀偽足也更明顯。其原因可能是由于隨著納米管管徑的增大，納米管表面所提供的細(xì)胞粘附位點發(fā)生變化，進(jìn)而影響了細(xì)胞的形態(tài)。同時，在MNT 表面，rBMMSCs 成骨相關(guān)基因如Runx2、ALP 和BMP 的表達(dá)水平、ALP 合成、膠原分泌和細(xì)胞外基質(zhì)礦化水平都有很大程度的提高，且隨著納米管管徑的增大，這種升高更明顯?；騉CN的表達(dá)水平在不同管徑的MNT 表面沒有明顯的差異，這可能是由于OCN 是成骨細(xì)胞分化晚期表達(dá)的基因，而本實驗只選取了7 天這個時間點對其進(jìn)行檢測，在7 天的時候OCN 可能還沒有開始表達(dá)[17]。

鑒于細(xì)胞膜是細(xì)胞與材料表面最早發(fā)生直接接觸的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此我們推測鈦試樣表面微納米形貌可能通過膜應(yīng)激反應(yīng)(Membrane stress response，MSR)引起一系列細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。不同的形貌會直接導(dǎo)致不同的質(zhì)膜分布模式，形成不同的生物信號[18]。已有研究證實納米結(jié)構(gòu)具有誘導(dǎo)細(xì)胞膜分布和細(xì)胞骨架動力學(xué)改變的特性[19,20]。細(xì)胞與材料接觸后，應(yīng)力牽引也可直接誘發(fā)MSR[19]。另外，細(xì)胞膜由大量的脂類構(gòu)成，當(dāng)脂質(zhì)失衡時，MSR 就會被激活，啟動一系列細(xì)胞反應(yīng)[20]。但是要明確物理形貌是否真的通過MSR 引起細(xì)胞內(nèi)一系列生物學(xué)行為的變化還需進(jìn)行更多、更深入的研究。因此，在后續(xù)的研究中，還將繼續(xù)探索鈦表面不同管徑的MNT 調(diào)控rBMMSCs 生物學(xué)行為尤其是成骨分化的機(jī)制，以期深入理解MNT 中的納米管管徑對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為骨植入材料表面優(yōu)化設(shè)計提供有指導(dǎo)意義的生物學(xué)依據(jù)。