朱學(xué)偉，段偉那,2，陳明星*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，吉林 長(zhǎng)春130033；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，變應(yīng)性疾病的發(fā)病率增加，醫(yī)療支出加劇，給病患及社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。包括細(xì)菌超抗原，病毒以及大氣污染等外界環(huán)境因素變化對(duì)變應(yīng)性鼻炎的影響為我們提出新的問(wèn)題與挑戰(zhàn)。病毒廣泛存在于呼吸道，中國(guó)10歲以上人口EB病毒(EBv)感染率高達(dá)86%以上，是研究呼吸道變態(tài)反應(yīng)中不能忽視的外部因素[1]。近年來(lái)研究顯示，病毒感染不但與腫瘤有關(guān)而且與變應(yīng)性鼻炎及哮喘密切相關(guān)，可能是促進(jìn)變應(yīng)性鼻炎發(fā)生發(fā)展的重要病因之一[2]。本研究擬通過(guò)制備LMP-1重組質(zhì)粒，并滴鼻觀察其對(duì)變應(yīng)性鼻炎鼠模型鼻黏膜組織Th2方向的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-5以及IL-13影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠常規(guī)飼養(yǎng)于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄各20只，均為8-10周齡，體重在20-25 g， 12 h間斷照明。 LMP-1重組質(zhì)粒及脂質(zhì)體訂購(gòu)于中國(guó)公共蛋白及質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)室(Public Protein/Plasmid Library,China;PPL)。LMP-1插入片段大小為1 161 bp，Gene ID:378750。氫氧化鋁膠、卵清蛋白(ovalbumin，OVA) 均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。鼠IL-5抗體以及IL-13購(gòu)置于加拿大Biowen公司。免疫組織化學(xué)染色試劑盒為加拿大Boisynthesis Blotechnology公司產(chǎn)品。

1.2 分組40只BALB/c鼠分為2組，每組 20只，分別為：AR模型組、質(zhì)粒組。 兩組動(dòng)物模型均經(jīng)過(guò)3個(gè)階段，即第1階段腹腔注射基礎(chǔ)致敏，第2 階段滴鼻激發(fā)。第1階段腹腔注射，分別以20 μg OVA加鋁佐劑在于第0、7、14天進(jìn)行。腹腔注射后，進(jìn)行滴鼻激發(fā)，5% OVA滴鼻，每側(cè)10 μl，連續(xù)5天。第3階段AR模型組連續(xù)兩天給予20 μl空白脂質(zhì)體滴鼻，質(zhì)粒組連續(xù)兩天給予20 μl脂質(zhì)體包裹的質(zhì)粒(質(zhì)粒和脂質(zhì)體比例1∶2.5，濃度為0.25/μl)。給藥后進(jìn)行癥狀觀察：第2次鼻內(nèi)給予脂質(zhì)體滴鼻后，觀察計(jì)數(shù)每個(gè)小鼠1 h內(nèi)抓鼻及噴嚏次數(shù)，并用攝像機(jī)進(jìn)行攝錄。

1.3 免疫組織化學(xué)方法

第2次鼻內(nèi)給藥后1天，處死小鼠，獲取新鮮鼻甲，鼻中隔黏膜組織。鼻黏膜組織經(jīng)10%的甲醛固定、脫鈣、包埋、切片，進(jìn)行蘇木素一伊紅染色，觀察嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況。計(jì)數(shù)方法采用3個(gè)隨機(jī)200倍視野下的平均數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

