劉 洪 徐振江 饒得花 魯 清 李少雄 劉海燕 陳小平 梁炫強 洪彥彬,*

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基于形態(tài)學性狀和SSR標記的花生品種遺傳多樣性分析和特異性鑒定

劉 洪1,**徐振江1,**饒得花1魯 清2,3李少雄2,3劉海燕2,3陳小平2,3梁炫強2,3洪彥彬2,3,*

1華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院, 廣東廣州 510642;2廣東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所, 廣東廣州 510640;3廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點實驗室, 廣東廣州 510640

以101份南方花生區(qū)試品種為材料, 利用形態(tài)學性狀和SSR標記進行品種遺傳多樣性分析和特異性鑒定。結(jié)果表明, 29個形態(tài)學性狀中有7個無多樣性, 其余22個的多樣性指數(shù)為0.23~0.77, 平均為0.43。在相似系數(shù)為0.76處, 將供試品種劃分為七大類群, 同一育種單位的品種傾向于聚在一起。用40個SSR標記共檢測出167個等位基因, 單個標記檢測的等位基因數(shù)2~6個, 平均為4.18個。標記的多態(tài)性信息量(PIC)差異較大, 最大為0.79, 最小為0.26, 平均為0.55。在相似系數(shù)為0.70處, 供試品種可被劃分為六大類群, 同一省份育成的品種多聚為一類。Mantel檢驗發(fā)現(xiàn)品種間的形態(tài)學性狀和SSR標記的相似系數(shù)矩陣相關(guān)性弱(= 0.36), SSR標記無法取代形態(tài)學性狀單獨用于花生品種特異性鑒定, 但兩者相結(jié)合能有效提高花生品種特異性鑒定的準確性。

花生; 形態(tài)學; SSR; 遺傳多樣性; DUS

花生栽培種(L.)屬落花生屬()花生區(qū)組(section), 異源四倍體(2= 4= 40, AABB), 是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的重要油料和經(jīng)濟作物。因其適應(yīng)性廣、豐產(chǎn)性好、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟效益高、適于加工, 在促進農(nóng)民增收和維護國家糧油安全中發(fā)揮重要作用。我國不但是花生種植、消費和出口大國, 同時也是花生育種強國。截止2017年7月, 共有409個花生品種申請植物新品種權(quán), 其中授權(quán)品種116個[1]。

中國是國際植物新品種保護聯(lián)盟(UPOV)的成員國, 依據(jù)植物新品種保護條例[2]的規(guī)定, 植物新品種必需具備特異性(distinctness)、一致性(uniformity)和穩(wěn)定性(stability) (簡稱DUS), 才能授予品種權(quán)。特異性測試是DUS測試的核心, 而準確篩選近似品種是特異性測試的基本要求。目前花生近似品種篩選仍以形態(tài)學鑒定為基礎(chǔ), 雖然該方法簡單、直接, 但容易受環(huán)境條件和人為因素的影響。此外, 由于過分強調(diào)花生品種的豐產(chǎn)性, 育種家通常選用高配合力親本進行雜交育種, 導(dǎo)致育成品種親緣關(guān)系近, 后代遺傳變異停留在近交水平[3], 從而加大了表型篩選近似品種的難度。尤其近幾年品種侵權(quán)事件不斷增加, 同種多名和同名多種等不良現(xiàn)象的涌現(xiàn), 給花生新品種保護工作和品種管理帶來很大困難。

與形態(tài)學標記相比, 分子標記能對各發(fā)育時期的個體、組織、器官甚至細胞做檢測, 既不受環(huán)境的影響, 也不受基因表達與否的限制, 數(shù)量豐富, 遺傳穩(wěn)定, 對生物體的影響表現(xiàn)為“中性”[4]。分子標記的所有這些特性, 奠定其廣泛應(yīng)用前景, 并成為植物新品種測試審查和品種鑒別的重要技術(shù)手段[5-6]。早前Tommasini等[7]利用SSR標記對油菜品種特異性的測試表明, SSR標記可作為油菜DUS測試體系的有效補充。隨后, Arens等[8]在番茄上開發(fā)8個與抗性高度相關(guān)的分子標記, 并用于番茄品種特異性鑒定。結(jié)果表明, 該套標記具有滿足品種DUS測試要求的潛力, 可作為當前DUS測試中抗性鑒定的補充方法。近期, Jones和Mackay[9]通過高密度SNP標記分析大麥品種的基因型并預(yù)測其DUS性狀表明, 基因型預(yù)測在大麥特異性鑒定上具有一定的可行性。

