常博文 鐘 鵬 劉 杰 唐中華 高亞冰 于洪久 郭 煒

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低溫脅迫和赤霉素對(duì)花生種子萌發(fā)和幼苗生理響應(yīng)的影響

常博文1,2,**鐘 鵬2,**劉 杰2,*唐中華3高亞冰2于洪久2郭 煒2

1黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站, 黑龍江哈爾濱 150001;2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)村能源研究所, 黑龍江哈爾濱 150001;3東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 黑龍江哈爾濱 150001

低溫是影響我國(guó)廣大花生產(chǎn)區(qū)春花生發(fā)芽的主要因素之一。本文以不同生態(tài)區(qū)的30個(gè)花生品種為實(shí)驗(yàn)材料, 研究了倒春寒天氣誘導(dǎo)的低溫脅迫對(duì)花生出苗的影響, 以出苗率為標(biāo)準(zhǔn)篩選出4個(gè)耐低溫的花生品種(阜花17、阜花12、冀花16、冀花18)和4個(gè)不耐低溫的品種(魯花11、白沙1016、正農(nóng)黑花生1號(hào)、白玉)于溫室測(cè)定了4℃低溫和赤霉素(GA3)處理后種子發(fā)芽相關(guān)指標(biāo)和幼苗生理指標(biāo)。結(jié)果表明, 4℃對(duì)耐低溫花生品種發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)影響不顯著, 但種子活力指數(shù)和芽長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì); 4℃處理后, 不耐低溫品種幼苗相對(duì)膜透性和MDA含量上升幅度更高, 耐低溫品種幼苗的可溶性糖和游離脯氨酸含量上升幅度更大。GA3顯著促進(jìn)4℃低溫處理后花生種子萌發(fā)和種子活力, 抑制了花生幼苗在低溫處理后相對(duì)膜透性和丙二醛的上升, 提高了可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量。研究表明, 赤霉素促進(jìn)低溫脅迫下種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的最佳濃度是300 μmol L–1。發(fā)芽率與相對(duì)膜透性和丙二醛含量顯著負(fù)相關(guān), 與可溶性糖、脯氨酸含量顯著正相關(guān)。溫度影響發(fā)芽率的品種間差異較大, 常溫下赤霉素對(duì)不同耐低溫品種的發(fā)芽率影響較小。本研究為耐低溫花生種質(zhì)資源創(chuàng)新和新品種培育提供了理論依據(jù), 為研究赤霉素對(duì)不同花生品種耐低溫性影響的生理機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

花生; 倒春寒; 低溫脅迫; 赤霉素; 種子萌發(fā); 幼苗生理響應(yīng)

近年來(lái), 黑龍江省倒春寒天氣成為春季主要?dú)庀鬄?zāi)害之一。倒春寒天氣產(chǎn)生的低溫脅迫對(duì)作物種子出芽和幼苗生長(zhǎng)有嚴(yán)重影響, 輕則致使出苗緩慢, 推遲作物的物候期, 重則導(dǎo)致種子“粉籽”、“爛種”或幼苗直接被凍死, 但至今對(duì)倒春寒天氣引起的低溫危害作物出苗和生長(zhǎng)還未有系統(tǒng)研究[1]?；ㄉ?L.)是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物, 也是我國(guó)食用蛋白和食用植物油源。黑龍江花生種植面積已達(dá)到13.3萬(wàn)公頃, 種植比例不斷上升, 但倒春寒天氣影響了黑龍江省春播花生出苗[2-3]?；ㄉシN后常遭受低溫威脅, 限制了春花生出芽、生長(zhǎng)、發(fā)育, 甚至產(chǎn)量也受到影響?；ㄉN子萌發(fā)最低溫度為12℃[4], 封海勝[5]在2℃和6℃下篩選耐低溫花生種質(zhì); 唐月異等[6]在種子吸脹期采用2℃冷浸的方法篩選耐低溫花生種質(zhì); Chen等[7]在轉(zhuǎn)錄水平上篩選花生響應(yīng)低溫的基因, 但將倒春寒天氣與花生種子萌發(fā)相結(jié)合的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

赤霉素(gibberellic acid, GA)是一種植物激素, 作用于植物幼嫩組織, 適當(dāng)濃度下能夠促進(jìn)種子萌發(fā)[8]。研究表明, 適量赤霉素可以有效地促進(jìn)種子萌發(fā)。呂桂蘭等[9]研究表明, 在10℃和15℃低溫條件下GA3對(duì)大豆種子萌發(fā)有顯著的促進(jìn)作用。GA3可以部分或完全代替低溫解除種子的休眠, 提高其發(fā)芽率[10]。許多研究表明, GA3參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的全過(guò)程, 如種子萌發(fā)、莖的伸長(zhǎng)、花的誘導(dǎo)和發(fā)育、種子和果實(shí)的生長(zhǎng)[11-13]。在種子萌發(fā)過(guò)程中, GA3促進(jìn)淀粉酶和其他水解酶的合成, 并對(duì)受損的細(xì)胞膜起一定的修復(fù)作用[14]。此外, GA3在幼苗抗逆性形成方面也具有重要作用, 這可能和GA3誘導(dǎo)與抗逆性形成相關(guān)的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成有關(guān)[15-16]。本研究將田間試驗(yàn)和溫室試驗(yàn)相結(jié)合篩選耐低溫花生種質(zhì), 以及探討外源赤霉素處理對(duì)低溫下花生種子萌發(fā)和幼苗生理響應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