獲得的鼻黏膜組織切片經(jīng)10%的山羊血清封閉后，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色分析。IL-5以及IL-13的免疫組織化學(xué)操作參照免疫組化試劑盒進(jìn)行。結(jié)果分析采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行，結(jié)果計(jì)算5個(gè)200倍視野下的陽(yáng)性細(xì)胞光密度值。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。染色細(xì)胞比例超過(guò)25%計(jì)為表達(dá)陽(yáng)性。光密度值×陽(yáng)性面積值/100=表達(dá)指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05被視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組40個(gè)小鼠經(jīng)OVA滴鼻后均產(chǎn)生噴鼻及抓鼻的過(guò)敏性鼻炎的癥狀。HE染色結(jié)果顯示，LMP-1重組質(zhì)粒組小鼠鼻黏膜組織產(chǎn)生大量的嗜酸性粒細(xì)胞聚集，與AR模型組對(duì)照比較結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)。免疫組化結(jié)果證實(shí)LMP-1重組質(zhì)粒鼻內(nèi)刺激變應(yīng)性鼻炎鼠模型鼻黏膜上皮細(xì)胞中IL-5以及IL-13高表達(dá)，表達(dá)指數(shù)與AR模型組對(duì)照比較結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組動(dòng)物模型嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及IL-5以及IL-13表達(dá)指數(shù)結(jié)果比較

3 討論

病毒感染對(duì)呼吸道過(guò)敏性疾病的影響有兩個(gè)方面:“保護(hù)作用”和“增強(qiáng)作用”。兩個(gè)方面并不沖突而是在變應(yīng) 性鼻炎不同階段的不同作用?！氨Ｗo(hù)作用”指許多研究表明個(gè)體早期病毒感染可以減少過(guò)敏發(fā)展的機(jī)會(huì)，這一觀點(diǎn)被衛(wèi)生假說(shuō) (“hygiene hypothesis”)所支持。其“增強(qiáng)作用”指包括鼻病 毒(rhinovirus)及EB病毒感染會(huì)放大氣道過(guò)敏的臨床癥狀。Contoli M等[3]發(fā)現(xiàn)變應(yīng)性性鼻炎患者在鼻病毒RV-16病毒株的感染后,復(fù)制數(shù)量與鼻黏膜上皮細(xì)胞IL-4 mRNA水平增加具有相關(guān)性。鼻病毒通過(guò)對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞TLR3表達(dá)的抑制及細(xì)胞信號(hào)IRF通路抑制，限制了機(jī)體對(duì)RV-16防御免疫反應(yīng)的強(qiáng)度,增加鼻變態(tài)反應(yīng)Th2方向的主要細(xì)胞 因子IL-4和IL-13水平。英國(guó)的Cakebread JA等[4]發(fā)現(xiàn)鼻病毒感染誘 導(dǎo)的炎癥可導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞Th2炎性細(xì)胞因子IP-10， IL-8和 GM-CSF的釋放，進(jìn)而放大變態(tài)反應(yīng)強(qiáng)度。

可見(jiàn)，病毒感染對(duì)呼吸道病毒感染Th2方向的細(xì)胞因子及變態(tài)反應(yīng)有明確的促進(jìn)及增強(qiáng)作用。EB病毒及其特征蛋白 LMP-1促進(jìn)細(xì)胞 HMGB1表達(dá)，而 HMGB1 促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞存活，是調(diào)控鼻變態(tài)反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)之前的研究顯示，EB病毒主要病毒基因LMP-1 DNA水平與鼻黏膜上皮細(xì)胞的促進(jìn)變態(tài)反應(yīng)的水平具有相關(guān)性。Th2方向的變態(tài)反應(yīng)強(qiáng)度與鼻黏膜上皮細(xì)胞TSLP的表達(dá)水平也具有相關(guān)性[5]。鼻黏膜上皮細(xì)胞是啟動(dòng)鼻變態(tài)反應(yīng)的關(guān)鍵靶細(xì)胞，之前相關(guān)研究也證實(shí)，小核酸CpG通過(guò)滴鼻也會(huì)促進(jìn)動(dòng)物模型鼻變態(tài)反應(yīng)的強(qiáng)度[6]?？傊?，本研究證實(shí)鼻黏膜上皮細(xì)胞EB病毒重要基因LMP-1感染可能參與鼻變態(tài)反應(yīng)的誘導(dǎo)、增強(qiáng)作用，其機(jī)制可能是EB病毒LMP-1通過(guò)刺激釋放鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)的Th2方向的免疫細(xì)胞因子IL-5以及IL-13進(jìn)行調(diào)節(jié)。