盡管分子標記在品種鑒別上發(fā)揮重要作用, 但目前分子標記仍未能取代形態(tài)學性狀, 單獨用于DUS測試中申請品種的特異性鑒定。這是由于分子標記與形態(tài)學性狀之間尚不具備足夠的相關(guān)性。品種之間的DNA指紋即使存在差異, 其形態(tài)表現(xiàn)也可能相同; 而在某些情況下, 品種之間形態(tài)學上盡管存在很大差異, 也可能具有相同的DNA指紋, 如突變體。此外, 根據(jù)UPOV公約的要求, 新品種申請保護除了要求特異性之外, 還必須要求一致性和穩(wěn)定性, 而關(guān)于一致性的分子驗證問題, 由于DNA檢測技術(shù)的靈敏性較高, 難于發(fā)現(xiàn)在所有的標記位點都穩(wěn)定的品種, 因此, 利用分子標記鑒定品種一致性的標準可能較田間表型一致性的標準要低。但是合適的標準和接受概率如何確定, 對于雜交種來說目前仍是一個難題。此外, 對于一致性的確定應(yīng)該選用多少個體, 是否和DUS 測試需要的田間檢測樣本相同, 如何判別差異個體的容許誤差等, 都仍需在實踐中探索[10]。

由于分子標記單獨應(yīng)用于DUS測試仍存在諸多技術(shù)難題, 形態(tài)學性狀和分子標記的結(jié)合將是近期DUS測試研究的主要方向。將分子標記和形態(tài)指標綜合利用起來描述PVP (Plant Variety Protection)當中的品種性狀, 既有利于認識品種之間的遺傳關(guān)系, 也可以滿足植物新品種保護中明確分類的需要。

鑒于此, 本研究擬同時利用形態(tài)學性狀和分子標記分析南方花生區(qū)試品種的遺傳多樣性, 并通過聚類分析鑒定花生品種的特異性, 為花生DUS測試中近似品種的快速篩選以及品種質(zhì)量管理提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

選用1999—2015年南方花生區(qū)試品種(表1), 共101個, 由廣東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)學性狀調(diào)查 2016年3月至2017年8月在華南農(nóng)業(yè)大學五山試驗基地按隨機區(qū)組設(shè)計和種植試材, 每個小區(qū)畦長3 m, 畦面寬1.4 m, 行距25 cm, 株距20 cm, 重復(fù)2次。每個品種以40株為樣本, 按農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 2237-2012[11]調(diào)查29個形態(tài)學性狀, 其中質(zhì)量性狀9個、假質(zhì)量性狀3個、數(shù)量性狀17個。通過目測調(diào)查質(zhì)量性狀和假質(zhì)量性狀, 以1/2、1/2/3或者1/9級記錄; 用直尺或游標卡尺測量長度, 電子秤測量質(zhì)量, 對照標準品種, 按1~9級記錄。

表1 供試品種數(shù)量及來源

1.2.2 DNA提取方法 取花生幼葉, 采用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(DP3111, BioTeke, 中國)提取花生基因組DNA。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量, 用超微量分光光度計Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, USA)檢測樣本濃度。將所有樣本DNA用無菌水統(tǒng)一稀釋至25 ng μL–1,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SSR標記選擇及PCR檢測 從Shirasawa等[12]構(gòu)建的包含3693個標記的花生栽培種綜合遺傳圖譜中篩選出40個多態(tài)性高、擴增穩(wěn)定、帶型清晰的SSR標記(每個染色體2個), SSR引物由北京六合 華大基因科技股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為10 μL, 包含DNA模板1 μL、2×PowerPCR MasterMix (PR1702, BioTeke, 中國) 5 μL、上下游引物各0.4 μL、無菌水3.2 μL。PCR擴增程序為95℃預(yù)變性5 min; 95℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 35個循環(huán); 72℃延伸10 min, 擴增產(chǎn)物經(jīng)Fragment Analyzer全自動毛細管電泳系統(tǒng)(FSV2-CE, AATI, USA)檢測后將數(shù)據(jù)結(jié)果自動存于ProSize 2.0系統(tǒng)軟件。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用NTSYS-pc2.11軟件分析數(shù)據(jù), 在Similarity模塊中選擇Qualitative data分別對形態(tài)學性狀和SSR標記的原始矩陣求遺傳相似系數(shù)(genetic similarity, GS), 并獲得相應(yīng)的GS矩陣。在Clustering模塊中選擇SAHN采用UPGMA進行聚類分析, 并通過Tree plot模塊生成聚類圖。在Graphics模塊中選擇Matrix comparison plot對形態(tài)學性狀和SSR標記的相似系數(shù)矩陣之間的相關(guān)性進行Mantel檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學性狀多樣性分析