大田試驗(yàn)在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范區(qū)(45°50′45.58″N, 126°51′3.81″E)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)材料為2016年引進(jìn)全國(guó)不同生態(tài)區(qū)的30個(gè)花生品種種子。2017年5月3日播種, 每穴1粒, 隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì), 3次重復(fù), 小區(qū)5 m×10 m, 行株距50 cm×25 cm。目前黑龍江省還沒(méi)有統(tǒng)一的倒春寒規(guī)定和等級(jí)標(biāo)準(zhǔn), 因此參照文獻(xiàn)[17]倒春寒等級(jí)氣象指標(biāo), 制定黑龍江省倒春寒等級(jí)指標(biāo)(表1)。

表1 黑龍江省倒春寒等級(jí)指標(biāo)

ΔT表示最大降溫幅度, 指倒春寒從發(fā)生到結(jié)束這段時(shí)間內(nèi)日平均氣溫或最低氣溫24 h最大下降幅度(ΔT24)或48 h最大下降幅度(ΔT48)。δT表示氣溫距平, 指倒春寒從發(fā)生到結(jié)束這段時(shí)間平均氣溫的距平值(oC)。持續(xù)時(shí)間, 指倒春寒從出現(xiàn)到終止持續(xù)的時(shí)間(d)。

ΔT represents the maximum cooling rate, which means the maximum decrease in 24 h (ΔT24) or the maximum decrease in 48 h (ΔT48) of the daily average temperature or minimum temperature from the occurrence to the end of the late spring chilling. δT represents temperature departure, which means the anomaly (oC) of the mean temperature from the occurrence to the end of the late spring chilling. The consecutive time refers to the duration from the appearance to the end of the late spring chilling.

溫室試驗(yàn)在東北林業(yè)大學(xué)森林生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行, 實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)村能源研究所, 供試花生品種為大田試驗(yàn)篩選的4個(gè)較耐低溫品種以及4個(gè)不耐低溫品種?；ㄉN子萌發(fā)試驗(yàn)使用人工氣候箱(ZPW-400, China), 光照6級(jí)(day)/光照0級(jí)(night), 光照時(shí)間為6:00-18:00, 濕度80%, 溫度28℃(day)/25℃(night)。

將種子置直徑為20 cm的培養(yǎng)皿中溫水浸泡吸脹24 h, 將溫度調(diào)至2℃、4℃、6℃、12℃低溫冷浸培養(yǎng)3 d, 28℃復(fù)溫后在無(wú)菌水或加GA3溶液(濃度為100 μmol L–1、200 μmol L–1、300 μmol L–1)中培養(yǎng)5 d, 進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組每個(gè)花生品種50粒種子, 重復(fù)3次。

將花生種子溫水浸泡吸脹24 h后播種于珍珠巖中, 澆灌1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)萌發(fā)后, 當(dāng)幼苗3對(duì)真葉完全展開(kāi)后, 進(jìn)行4℃低溫和GA3處理。低溫處理是澆灌1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液將幼苗置4℃人工氣候箱中20 min, 復(fù)溫1 h。GA3處理是提前澆灌分別含有不同濃度GA3(濃度為100 μmol L–1、200 μmol L–1、300 μmol L–1)的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液12 h后將幼苗置4℃人工氣候箱中20 min, 復(fù)溫1 h。營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)口徑10 cm、深10 cm, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的每個(gè)品種12株, 試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大田試驗(yàn)出苗率統(tǒng)計(jì) 于2017年6月3日在30個(gè)花生品種小區(qū)分別隨機(jī)挑選3條壟, 統(tǒng)計(jì)播種穴數(shù)和出苗穴數(shù)。出苗率=出苗數(shù)(出苗穴數(shù))/播種粒數(shù)(播種穴數(shù))。

1.2.2 溫室發(fā)芽試驗(yàn) 以正常溫度為對(duì)照, 統(tǒng)計(jì)8個(gè)花生品種在不同處理后種子發(fā)芽數(shù)、發(fā)芽時(shí)間、芽長(zhǎng)等數(shù)據(jù)。參考文獻(xiàn)[18-19]計(jì)算以下參數(shù)。芽長(zhǎng)(下胚軸+胚根)≥10 mm為發(fā)芽。發(fā)芽率= 發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù); 發(fā)芽指數(shù)(GI) = ∑Gt/Dt, 其中, Gt指t時(shí)的發(fā)芽率, Dt指發(fā)芽天數(shù); 種子活力指數(shù)(VI) = S×GI, 其中, S指芽長(zhǎng)(總芽長(zhǎng)/種子總數(shù)), GI指發(fā)芽指數(shù)。

