鄭 旭,顧麗麗,李 翀,韓燕燕

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300000)

據(jù)統(tǒng)計全世界育齡夫婦中有10%-15%患有不育[1]。遺傳學(xué)因素是導(dǎo)致不育的重要因素之一。其中染色體病,包括性染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常、常染色體倒位、易位等在無精癥患者中可高達(dá)20%,在少精子癥患者中也可達(dá)8%[2]。遺傳因素導(dǎo)致的精子畸形同樣是男性不育重要致病原因。除男性克氏征外,Y染色體微缺失占男性不育第2位。Y染色體微缺失檢測的定位于Y染色體長臂上(Yq11)的無精子癥因子(azoospermiafactor,AZF),存在多種與精子生成相關(guān)的關(guān)鍵基因位點[3]。本文主要研究天津地區(qū)男性不育患者中染色體變異和Y染色體微缺失類型及頻率,分析兩者聯(lián)合檢測的意義,為臨床提供更詳盡的診斷及治療依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

挑選 2018年1月— 2018年12月到天津中醫(yī)一附院門診就診的130例嚴(yán)重少弱精癥和無精癥患者,120例配偶有不良妊娠史患者,排除睪丸炎、輸精管道梗阻以及炎癥性輸精管梗阻等病因?；颊吣挲g在20-48歲之間,平均(31.1±5.6)歲,篩選出 130例為生精障礙組,年齡21-45歲,平均(31.6±5.9)歲；120例為配偶不良妊娠組,年齡 22-46歲,平均(32.3±6.4)歲；60例同期門診精液常規(guī)檢查正常者為對照組,年齡23-49歲,平均(32.7±6.1)歲。3組患者年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1精液分析 按照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊(第5版)》[4]的精液分析標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行,精液離心沉淀涂片顯微鏡檢查,計算機(jī)輔助精液技術(shù)分析：所有受檢者均常規(guī)進(jìn)行至少2次精液分析檢查,對鏡檢未發(fā)現(xiàn)精子的受檢者3次精液離心沉淀后仍未發(fā)現(xiàn)精子者定義為無精子癥；精子濃度<15×106/ml時為少精子癥。將無精子癥和少精子癥統(tǒng)稱為生精障礙組。

1.2.2染色體核型檢查 抽取患者外周血3 ml,進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng),常規(guī)G顯帶方法制備染色體標(biāo)本,分析計數(shù)20個中期分裂相,分析4-5個核型。結(jié)果分析按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(2009)[5]進(jìn)行。

1.2.3實時熒光PCR方法檢測 Y染色體微缺失檢測試劑盒由上海透景生命科技有限公司提供,實時熒光PCR擴(kuò)增檢測Y染色體AZF區(qū)域內(nèi)的6個序列標(biāo)簽位點,即AZFa區(qū)：SY84,SY86；AZFb區(qū)：SY127,SY134；AZFc區(qū)：SY254,SY255。內(nèi)對照為ZFX/ZFY基因和SRY基因。采用伯樂CFX-96熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增程序：第一階段：50℃ 2 min,1個循環(huán)；第二階段：95℃ 5 min,1個循環(huán)；第三階段：95℃ 15 s,60℃ 35 s,72℃ 30 s,38個循環(huán)；第四階段：72℃ 5 min,1個循環(huán)。在第三階段收集 FAM/VIC/ROX/ Cy5熒光信號。當(dāng)結(jié)果為典型的S型擴(kuò)增曲線且Ct<32表示存在,否則表示缺失。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用 SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件,計數(shù)資料選用χ2檢驗比較各組染色體異常率和Y染色體AZF基因微缺失檢出率,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體異常核型檢出率及分布

130例男性生精障礙患者中,14例(10.77%)染色體出現(xiàn)異常,其中 36例(27.69%)表現(xiàn)為染色體多態(tài)性。120例配偶不良妊娠組中,4例(3.33%)染色體出現(xiàn)異常,42例(35%)為染色體多態(tài)性改變。60例精液正常對照組中,無染色體異?；颊?7例(11.67%)為染色體多態(tài)性改變。染色體異常情況具體見表1。染色體異常在生精障礙組與對照組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.263,P<0.05)。染色體多態(tài)改變在生精障礙組、配偶不良妊娠組與對照組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.007,P<0.05;χ2=6.751,P<0.05)。見表2。