對101個花生品種29個表型性狀進行描述性統(tǒng)計(表2)表明, 有7個形態(tài)學性狀(植株開花習性、主莖開花習性、小葉性狀、花冠顏色、植株生長習性、莢果籽仁數(shù)、種皮顏色數(shù)量)在供試品種間無多樣性, 其余22個性狀Simpson多樣性指數(shù)為0.23~0.77, 平均為0.43, 多樣性指數(shù)最高的性狀為百仁重。

表2 供試品種的形態(tài)學性狀特征

盡管總體上花生品種的形態(tài)學性狀存在一定的多樣性, 但同一育種機構(gòu)育成的花生品種表型較相似, 遺傳多樣性低。例如“粵油”系列品種多數(shù)具有植株偏矮、葉色深綠、生育期中等、莢果大、果紋深、籽仁率偏低、莢果縊縮程度弱等特點。

利用22個具有多樣性的形態(tài)學性狀對供試品種進行聚類分析, 從圖1可知, 在相似系數(shù)為0.76處, 可將供試品種劃分為七大類群, 類群I包含10個品種, 其中“湛油”系列品種9個、“粵油”1個。類群II包含28個品種, 其中“粵油”15個、“仲愷花”4個、“賀油”3個、“閩花”和“航花”各2個、“汕油”和“?；ā备?個。類群III包含30個品種, 其中“泉花”8個、“龍花”7個、“莆花”和“閩花”各5個、“?；ā焙汀敖鸹ā备?個、“賀油”1個。類群IV包含17個品種, 其中“汕油”9個、“仲愷花”4個、“賀油”3個、“閩花”1個。類群V包含12個品種, 其中“桂花”11個、“賀油”1個。類群VI和類群VII各包含2個品種, 分別為“湘花120”、“湘花2008”和“云花生4號”、“云花生12號”。同一育種機構(gòu)育成的花生品種傾向于聚在一起, 例如湖南農(nóng)業(yè)大學和云南省農(nóng)業(yè)科學院分別育成的“湘花”和“云花生”系列品種均單獨聚為一類, 廣西農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所育成的11個“桂花”品種均聚在一起, 湛江市農(nóng)業(yè)科學研究院育成的9個“湛油”品種也聚為一類。此外, 同一省份的花生品種也傾向于聚在一起。例如, 類群III包含30個品種, 其中29個來自福建省。類群II包含29個品種, 其中22個來自廣東省。

2.2 SSR多態(tài)性分析

利用40個多態(tài)性高、帶型容易識別的SSR標記對101個供試品種基因組DNA進行擴增, 共檢測出167個等位基因, 單個標記檢測的等位基因數(shù)為2~6個, 平均為4.18個。標記的多態(tài)性信息量(PIC)差異較大, 最大為0.79, 最小為0.26, 平均為0.55 (表3)。

基于40對SSR引物擴增的167個等位基因, 對101個花生品種進行聚類分析。由圖3可知, 在相似系數(shù)為0.70處, 供試材料可被劃分為六大類群。類群Ⅰ包含30個花生品種, 其中“泉花”系列品種8個、“龍花”7個、“莆花”和“閩花”各5個、“?；ā焙汀敖鸹ā备?個、“賀油”1個。類群II包含45個品種, 其中“粵油”15個、“汕油”品種9個、“仲愷花”8個、“賀油”4個、“湛油”和“閩花”各3個、“航花”2個、“福花”1個。類群Ⅲ包含8個品種, 其中“湛油”6個、“粵油”和“汕油”各1個。類群IV包含14個品種, 其中“桂花”11個、“賀油”3個。類群V包含2個品種, 分別為“湘花120”和“湘花2008”。類群VI也只包含2個品種, 分別為“云花生4號”和“云花生12號”。同一省份育成的品種傾向于聚為一類。例如類群I有27個品種來自福建省, 類群II有37個品種來自廣東省, 而類型III、IV、V、VI中的品種則分別來自廣東省、廣西壯族自治區(qū)、湖南省和云南省。