1.2.3 幼苗生理生化特性指標(biāo)測(cè)定 參考文獻(xiàn)[20]并改進(jìn)。采集完全展開(kāi)且葉位相同的葉片, 使用鉆孔取樣器(直徑為1 cm)打取圓片, 將每個(gè)處理組樣品分成2份, 每份1.0 g, 向燒杯中加入20 mL去離子水。一組使用真空泵抽取20 min, 室溫靜置30 min; 另一組使用沸水浴加熱20 min, 冷卻。使用電導(dǎo)儀分別測(cè)定電導(dǎo)率R1、R2, 相對(duì)膜透性以電解質(zhì)外滲百分率表示。相對(duì)膜透性(%) = R1/R2×100%。

參照文獻(xiàn)[21]的方法并改進(jìn)。稱取0.5 g葉片樣品, 加入5 mL磷酸緩沖液冰浴研磨成勻漿, 離心后上清液為提取液。取2 mL提取液, 加入0.67%的TBA(硫代巴比妥酸)溶液4 mL, 沸水浴15 min, 冷卻后離心取上清液。測(cè)定660 nm、532 nm、450 nm波長(zhǎng)的吸光度。MDA含量C (mmol g–1FW)= [6.45′(A532-A600)-0.56′A450]′Vt/FW′Vs, MDA (μmol g–1) = C′V/W, Vt為提取液總體積(mL); Vs為提取液試驗(yàn)體積(mL); FW為樣品重(g)。

取新鮮葉片0.3 g, 加入10 mL ddH2O沸水浴1 h, 將提取液定容至25 mL。吸取1 mL提取液, 加入1 mL ddH2O、0.5 mL蒽酮乙酸乙酯和5 mL濃硫酸, 充分振蕩, 沸水浴1 min冷卻至室溫, 630 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。以不同濃度純蔗糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計(jì)算可溶性糖含量。

稱取0.5 g葉片凍干粉末, 加入磷酸緩沖液研磨成勻漿后, 離心10 min, 取上清液為提取液。吸取1.0 mL提取液, 加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑, 搖勻, 放置2 min后在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。將不同濃度的BSA (牛血清蛋白, Sigma, USA)溶液顯色并測(cè)定吸光度, 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 以外標(biāo)法通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可溶性蛋白含量。

稱取0.5 g葉片凍干粉末, 加入3% (w/v)磺基水楊酸溶液5 mL, 沸水浴中提取15 min。吸取2 mL提取液分別加入冰醋酸和2.5% (w/v)酸性茚三酮溶液各2 mL。搖勻后, 沸水浴中加熱顯色30 min, 取出冷卻至室溫。加入5 mL甲苯充分搖勻, 避光靜置4 h, 完全分層后用吸管吸取甲苯層, 使用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)在520 nm下檢測(cè)吸光度。將不同濃度和脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液也以同樣方法顯色并測(cè)定吸光度, 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 以外標(biāo)法通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離脯氨酸含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way-ANOVA)和相關(guān)性分析檢驗(yàn)各指標(biāo)之間的相關(guān)性, Microsoft Excel軟件作圖。用Duncan’s檢驗(yàn)(=0.05)進(jìn)行多重比較樣品之間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 春季播種期氣溫變化趨勢(shì)和花生出苗率

由圖1可知, 5月3日至6月3日1個(gè)月內(nèi)發(fā)生2次倒春寒。5月1日至3日平均氣溫分別為19.5℃、22.5℃、23.5℃, 適合花生萌發(fā), 但5月4日溫度劇烈下降, 平均溫度為15℃, ΔT24 > 8℃; 5月5日平均溫度為12.5℃, 10.0 < ΔT48≤12.0; 5月6日平均溫度6.5℃, 10.0 < ΔT48≤12.0, δT <-5.0, 持續(xù)3 d, 符合倒春寒天氣的標(biāo)準(zhǔn), 屬于中度偏輕。第二次倒春寒在5月19-22日, 溫度下降3.0 < ΔT24 < 8.0或5.0 < ΔT48≤8.0,-2.0≤δT <-1.0, 持續(xù)4 d, 程度為輕度。

統(tǒng)計(jì)花生播種1個(gè)月后的出苗率, 由表2可知, 出苗率較高的品種為阜花17 (FH17)、阜花12 (FH12)、冀花16 (JH16)、冀花18 (JH18), 出苗率分別為97.22%、95.36%、95.27%和94.56%; 而出苗率較低的品種分別為白玉花生(BHS)、正農(nóng)黑花1號(hào)(HHS)、白沙1016 (BS1016)、七彩花生(QCHS)、魯花11(LH11), 出苗率分別為45.51%、49.79%、50.28%、58.63%和59.63%, 選取FH17、FH12、JH16、JH18為耐低溫實(shí)驗(yàn)組品種, BHS、HHS、BS1016和LH11為不耐低溫實(shí)驗(yàn)組品種進(jìn)行溫室試驗(yàn)。

圖1 2017年5月至6月氣溫變化

MAX T: 日最高氣溫; MIN T: 日最低氣溫; Average: 日平均氣溫。

MAX T: daily maximum of air temperature; MIN T: daily minimum of air temperature; Average: average value of air temperature.

