毛 君，付 珺

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院 1.甲狀腺乳腺外科；2.胸外科，湖北 武漢430014)

乳腺癌(BC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，是女性因癌癥致死的主要原因之一[1]。雖然BC在診斷儀器及標(biāo)準(zhǔn)化診斷方法上取得了很大進(jìn)展，但BC細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移仍是臨床診斷及治療的一大挑戰(zhàn)[2]。因此，研究乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的重要分子機(jī)制對(duì)BC的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。microRNAs(miRNAs)是一類約含17-25個(gè)核苷酸的具有調(diào)控功能的非編碼RNA大家族，成熟的miRNAs通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯[3]。研究顯示，miR-33a參與多種生理病理過程，包括新陳代謝、細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生及發(fā)展等[4]。在肺癌[5]、乳腺癌[6]、胰腺癌[7]及骨肉瘤[8]中，miR-33a均被證明通過靶向多個(gè)致癌基因而充當(dāng)抑癌因子的角色。而對(duì)于乳腺癌細(xì)胞，miR-33a的相關(guān)研究還未涉及詳盡的細(xì)胞增殖、遷移實(shí)驗(yàn)，且其相關(guān)機(jī)制也亟待說明。本課題通過上調(diào)BC細(xì)胞MDA-MB-231中miR-33a-5p的表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，并探討相關(guān)作用機(jī)制，旨在為BC的臨床診斷及治療奠定充分的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑

人正常乳腺上皮細(xì)胞HBL-100及4種乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7、T-47D和BT-474均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。DMEM及胎牛血清購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；增強(qiáng)miR-33a-5p表達(dá)的特異性序列miR-33a-5p mimics及其陰性對(duì)照(miR-NC)、S1PR1過表達(dá)慢病毒載體(pLV-S1PR1)及空質(zhì)粒(pLV-NC)以及含野生型(WT)和突變型(MUT)S1PR1 3′UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并提供；總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRTMGreen PCR Master Mix購自美國Thermo Fisher Scientific公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；全蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；兔抗S1PR1一抗以及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

人正常乳腺上皮細(xì)胞HBL-100及4種乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7、T-47D和BT-474經(jīng)復(fù)蘇后均接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 g/mL鏈霉素的DMEM中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中；當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到85%左右時(shí)，0.25%胰酶消化處理，反復(fù)吹打呈單細(xì)胞懸液后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待生長狀態(tài)良好時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR檢測人正常乳腺上皮細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞株中miR-33a-5p及S1PR1的水平

取處于對(duì)數(shù)生長期的5種細(xì)胞(HBL-100、MDA-MB-231、MCF-7、T-47D和BT-474)各約1.0×105個(gè)，同步化處理后接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞采用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，后取2 μg的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA單鏈。取2 μl的cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系為20 μl，包含2 μl的cDNA、10 μl的SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μl以及7 μl的滅菌水。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共35個(gè)循環(huán)。分別選擇U6和GAPDH為miR-33a-5p及S1PR1的內(nèi)參基因，所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成(見表1)。兩指標(biāo)在不同細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算，miR-33a-5p指標(biāo)ΔΔCT=(CTmiR-33a-5p-CTU6)癌細(xì)胞-(CTmiR-33a-5p-CTU6)正常細(xì)胞；S1PR1指標(biāo)ΔΔCT=(CTS1PR1-CTGAPDH)癌細(xì)胞-(CTS1PR1-CTGAPDH)正常細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。并對(duì)miR-33a-5p及S1PR1在4種癌細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。

表1 PCR引物序列

1.4 生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)分別預(yù)測、驗(yàn)證miR-33a-5p與S1PR1的靶向關(guān)系

采用Targetscan在線分析軟件預(yù)測miR-33a-5p與S1PR1的靶向關(guān)系。同時(shí)采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該關(guān)系：取生長對(duì)數(shù)期的MDA-MB-231細(xì)胞，用胰酶消化處理，反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，24孔板中每孔接種5.0×104個(gè)細(xì)胞，約200 μl；12 h后，分別向MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimics和miR-NC；24 h后，再將0.2 μg 含S1PR1-3′UTR-WT序列或S1PR1-3′UTR-MUT序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中；繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，棄取舊培養(yǎng)基，添加新鮮的含10%胎牛血清的DMEM再培養(yǎng)24 h；細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次，棄盡洗液，每孔加200 μL的細(xì)胞裂解液，振蕩15 min，在4℃、1000×g條件下離心5 min，吸取上清液加入到避光的24孔板中；按雙熒光素酶檢測試劑盒說明，在多功能酶標(biāo)儀上檢測并計(jì)算相對(duì)熒光素酶的活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blot檢測miR-33a-5p表達(dá)調(diào)控對(duì)S1PR1表達(dá)的影響