表1 各組染色體異常核型情況(例)

表2 3組間異常染色體發(fā)生率比較[n(%)]

*與正常對照組比較,P<0.05；#與配偶不良妊娠組比較,P<0.05；△與配偶不良妊娠組比較,P>0.05

2.2 各組中Y染色體微缺失的類型

根據(jù)歐洲男性協(xié)會(European Academy of andrology,EAA)和歐洲分子遺傳實驗質(zhì)控網(wǎng)(European molecular genetics quality network,EMQN)推薦標(biāo)準(zhǔn),本方法可判斷AZFa、AZFb、AZFc,共3個區(qū)域,6個STS的微缺失,設(shè)置兩個內(nèi)對照基因,男性性別決定基因(Sex．determining region of the chromosome,SRY)和編碼鋅指蛋白基因(Zinc finger protein,X—linked,ZFX；zinc finger protein．X—linked,ZFY)。在對照組中,未發(fā)現(xiàn)AZF異常。生精障礙組12例(12/130,9.23%)存在微缺失,配偶異常妊娠組8例(8/120,6.67%)存在微缺失,組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.582,P>0.05)。其中AZFa缺失只出現(xiàn)在生精障礙組中,配偶不良妊娠組與生精障礙組均以AZFc缺失為主,分別占比例是9例(9/12,75%)和7例(7/8,87.5%)。見表3。Y染色體缺失類型(圖略)。

表3 Y染色體微缺失類型(例)

2.3 Y染色體微缺失合并染色體異常核型情況分析

Y染色體微缺失患者共有20例,其中合并染色體異常的有7例,(7/20,35%),包括4種異常核型,都和性染色體異常相關(guān)。AZFc缺失的比例最高 75%(15/20)。其余染色體異?；颊叩腨染色體微缺失位點均存在,未見缺失。見表4。

表4 Y染色體微缺失合并染色體核型分析結(jié)果

3 討論

30%的男性不育由遺傳因素引起,男性不育與遺傳因素密切相關(guān)[6]。染色體數(shù)目異常、結(jié)構(gòu)異常和多態(tài)性變異是常見的導(dǎo)致男性不育的遺傳因素[7]。本研究中生精障礙組患者中異常染色體的檢出率為10.77%,而正常對照組中未見染色體異常核型。結(jié)果表明精液情況差導(dǎo)致染色體異常核型檢出率提高,尤其是性染色體的異常,如克氏征等對生精功能影響最大,這與Castro A[8]報道相符。在染色體核型異常中,克氏(Klinefelter)綜合征 (47,XXY)最常見,也稱先天性睪丸發(fā)育不全或原發(fā)性小睪丸癥。以睪丸發(fā)育障礙和不育為主要特征,體征呈女性化傾向,大部分人無胡須、無喉結(jié)、體毛稀疏、陰毛呈女性分布。本文發(fā)現(xiàn)染色體畸變患者18例,其中10人為克氏綜合征,占55.56%,均表現(xiàn)為無精癥或少精癥。證實性染色體異常是引起男性生精障礙的重要原因。與張永科等[9]報道一致。染色體畸變中發(fā)生率僅次于克氏綜合征的為Y染色體倒位,占22.22%。本研究中生精障礙組患者染色體多態(tài)性改變占27.69%,明顯高于對照組的11.67%(P<0.05)。說明染色體多態(tài)性改變可能對精子產(chǎn)生及功能有一定影響,目前仍需加大樣本,進(jìn)一步研究證實。

此外,本研究還發(fā)現(xiàn)配偶不良妊娠組患者的異常核型檢出率3.33%,多態(tài)核型檢出率為35%。一直以來,女性因素被認(rèn)為是不孕不育的主要原因,而近幾年的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在約50%的不孕不育夫婦中,男方因素是主要或者協(xié)同因素[10-12]。與本研究結(jié)果一致。提示配偶異常妊娠男性染色體核型分析檢測更應(yīng)引起特別重視。