表2 播種1個(gè)月后各花生品種出苗率

(續(xù)表2)

品種Cultivar出苗率Seedling emergence rate (%)標(biāo)準(zhǔn)誤差Standard error差異顯著性Sig. 5% 冀花4號(hào)Jihua 482.064.22fghi 冀花9號(hào)Jihua 982.631.04fghij 冀花8號(hào)Jihua 884.224.13ghijk 壽花820Shouhua 82086.385.66hijkl 花育36Huayu 3689.714.09ijkl 四粒紅Silihong90.195.24ijkl 冀花10號(hào)Jihua 1090.952.74ijkl 花育20Huayu 2091.432.74ijkl 冀花324Jihua 32493.401.89jkl 冀花18Jihua 1894.564.16kl 冀花16Jihua 1695.271.49l 阜花12Fuhua 1295.363.27l 阜花17Fuhua 1797.221.26l

2.2 花生耐低溫鑒定溫度選擇

選取2℃、4℃、6℃、12℃進(jìn)行發(fā)芽對(duì)比試驗(yàn), 旨在篩選合適的低溫處理溫度。由圖2可知, 2℃處理時(shí)所有品種的發(fā)芽率顯著下降, 耐低溫品種發(fā)芽率都在60%以下; 4℃處理時(shí)不同耐低溫性的品種之間差異明顯, 相同耐低溫性的品種發(fā)芽率差異較小; 12℃處理下所有花生品種發(fā)芽率差異不顯著。綜上, 以下試驗(yàn)都采用4℃作為試驗(yàn)處理溫度。

2.3 低溫脅迫和GA3對(duì)花生種子發(fā)芽率的影響

由表3可知, 常溫條件下(對(duì)照組)耐低溫和不耐低溫的花生品種發(fā)芽率都達(dá)到95%以上, 品種間無(wú)明顯差異。4℃處理后, 所有品種發(fā)芽率都有所下降, 耐低溫品種發(fā)芽率比不耐低溫品種下降幅度小, BHS發(fā)芽率下降幅度最大, 降低了53.29%, FH17發(fā)芽率下降了11.10%, 降低幅度最小。GA3處理后, 所有品種發(fā)芽率有顯著提高, 并隨GA3濃度升高而增加, 300 μmol L–1GA3處理促進(jìn)發(fā)芽率升高幅度最大, 不耐低溫品種發(fā)芽率增加幅度較大, 都提高了25%以上。200~300 μmol L–1GA3處理后, 耐低溫品種發(fā)芽率達(dá)到了90%以上。

圖2 不同溫度對(duì)花生種子發(fā)芽率的影響

FH17: 阜花17; FH12: 阜花12; JH16: 冀花16; JH18: 冀花18; BS1016: 白沙1016; LH11: 魯花11; HHS: 正農(nóng)黑花1號(hào); BHS: 白玉花生。圖柱上不同字母表示處理之間的0.05水平差異顯著。

FH17: Fuhua 17; FH12: Fuhua 12; JH16: Jihua 16; JH18: Jihua 18; BS1016: Baisha 1016; LH11: Luhua 11; HHS: Zhengnongheihua 1; BHS: Baiyuhuasheng. Bars superscripted by different letters are significantly different at the 0.05 probability level among treatments.

表3 低溫脅迫和GA3對(duì)花生種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、芽長(zhǎng)和種子活力的影響

同列標(biāo)以不同字母的值為處理間在0.05水平差異顯著。

Values wit hin a column followed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

2.4 低溫脅迫和GA3對(duì)花生種子發(fā)芽指數(shù)、芽長(zhǎng)和種子活力的影響

由表3可知, 低溫處理后不耐低溫品種的發(fā)芽指數(shù)、芽長(zhǎng)、種子活力指數(shù)顯著下降, 耐低溫品種也有所下降, 但下降幅度比不耐低溫品種幅度明顯減小。施加GA3促進(jìn)了各個(gè)品種發(fā)芽指數(shù)、芽長(zhǎng)和種子活力指數(shù), 隨著GA3濃度升高, 促進(jìn)作用也逐漸加強(qiáng)。300 μmol L–1GA3處理對(duì)不耐低溫品種芽長(zhǎng)、發(fā)芽指數(shù)和種子活力指數(shù)促進(jìn)作用稍微大于對(duì)耐低溫品種。LH11芽長(zhǎng)上升幅度最大, 增加了34.70%; BS1016和BHS發(fā)芽指數(shù)上升了40.21%和40.28%; 種子活力指數(shù)HHS上升了81.58%。JH16在300 μmol L–1GA3處理后種子活力指數(shù)升高幅度最大, 上升了73.99%。

2.5 低溫脅迫和GA3對(duì)花生幼苗相對(duì)膜透性和丙二醛(MDA)含量的影響

4℃低溫處理促進(jìn)所有花生品種相對(duì)膜透性都升高, GA3處理后相對(duì)膜透性降低(表4)。4℃低溫下, 耐低溫品種相對(duì)膜透性上升幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于不耐低溫品種, BHS和BS1016上升幅度為對(duì)照的0.93倍和0.90倍, FH17上升幅度最小, 上升了44.04%。相對(duì)膜透性隨著GA3濃度的增大而減小, 說(shuō)明GA3對(duì)低溫誘導(dǎo)的相對(duì)膜透性升高有抑制作用, 300 μmol L–1GA3的抑制作用最大, 其中FH12的相對(duì)膜透性比4℃處理時(shí)下降了25.06%。