根據(jù)上述結(jié)果，進(jìn)一步在細(xì)胞水平上驗(yàn)證miR-33a-5p的表達(dá)調(diào)控對(duì)S1PR1的表達(dá)是否有影響：MDA-MB-231細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分3組，即對(duì)照組(Control)、miR-33a-5p-NC組及miR-33a-5p mimics組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞提取總蛋白，后進(jìn)行濃度檢測；取20 μg蛋白和4 μl 2×SDS上樣緩沖液混合均勻，100℃變性10 min；上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上；用5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜；PBS洗膜后分別加入兔一抗(S1PR1，1∶1000；GAPDH，1∶1500)在4℃下，孵育過夜；PBS洗膜；加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶2500)室溫孵育0.5 h；PBS洗膜；用ECL化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，后采用Quantity One圖像處理軟件對(duì)灰度值進(jìn)行半定量分析。

1.6 MTT檢測細(xì)胞增殖能力

分別取生長處于對(duì)數(shù)期的5組MDA-MB-231細(xì)胞(miR-NC組、miR-33a-5p mimics組、pLV-NC組、pLV-S1PR1組以及miR-33a-5p mimics+pLV-S1PR1組)進(jìn)行同步化操作后，按照1.0×105/ml濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔。37℃，5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄盡培養(yǎng)基，每孔加入50 μl濃度為5 g/L的二苯基溴化四氮唑藍(lán)(MTT)繼續(xù)孵育4 h，后每孔加入200 μl的二甲基亞楓(DMSO)終止培養(yǎng)。然后應(yīng)用酶標(biāo)儀測量每孔在490 nm處的吸光度(OD)并進(jìn)行比較分析。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

同上述1.6，此部分細(xì)胞實(shí)驗(yàn)同樣分5組：miR-NC組、miR-33a-5p mimics組、pLV-NC組、pLV-S1PR1組以及miR-33a-5p mimics+pLV-S1PR1組。取生長處于對(duì)數(shù)期的各組細(xì)胞，同步化操作后將各組細(xì)胞制成細(xì)胞密度為1.0×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液加入到24孔板中，每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，過夜培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞；后用槍頭在單層細(xì)胞上輕輕畫一道橫線，用PBS洗去脫落的細(xì)胞，顯微鏡下拍照記錄初始(0 h)劃痕寬度，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，再次在顯微鏡下拍照記錄劃痕寬度并計(jì)算、比較劃痕愈合率。劃痕愈合率與細(xì)胞的遷移能力呈正相關(guān)，劃痕愈合率(%)=0 h的劃痕寬度-24 h的劃痕寬度)/0 h的劃痕寬度×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-33a-5p與S1PR1在乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及相關(guān)性

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示(圖1A)，與人正常乳腺上皮細(xì)胞HBL-100比較，miR-33a-5p在4種乳腺癌細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)，而S1PR1在4種癌細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05；P<0.01)；選擇miR-33a-5p與S1PR1表達(dá)量變化最顯著的MDA-MB-231細(xì)胞為后期實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)研究對(duì)象。相關(guān)性分析結(jié)果顯示(圖1B)，miR-33a-5p與S1PR1在4種癌細(xì)胞株中的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.994；P=0.006<0.01)，提示二者可能存在潛在的調(diào)控關(guān)系。

A：miR-33a-5p與S1PR1在4種乳腺癌細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量，與正常HBL-100細(xì)胞組比較，*P<0.05，**P<0.01，##P<0.01；B：miR-33a-5p與S1PR1在4種乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)相關(guān)性分析，P<0.01。

圖1 miR-33a-5p與S1PR1在乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及相關(guān)性

2.2 miR-33a-5p與S1PR1靶向關(guān)系預(yù)測及驗(yàn)證

生物信息學(xué)軟件TargetScan分析結(jié)果顯示(圖2A)，miR-33a-5p與S1PR1的3'UTR有一個(gè)保守的結(jié)合位點(diǎn)；雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定了兩者的靶向關(guān)系關(guān)系，結(jié)果顯示，與miR-33a-5p-NC組比較，miR-33a-5p mimics顯著降低了野生型(WT)S1PR1質(zhì)粒熒光素酶的活性(P<0.01)；而miR-33a-5p mimics對(duì)突變型(MUT)S1PR1質(zhì)粒熒光素酶的活性無影響，提示S1PR1上確實(shí)存在miR-33a-5p的結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示(圖2B)，與miR-33a-5p-NC組比較，miR-33a-5p mimics顯著降低了MDA-MB-231細(xì)胞中S1PR1蛋白的表達(dá)(P<0.01)，提示過表達(dá)miR-33a-5p能顯著降低MDA-MB-231細(xì)胞中S1PR1蛋白的表達(dá)。

A：miR-33a-5p與S1PR1靶向關(guān)系預(yù)測，與S1PR1-WT組比較，**P<0.01；B：Western blot驗(yàn)證miR-33a-5p與S1PR1的靶向關(guān)系，與正常miR-33a-5p-NC組比較，**P<0.01。

圖2 miR-33a-5p與S1PR1靶向關(guān)系預(yù)測及驗(yàn)證

2.3 miR-33a-5p與S1PR1對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

將miR-33a-5p mimics和pLV-S1PR1分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后采用MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖能力。如圖3所示，48 h時(shí)，與miR-NC組比較，miR-33a-5p mimics顯著抑制細(xì)胞增殖(P<0.01)；與pLV-NC組比較，pLV-S1PR1顯著促進(jìn)了細(xì)胞增殖(P<0.01)；而與miR-33a-5p mimics和pLV-S1PR1組比較，miR-33a-5p mimics與pLV-S1PR1聯(lián)合轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力分別顯著增加和降低(均P<0.01)。由此提示miR-33a-5p與S1PR1分別能抑制和促進(jìn)細(xì)胞增殖，且miR-33a-5p對(duì)S1PR1的增殖促進(jìn)作用產(chǎn)生一定的抑制影響。