Y染色體上的無精子癥因子(AZF)與精子發(fā)生相關(guān),AZF基因可分為AZFa、AZFb、AZFc三個區(qū)域,一個或幾個區(qū)域的微缺失都會使精子生成障礙,導(dǎo)致少精子癥或無精子癥[13],Y染色體微缺失是導(dǎo)致男性不育的第二大遺傳學(xué)因素。本研究采用的是PCR熒光探針法,與傳統(tǒng)的多重聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳法相比,PCR熒光探針法加樣例數(shù)多,每次可做48人份,節(jié)約時間與成本,準(zhǔn)確性高,操作標(biāo)準(zhǔn)化,是目前國內(nèi)外Y染色體微缺失檢測的首選方法[14]。

歐洲男科學(xué)會(EAA)和歐洲分子遺傳實驗質(zhì)控網(wǎng)(EMQN)推薦使用SY84,SY86,SY127,SY134,SY254,SY255位點作為Y染色體微缺失檢測位點,占?xì)W洲人群的 95%。AZFa的缺失非常罕見,僅占男性不育Y染色體微缺失中的3%左右,整個區(qū)域缺失多表現(xiàn)為唯支持細(xì)胞綜合征,為原發(fā)性無精子癥[15]。AZFb區(qū)和 AZFbc區(qū)缺失幾乎無精子癥,病理類型為SCOS綜合征或精子發(fā)生阻滯[16]。AZFabc區(qū)缺失表現(xiàn)為無精子癥；核型檢查通常是(46,XX male)或等臂雙著絲粒Y染色體(iso(Y)*)[17]。AZFc區(qū)域缺失患者臨床表型和睪丸組織學(xué)類型多種多樣,以無精子癥、嚴(yán)重少精子癥、精子數(shù)進(jìn)行性下降最為常見；多數(shù)患者有精子生成能力,可通睪丸穿刺獲得精子,但是其男性后代將遺傳這種AZFc微缺失。Y染色體微缺失檢測者這種篩查方法簡單無創(chuàng),對男性不育患者具有診斷和預(yù)防價值[18]。

本研究250例不育患者中共發(fā)現(xiàn)20例Y染色體微缺失,占8%。稍高于李美珠等[19]檢測的6.6%和陳琨發(fā)表的7.13%[20]。不同的民族、地區(qū)差異、納入研究樣本的標(biāo)準(zhǔn)以及標(biāo)本量的不一致,都會得出不一致的結(jié)果數(shù)據(jù)[21]。本研究中AZFa缺失1例,AZFa+b+c缺失1例,AZFb+c缺失3例,AZFc缺失15例。說明在天津地區(qū)AZFc缺失占多數(shù)。這與Sabbaghian M[22]的研究一致。本文中生精障礙組共發(fā)現(xiàn)12例Y染色體微缺失,配偶異常妊娠組也存在8例Y染色體微缺失。提示生精障礙組和配偶異常妊娠組Y染色體微缺失發(fā)生率均較高。20例Y染色體微缺失患者中合并染色體核型異常的有3例。提示這兩種檢測不能相互替代。由于染色體核型分析只能觀察到堿基對5Mb以上的問題,不能檢測到微缺失,所以染色體核型分析及Y染色體AZF微缺失聯(lián)合檢測是首選。本研究還發(fā)現(xiàn)1例罕見的男性性反轉(zhuǎn)患者,該患者社會性別為男性,染色體核型分析為46,XX,而Y染色體微缺失檢測結(jié)果為AZFa、AZFb、AZFc及男性性別決定基因(SRY基因)均存在缺失,屬于罕見類型,國內(nèi)外鮮有報道較少,其發(fā)病原因和治療原則尚不明確,有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,男性不育與染色體異常核型高度相關(guān),同樣與Y染色體微缺失密切相關(guān)。對男性無精子癥、少精子癥患者和配偶異常妊娠患者進(jìn)行常規(guī)染色體核型分析聯(lián)合Y染色體微缺失檢查是非常有必要的。這類患者中染色體異常核型概率大,其中Klinefelter綜合征患者所占比例較高,同時,Y染色體微缺失風(fēng)險也較高。對患者進(jìn)行聯(lián)合檢查可以使臨床醫(yī)生進(jìn)一步明確病因,進(jìn)而決定是否進(jìn)行輔助生殖,為是否需要進(jìn)行胚胎植入前診斷提供臨床幫助。所以,對男性不育癥患者應(yīng)進(jìn)行染色體核型分析、Y染色體微缺失聯(lián)合檢查,兩者相輔相成,是非常有意義、有必要的。