丙二醛的變化趨勢(shì)與相對(duì)膜透性相似, 4℃處理后所有花生品種丙二醛含量顯著上升, GA3處理抑制丙二醛(表4)。4℃處理后, 不耐低溫品種丙二醛含量上升幅度大于耐低溫品種, 其中BS1016和BHS上升幅度較大, 分別是對(duì)照的1.95倍和1.82倍; FH12和FH17上升幅度較小, 增加了30.16%和34.08%。加入GA3抑制了4℃低溫誘導(dǎo)的丙二醛含量升高, 隨著GA3含量升高, 所有品種丙二醛含量都有所下降, 加入300 μmol L–1GA3后丙二醛含量下降幅度最大, 特別是HHS降低了39.51%。

表4 低溫脅迫和GA3對(duì)花生幼苗相對(duì)膜透性、丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量的影響

(續(xù)表4)

生理指標(biāo)Physicalindexes花生品種Peanut cultivar對(duì)照組Control group處理組Treatment group 4℃4℃+100μmol L–1 GA34℃+200μmol L–1 GA34℃+300μmol L–1 GA3 可溶性蛋白Soluble protein content (μmol g–1 FW–1)阜花17 Fuhua 1716.49±2.09 a25.45±0.98 b26.85±1.65 b27.96±1.66 b29.64±1.28 b 阜花12 Fuhua 1217.68±1.22 a23.78±0.76 ab26.45±1.01 c28.65±1.53 b30.77±1.73 b 冀花16 Jihua 1617.45±2.52 a24.36±1.22 ab25.85±1.54 bc26.56±1.49 ab29.86±1.00 b 冀花18 Jihua 1816.12±2.06 a25.88±1.85b26.74±1.99 b27.65±1.67 b30.55±1.03 b 白沙1016 Baisha 101618.02±1.98 a23.71±1.89 ab24.56±1.45 ab25.74±1.23 ab26.16±1.56 a 魯花11 Luhua 1117.68±2.01 a23.52±1.67 ab23.65±1.67 ab24.31±1.56 a26.99±0.99 a 正農(nóng)黑花生1號(hào)Zhengnongheihuasheng 116.59±1.85 a22.34±1.56 a23.99±1.35 ab24.15±1.50 a26.59±1.46 a 白玉Baiyu17.66±2.68 a21.90±1.96 a23.06±1.02 a23.94±1.73 a25.35±1.22 a 游離脯氨酸Free proline(μmol g–1 FW–1)阜花17 Fuhua 1760.01±7.23 a83.95±7.24 a100.65±6.23 ab112.14±8.66 ab135.63±7.85 bc 阜花12 Fuhua 1265.99±7.01 a85.45±8.36 a99.46±7.12 ab116.32±8.12 b140.63±7.78 c 冀花16 Jihua 1661.23±8.96 a86.56±8.11 a101.25±7.52 ab110.36±7.78 ab136.44±8.33 bc 冀花18 Jihua 1859.46±8.25 a80.11±8.46 a103.66±6.66 b120.56±8.36 b133.78±7.55 b 白沙1016 Baisha 101663.19±4.48 a78.25±7.12 a90.26±7.16 a108.36±7.45 ab122.32±6.06 ab 魯花11 Luhua 1161.85±6.85 a79.33±7.56 a90.29±8.56 a104.85±6.21 a118.62±7.60 a 正農(nóng)黑花生1號(hào)Zhengnongheihuasheng 158.36±6.99 a74.63±7.98 a91.29±7.31 a102.24±6.65 a121.55±8.32 ab 白玉Baiyu62.45±7.11 a79.35±8.24 a95.11±8.56 ab104.15±7.12 a119.62±8.41 a

同列標(biāo)以不同字母的值為處理間在0.05水平差異顯著。

Values within a column followed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

2.6 低溫脅迫和GA3對(duì)花生幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量的影響

由表4可知, 對(duì)照組中耐低溫品種可溶性糖含量高于不耐低溫品種。4℃處理后花生可溶性糖含量上升, 耐低溫性強(qiáng)的品種可溶性糖含量顯著上升, FH17和JH18上升較大, 增加了1.51倍和1.39倍; 不耐低溫品種上升幅度較小, 其中BHS上升最小, 升高了33.95%。加入GA3后促進(jìn)各品種可溶性糖含量升高, 并且隨著GA3濃度的升高而上升。100~300 μmol L–1GA3處理不耐低溫品種LH11、BHS和HHS上升幅度超過(guò)耐低溫品種, 特別是BHS和LH11在300 μmol L–1GA3處理后上升幅度較大, 升高了67.94%和64.85%。

4℃處理后各品種可溶性蛋白含量變化趨勢(shì)與可溶性糖含量相似。常溫條件下各品種可溶性蛋白含量差異不顯著。4℃條件下各個(gè)品種可溶性蛋白顯著升高, 耐低溫品種可溶性蛋白升高幅度與不耐低溫品種升高幅度差異不顯著, JH18和FH17上升幅度達(dá)到了60.55%和54.34%, HHS上升幅度最小, 上升了6.83%。加入GA3后所有品種可溶性蛋白含量都有上升趨勢(shì)。不耐低溫品種在4℃處理后加入100 μmol L–1GA3, 可溶性蛋白含量上升顯著。加入300 μmol L–1GA3所有品種可溶性蛋白含量上升幅度最大, 其中FH12可溶性蛋白含量最高, 上升了29.39% (表4)。