2.3 花生品種特異性鑒定

比較形態(tài)學性狀和SSR標記的聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn), 兩者在總體上傾向一致, 同一地方育種的品種多聚為一類。但具體到品種與品種間的遺傳相似性, 兩者卻存在較大差異。供試品種之間的形態(tài)學性狀相似系數(shù)為0.62~1.00, 平均為0.75, SSR標記相似系數(shù)為0.55~1.00, 平均為0.70。經(jīng)Mantel檢驗, 供試品種間的形態(tài)學性狀相似系數(shù)與SSR標記相似系數(shù)的相關(guān)性弱(= 0.36)(圖3), 說明通過形態(tài)學和SSR鑒定品種的特異性, 結(jié)果將不完全一致。由圖1和圖2可知, 通過形態(tài)學和SSR可區(qū)分的品種均為97個, 無法區(qū)分的品種為4個。其中“賀油11”與“賀油9號”均無法通過形態(tài)學和SSR區(qū)分(品種間的相似系數(shù)=1.00), 而“粵油7號”和“粵油410”能通過SSR區(qū)分, 但不能通過形態(tài)學區(qū)分, 相反, “汕油誘1號”與“汕油輻1號”能通過形態(tài)學區(qū)分, 但不能通過SSR標記區(qū)分。

由于“賀油11”與“賀油9號”在形態(tài)學和SSR標記上均沒有顯著性差異, 初步推斷為同一品種。盡管“粵油7號”和“粵油410”在形態(tài)學上相同(“粵油7號”為“粵油410”母本), 但SSR標記存在差異, 共檢測出9個差異位點, 品種間的相似系數(shù)為0.83, 因此可判斷“粵油7號”和“粵油410”為不同花生品種。此外, “汕油誘1號”和“汕油輻1號”是“汕油212”分別通過EMS (甲基磺酸乙酯)化學誘變和Co(鈷)輻射誘變選育出來的品種, SSR檢測發(fā)現(xiàn)2個品種的DNA指紋一致。但由于兩者在形態(tài)學上存在較大差異, 相似性系數(shù)僅為0.73, 通過形態(tài)學可區(qū)分開來, 因此, 綜合SSR和形態(tài)學信息, 可判斷“汕油誘1號”和“汕油輻1號”是來自“汕油212”的突變體。

3 討論

3.1 花生品種的遺傳多樣性

本研究調(diào)查供試品種的29個形態(tài)學性狀, 結(jié)果有7個性狀無遺傳多樣性, 其余性狀的Simpson多樣性指數(shù)平均僅為0.43。說明當前培育的品種在表型上存在同質(zhì)化趨勢。相比之下, 40個SSR標記均能在區(qū)試品種中檢測出多態(tài)性, 且多態(tài)性信息量平均為0.55, 遠高于形態(tài)學性狀的Simpson多樣性指數(shù)(兩者計算公式一致)。本研究中SSR標記比形態(tài)學性狀的遺傳多樣性更豐富, 其原因之一可能是形態(tài)學性狀在育種過程中受到強烈的人工選擇, 而SSR標記無法通過肉眼觀察, 在育種過程中受到人工選擇的影響較小。

圖1 形態(tài)學性狀聚類分析圖

圖3 形態(tài)學性狀和SSR標記遺傳相似性系數(shù)矩陣比較

形態(tài)學聚類顯示, 同一單位培育的品種傾向于聚在一起。造成這種局面的原因有2個: (1) 品種存在親緣關(guān)系。分析歷年南方花生區(qū)試品種的系譜發(fā)現(xiàn), 多數(shù)區(qū)試品種的親本之一為參試單位早期培育的品種, 同一單位培育的品種普遍存在親緣關(guān)系。(2) 不同育種單位的選育方法和目標不同。不同育種單位在長期的育種過程中形成了自己的育種經(jīng)驗, 對目標性狀的選擇存在偏好, 容易培育出自家特色的花生品種。例如汕頭市科學研究所傾向于選擇株型直立、莖稈纖細、成熟期底部落葉明顯、中果型、果多、果紋中等、結(jié)莢集中的品種。

3.2 花生品種特異性鑒定

分子標記與形態(tài)學性狀之間不具備足夠的相關(guān)性是當前分子標記單獨應(yīng)用于植物新品種特異性鑒定的瓶頸。由于形態(tài)學性狀多為數(shù)量性狀, 受微效多基因控制, 而SSR標記通常位于基因組中的非轉(zhuǎn)錄區(qū), 被認為是“中性“標記, 不具備明顯的生物學功能。因此, 理論上尋找與形態(tài)學性狀高度相關(guān)的SSR標記存在很大難度。本研究通過Mantel檢驗發(fā)現(xiàn)品種間的形態(tài)學性狀相似系數(shù)與SSR標記相似系數(shù)的相關(guān)性很弱(= 0.36), 說明供試的SSR標記暫時無法取代形態(tài)學性狀, 單獨用于花生品種的特異性鑒定。