低溫導(dǎo)致所有花生品種游離脯氨酸含量上升, 其中上升較多的是JH18和FH17, 增加了41.37%和39.89%。各花生品種在4℃處理后加入GA3, 隨著處理濃度升高游離脯氨酸含量上升。GA3濃度為300 μmol L–1時(shí)游離脯氨酸含量最高, 與低溫處理相比JH18上升幅度最大, 上升了67.00%。耐低溫品種的游離脯氨酸含量顯著高于不耐低溫品種(表4)。

2.7 低溫脅迫下種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)與幼苗生理生化指標(biāo)相關(guān)性分析

由表5可知, 種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種子活力和芽長(zhǎng)之間存在極顯著正相關(guān)(<0.01)。種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)與相對(duì)膜透性、丙二醛存在極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01), 與可溶性糖呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(<0.01)?？扇苄缘鞍着c發(fā)芽率和芽長(zhǎng)為顯著正相關(guān)(<0.05), 但與發(fā)芽指數(shù)和種子活力相關(guān)性不顯著。脯氨酸含量與發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)存在極顯著正相關(guān)(<0.01), 與種子活力和芽長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(<0.05)。

表5 種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)與幼苗生理生化指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)

**表示< 0.01 (雙尾);*表示< 0.05 (雙尾)。

**: significant at the 0.01 probability level (2-tailed);*: significant at the 0.05 probability level (2-tailed). GR: germination rate; GI: germination index; SV: seed vigor; HL: hypocotyl length; RMP: relative membrane permeability; MDA: MDA content; SS: soluble sugar content; SP: soluble protein content; FP: free proline content.

本研究以發(fā)芽率為參考指標(biāo), 將不同品種(A)、溫度(B)和赤霉素濃度(C)作為效應(yīng)因子, 分析其效應(yīng)相互影響的顯著性對(duì)發(fā)芽率的影響。首先, 各水平結(jié)合下的數(shù)據(jù)正態(tài)分布檢驗(yàn), Shapiro-Wilk檢驗(yàn)結(jié)果表明除了耐低溫品種在常溫下使用300 μmol L–1GA3處理后發(fā)芽率(=0.024)不符合, 其余各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布(>0.05)(表6)。由方差檢驗(yàn)分析結(jié)果(表7)可知A、B、C主效應(yīng)都已達(dá)到顯著, A與B的交互效應(yīng)達(dá)到顯著(<0.01), 但A×C、A×B×C之間的交互效應(yīng)不顯著(>0.01)。對(duì)效應(yīng)因子B和C在A1和A2兩種水平上進(jìn)行簡(jiǎn)單效應(yīng)檢驗(yàn)(表8)表明, B在A1水平上簡(jiǎn)單效應(yīng)不顯著(>0.05), B在A2水平上簡(jiǎn)單效應(yīng)極顯著(<0.01), 效應(yīng)因子C在A1和A2水平上都不顯著(>0.05)。

3 討論

3.1 低溫對(duì)花生種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的影響

近年來(lái), 我國(guó)全國(guó)范圍內(nèi)倒春寒發(fā)生頻率逐漸上升, 但各地區(qū)對(duì)倒春寒研究進(jìn)度不盡相同, 以西南(滇桂黔)發(fā)表研究論文最多, 東北地區(qū)發(fā)表論文最少[1]。溫度對(duì)花生種植的影響很大, 針對(duì)黑龍江地區(qū)倒春寒研究相對(duì)較少的問(wèn)題, 開(kāi)展了倒春寒對(duì)花生出苗影響的大田試驗(yàn)和低溫脅迫對(duì)花生種子萌發(fā)影響的相關(guān)研究。研究表明, 春季溫度在12℃以上種植不覆膜花生最為適宜。低溫常導(dǎo)致花生發(fā)芽延緩、生長(zhǎng)緩慢、干物質(zhì)積累減少, 甚至種子喪失發(fā)芽能力等后果[22], 我國(guó)北方花生產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)倒春寒天氣時(shí), 易導(dǎo)致大面積爛種。王晶珊等[23]研究結(jié)果表明, 花生在出苗階段, 種子吸脹萌動(dòng)和初始發(fā)育階段對(duì)低溫最為敏感。本研究大田試驗(yàn)時(shí)期花生播種后出現(xiàn)了2次倒春寒天氣。其后, 各花生品種出苗率差異顯著, 阜花12、阜花17、冀花16、冀花18、花育20、四粒紅等品種出苗率可達(dá)到90%以上, 說(shuō)明其耐低溫能力較強(qiáng), 低溫對(duì)其種子萌發(fā)出苗影響不大, 但魯花11、白沙1016、七彩花生、白花生、黑花生等品種發(fā)芽率在60%以下, 說(shuō)明這些品種相對(duì)耐低溫性較弱, 倒春寒對(duì)其出苗影響較大。溫室試驗(yàn)中發(fā)芽率等萌發(fā)相關(guān)指數(shù)與大田試驗(yàn)結(jié)果一致。值得關(guān)注的是白花生、黑花生和七彩花生這類“彩色花生”品種耐低溫性較差。

表6 效應(yīng)因子正態(tài)分布檢驗(yàn)

效應(yīng)因子A代表不同耐低溫性品種; 效應(yīng)因子B代表不同溫度處理; 效應(yīng)因子C代表不同濃度赤霉素處理。

A represents varieties with different levels of low-temperature resistance; B represents different temperature treatments; C represents different concentrations of GA3.

表7 不同效應(yīng)因子交互效應(yīng)方差分析結(jié)果

縮寫(xiě)同表6。

Abbreviations are the same as those described in Table 6.

表8 效應(yīng)因子交互作用簡(jiǎn)單效應(yīng)檢驗(yàn)

B WITHIN A1/A2表示效應(yīng)因子B在A1或A2水平上簡(jiǎn)單效應(yīng)結(jié)果; C WITHIN A1/A2表示效應(yīng)因子C在A1或A2水平上簡(jiǎn)單效應(yīng)結(jié)果?？s寫(xiě)同表6。

B WITHIN A1/A2 represents simple effect of effect factor B on A1 or A2 level; C WITHIN A1/A2 represents simple effect of effect factor C on A1 or A2 level. Abbreviations are the same as those described in Table 6.

丙二醛(MDA)是植物在遭受逆境脅迫時(shí)細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用生成的最終產(chǎn)物, 所以MDA濃度一定程度上反映了細(xì)胞膜受傷害的程度。溫室試驗(yàn)結(jié)果表明, 較耐低溫品種(阜花12、阜花17、冀花16、冀花18)在低溫處理后MDA含量上升幅度低于不耐低溫品種(魯花11、白沙1016、白花生和黑花生), 說(shuō)明耐低溫性強(qiáng)的花生品種細(xì)胞膜受低溫傷害較小。細(xì)胞膜相對(duì)透性的變化能反映植物低溫傷害程度, 相對(duì)膜透性越大說(shuō)明低溫傷害越大[24]。正常生長(zhǎng)條件下各品種相對(duì)膜透性無(wú)顯著差異, 但低溫處理后不耐低溫品種葉片的電導(dǎo)率上升明顯, 說(shuō)明其相對(duì)膜透性增大。通過(guò)MDA和相對(duì)膜透性的結(jié)果表明不耐低溫品種在低溫處理后受傷害更嚴(yán)重。植物體內(nèi)可溶性糖、可溶性蛋白有較強(qiáng)親水性, 明顯增強(qiáng)細(xì)胞持水力, 減少低溫導(dǎo)致原生質(zhì)結(jié)冰致死的可能, 從而提高植物耐低溫能力[25]。本研究中耐低溫品種在低溫處理后可溶性糖和可溶性蛋白量上升顯著, 正常條件下不耐低溫品種的可溶性糖含量較低。植物細(xì)胞內(nèi)游離脯氨酸也是一類重要的滲透調(diào)節(jié)物[26], 作用與可溶性糖等相似, 增加細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)量, 防止細(xì)胞過(guò)度失水造成滲透脅迫, 降低冰點(diǎn), 減輕低溫對(duì)細(xì)胞的損害[27]。以前研究中脯氨酸含量與抗?jié)B透脅迫之間呈現(xiàn)顯著正相關(guān), 脯氨酸含量也作為植物抗逆性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一[28-30]。本研究結(jié)果表明低溫處理后較耐低溫品種脯氨酸含量較高, 升高幅度最大, 與前人研究結(jié)果一致。

3.2 赤霉素對(duì)花生種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的影響

赤霉素(GA)是一類植物激素, 在植物生長(zhǎng)的整個(gè)生命周期中都發(fā)揮重要作用, 在植物種子萌發(fā)、幼苗發(fā)育過(guò)程中莖和下胚軸伸長(zhǎng)和葉子擴(kuò)張[31]等方面具有必不可少的作用。許多研究表明, 赤霉素有促進(jìn)種子萌發(fā)的作用, 并且對(duì)打破種子休眠、提高發(fā)芽率、縮短發(fā)芽時(shí)間有顯著效果[32-34], 同時(shí)赤霉素還可以緩解逆境脅迫對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的抑制作用[35]。本研究中GA3顯著緩解低溫對(duì)花生種子萌發(fā)的抑制, 特別是300 μmol L–1GA3對(duì)花生種子萌發(fā)的促進(jìn)作用最大。代勛等[36]報(bào)道, 赤霉素能夠抑制低溫和干旱導(dǎo)致的電解質(zhì)滲透率增加和MDA積累。劉永慶等[14]證明赤霉素能破除種子休眠, 促進(jìn)淀粉酶和水解酶合成, 修復(fù)受損的細(xì)胞膜。本研究中, GA3處理后各花生品種MDA含量、相對(duì)膜透性都顯著下降, 說(shuō)明GA3對(duì)低溫造成的MDA含量升高和相對(duì)膜透性上升具有抑制作用, GA3緩解低溫對(duì)花生幼苗傷害, 與前人研究結(jié)果一致。另外, GA3提高花生幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量(表4), 也從側(cè)面說(shuō)明花生幼苗抗寒性有所增加。研究表明[37-39]植物幼苗時(shí)期施加赤霉素不僅可以促進(jìn)幼苗葉片可溶性糖含量, 也能促進(jìn)植物結(jié)實(shí)量和果實(shí)品質(zhì), 赤霉素對(duì)花生果實(shí)品質(zhì)的影響需要進(jìn)一步研究。