近年來有多項研究表明, 分子標記和形態(tài)學性狀可在植物分類[13]、品種鑒別[14]和遺傳多樣性分析[15-16]中起到互補作用, 尤其對種子真實性鑒定、同種異名和異種同名鑒別[17-18]。理論上, 常規(guī)雜交育種過程中, 親本染色體的重組、交換使雜交后代在遺傳組成上幾乎有無限多的可能性。但由于品種的選育多集中在產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性、株型等性狀上, 導(dǎo)致與上述性狀連鎖緊密的DNA標記位點的多態(tài)性降低。然而在花生基因組中仍存在著大量與上述性狀不在同一染色體上或連鎖不緊密的DNA標記位點, 其多態(tài)性可以將通過常規(guī)雜交育種手段選育出的品種區(qū)分開。例如本研究中用形態(tài)學性狀沒法將“粵油7號”和“粵油410”區(qū)分開, 但用SSR標記則能清晰地鑒定出來。但DNA標記在品種的特異性鑒定上并非萬能, 對于一些突變體, 特別是點突變體, 有時就無法利用DNA標記區(qū)分開[17]。相反, 這時根據(jù)表型突變性狀, 能輕易與其他品種區(qū)分開。例如本研究中SSR標記無法區(qū)分突變體“汕油誘1號”和“汕油輻1號”, 通過形態(tài)學性狀則可輕易將其區(qū)分開。因此, 綜合形態(tài)學信息和DNA標記信息能有效提高品種特異性鑒定的準確性。

4 結(jié)論

南方花生區(qū)試品種形態(tài)學性狀的遺傳多樣性比SSR標記低, 同一育種單位或者同一省份的品種傾向于聚在一起?；ㄉ鶶SR標記與形態(tài)學性狀不具備足夠的相關(guān)性, 暫時無法取代形態(tài)學性狀單獨用于品種特異性鑒定, 但兩者相結(jié)合能有效提高花生品種特異性鑒定的準確性。

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Genetic diversity analysis and distinctness identification of peanut cultivars based on morphological traits and SSR markers

LIU Hong1,**, XU Zhen-Jiang1,**, RAO De-Hua1, LU Qing2,3, LI Shao-Xiong2,3, LIU Hai-Yan2,3, CHENXiao-Ping2,3, LIANG Xuan-Qiang2,3, and HONG Yan-Bin2,3,*

1College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China;2Crops Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, Guangdong, China;3Guangdong Provincial Key Laboratory of Crops Genetics and Improvement, Guangzhou 510640, Guangdong, China

The genetic diversity and distinctness of 101 peanut varieties participated in the South China peanut field trial were analyzed based on their morphological traits and SSR markers. Among 29 morphological traits seven were no difference while 22 demonstrated diversity indexes ranging from 0.23 to 0.77, with an average of 0.43. The varieties were divided into seven groups at the similarity coefficient of 0.76, and those released by the same breeding institution tended to converge into one cluster. Molecular characterization with 40 highly informative SSRs generated a total of 167 alleles ranging from 2 to 6 (averaged 4.18) alleles per marker. The polymorphism information content (PIC) of these markers varied from 0.79 to 0.26 with an average of 0.55/marker. The varieties were divided into six groups based on the similarity coefficient of 0.70, and those released by the same province tended to converge into one cluster. Mantel testing revealed that the correlations of the similarity coefficient matrixes between the morphological traits and SSR markers were weak (= 0.36), implying that SSR markers are unable to replace morphological traits to be solely adopted to identify the distinctness of peanut varieties, but the combination of morphological traits and SSR markers will effectively increase the accuracy of distinctiveness identification.

peanut; morphology; SSR; genetic diversity; DUS

2018-04-27;

2018-08-20;

2018-09-19.

10.3724/SP.J.1006.2019.84060

通信作者(Corresponding author): 洪彥彬, E-mail: hongyanbin@gdaas.cn

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

劉洪, E-mail: laoliuhongscau@163.com; 徐振江, E-mail: zhenjiangxu521@scau.edu.cn

本研究由國家自然科學基金項目(31771841), 2015年品種資源保護項目(2015-18), 廣東省科技計劃項目(2013B020301014, 2013B050800021, 2017A030311007, 2016B020201003, 2015A030313565)和廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新聯(lián)盟建設(shè)項目(2016LM3161)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31771841), 2015 Variety Resource Protection Project (2015-18), Science and Technology Plan Project of Guangdong Province (2013B020301014, 2013B050800021, 2017A030311007, 2016B020201003), and Modern Agricultural Science and Technology Innovation Alliance Construction Project of Guangdong Province (2016LM3161).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180918.1354.008.html