3.3 低溫和赤霉素對(duì)不同花生品種發(fā)芽率的簡(jiǎn)單效應(yīng)分析

作物的耐低溫性是作物在遭受低溫脅迫時(shí)能夠抵御脅迫, 維持生命延續(xù)的一種能力, 同一種作物不同品種之間也會(huì)存在較大差異。通過(guò)對(duì)品種、溫度、赤霉素3個(gè)效應(yīng)因子進(jìn)行簡(jiǎn)單效應(yīng)分析可知低溫對(duì)不同品種影響不同, 低溫對(duì)較耐低溫品種影響不顯著, 但對(duì)不耐低溫品種影響非常顯著; 另外簡(jiǎn)單效應(yīng)檢驗(yàn)表明, 赤霉素在品種間差異不顯著, 這可能是由于赤霉素對(duì)種子萌發(fā)的促進(jìn)作用具有普適性。本研究通過(guò)大田試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)不同花生品種在倒春寒后出苗情況結(jié)合溫室試驗(yàn)檢測(cè)低溫脅迫對(duì)花生發(fā)芽率、種子活力、發(fā)芽指數(shù)和幼苗低溫下的生理生化指標(biāo)綜合分析, 篩選了耐低溫花生品種, 今后可進(jìn)一步驗(yàn)證在黑龍江地區(qū)種植的可行性并進(jìn)行推廣。另外, 在花生播種前使用一定濃度赤霉素處理種子, 能夠促進(jìn)花生發(fā)芽和提高幼苗耐低溫能力。

4 結(jié)論

篩選出耐低溫的品種(阜花12、阜花17、冀花16、冀花18)和不耐低溫的品種(魯花11、白沙1016、黑花生、白花生)。前者在遭遇低溫脅迫后種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種子活力和芽長(zhǎng)高于后者; MDA含量、相對(duì)膜透性低于后者, 可溶性糖、脯氨酸含量顯著高于后者。赤霉素對(duì)低溫導(dǎo)致的種子萌發(fā)降低和幼苗生長(zhǎng)阻礙有一定緩解作用, 并且300 μmol L–1赤霉素的作用效果最大。

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Effect of low-temperature stress and gibberellin on seed germination and seedling physiological responses in peanut

CHANG Bo-Wen1,2,**, ZHONG Peng2,**, LIU Jie2,*, TANG Zhong-Hua3, GAO Ya-Bing2, YU Hong-Jiu2, and GUO Wei2

1Postdoctoral Research Station, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001, Heilongjiang, China;2Rural Energy Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Science, Harbin 150001, Heilongjiang, China;3Key Laboratory of Forest Plant Ecology Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin 150001, Heilongjiang, China

From 30 peanut cultivars, we screened four cultivars with strong low-temperature-resistance (Fuhua 17, Fuhua 12, Jihua 16, Jihua 18) and four cultivars with weak low-temperature-resistance (Luhua 11, Baisha 1016, Zhengnongheihuasheng 1, Baiyu), and measured related indicators of seed germination and physiological indexes of seedlings under low temperature (4oC) and GA3treatments. There was no significant difference in rate of emergence and germination index of strong low-temperature- resistant cultivars with or without 4oC treatments, but decrease in hypocotyl length and seed vigor under low temperature. The relative membrane permeability and MDA content of four cultivars with weak low-temperature-resistance had higher ascensional range. The contents of soluble sugar, soluble protein and free proline of cultivars with strong low-temperature resistance had smaller reduction. GA3facilitated the rate of emergence and seed vigor of all peanut seeds, as well as promoted the contents of soluble sugar, soluble protein and free proline of seedlings, but suppressed the uptrend of relative membrane permeability and MDA content of peanut seedlings under low temperature. The best concentration of GA3promoting seed germination and seedling growth of peanut with low temperature treatment is 300 μmol L–1. The rate of emergence had significantly negative correlation with relative membrane permeability and MDA, and obviously positive correlation with the contents of soluble sugar or free proline. The temperature had greater influence on germination rate, but the effect of gibberellin on difference of germination rate between different varieties was smaller. This study provided a theoretical basis for germplasm resources innovation and breeding new peanut cultivars with strong low-temperature resistance, as well as for studying the physiological mechanism of gibberellin on chilling tolerance of different peanut varieties.

peanut; late spring chilling; low-temperature stress; gibberellin; seed germination; seedling physiological responses

2018-03-22;

2018-08-20;

2018-09-28.

10.3724/SP.J.1006.2019.84043

通信作者(Corresponding author): 劉杰, E-mail: liujie1677@126.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

E-mail: changbowen2005@163.com, Tel: 0451-86683588

本研究由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院課題(2017BZ01), 哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)(2017RAQYJ135)和黑龍江省育繁推一體化項(xiàng)目資助。

This study was supported by the Program of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences (2017BZ01), Harbin Special Fund for Research of Innovative Talents of Science and Technology (2017RAQYJ135), and Heilongjiang Integration Program of “Breeding, Reproduction and Pushing”.

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180925.0930.002.html