與miR-NC組比較，**P<0.01；與miR-33a-5p-mimics組比較，&&P<0.01；與pLV-NC組比較，##P<0.01；與pLV-S1PR1組比較，$$P<0.01。

圖3 miR-33a-5p與S1PR1對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 miR-33a-5p與S1PR1對(duì)細(xì)胞增殖遷移的影響

將miR-33a-5p mimics和pLV-S1PR1分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后采用劃痕法檢測各組細(xì)胞的遷移能力。如圖4所示，24 h后統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞劃痕愈合率，與miR-NC組比較，miR-33a-5p mimics組細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低(P<0.01)；與pLV-NC組比較，pLV-S1PR1細(xì)胞劃痕愈合率顯著增加(P<0.01)；而與miR-33a-5p mimics和pLV-S1PR1組比較，miR-33a-5p mimics與pLV-S1PR1聯(lián)合轉(zhuǎn)染組細(xì)胞劃痕愈合率分別顯著增加和降低(均P<0.01)。由此提示miR-33a-5p與S1PR1分別能抑制和促進(jìn)細(xì)胞遷移，且miR-33a-5p對(duì)S1PR1的遷移促進(jìn)產(chǎn)生一定的抑制作用。

3 討論

近年來的研究表明，miRNAs的異常表達(dá)參與了腫瘤的進(jìn)展；這些miRNAs通過抑制靶基因發(fā)揮

與miR-NC組比較，**P<0.01；與miR-33a-5p-mimics組比較，&&P<0.01；與pLV-NC組比較，##P<0.01；與pLV-S1PR1組比較，$$P<0.01。

圖4 miR-33a-5p與S1PR1對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

功能，在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、血管內(nèi)灌注、存活、外滲和定植的協(xié)調(diào)中發(fā)揮重要作用[9]。因此，特異性miRNA及其參與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)的鑒定，將為尋找新的腫瘤防治診斷和治療靶點(diǎn)提供重要線索。有趣的是，Blenkiron等人的微列陣分析結(jié)果顯示，miR-33a在人乳腺癌中經(jīng)常丟失[10]。Zhang等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組織比較，miR-33a在人乳腺癌癌組織中呈顯著低表達(dá)；此外，在乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)miR-33a表達(dá)降低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增加之間存在相關(guān)性[11]。而本研究結(jié)果顯示，與正常乳腺上皮細(xì)胞比較，miR-33a在多種乳腺癌細(xì)胞株中呈顯著低表達(dá)；且體外實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)miR-33a能顯著降低乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖和遷移。因此，我們的研究確定miR-33a是乳腺癌轉(zhuǎn)移中的抑癌基因。

鞘氨醇1磷酸酯受體1(S1PR1)被報(bào)道參與調(diào)節(jié)癌癥的生長、侵襲、遷移和耐輻射等特性[12]。例如，Li等人顯示S1PR1可介導(dǎo)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[13]。Bao等人發(fā)現(xiàn)過表達(dá)S1PR1能夠促進(jìn)人肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲[14]。重要的是，Zhang等人也認(rèn)定miR-148a直接靶向作用于S1PR1參與肝癌細(xì)胞侵襲的調(diào)控[15]。此外，在乳腺癌細(xì)胞中，Wu等發(fā)現(xiàn)miR-542同樣靶向作用于S1PR1進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞的增殖和侵襲[16]。這些結(jié)果支持了我們目前的發(fā)現(xiàn)，并提出miR-33a-5p通過下調(diào)S1PR1介導(dǎo)抑癌的潛在機(jī)制。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與正常乳腺上皮細(xì)胞比較，miR-33a-5p和S1PR1在多種乳腺癌細(xì)胞中分別呈顯著低表達(dá)和高表達(dá)，且二者在癌細(xì)胞株的表達(dá)存在顯著相關(guān)性。緊接著，我們預(yù)測了二者的靶向關(guān)系，提示S1PR1為miR-33a-5p的潛在作用靶標(biāo)，熒光素酶報(bào)告基因同樣證明了這一預(yù)測結(jié)果，且進(jìn)一步的Western blot實(shí)驗(yàn)證明了miR-33a-5p對(duì)S1PR1的表達(dá)調(diào)控作用。此外，miR-33a-5p的過表達(dá)能抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖和遷移能力。這些結(jié)果暗示miR-33a-5p可能在如乳腺癌的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。同樣，基于二者的靶向關(guān)系，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了S1PR1過表達(dá)能提升乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖和遷移能力，且miR-33a-5p過表達(dá)能顯著減弱S1PR1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖和遷移能力的促進(jìn)作用；說明miR-33a-5p對(duì)S1PR1的靶向抑制是乳腺癌生物學(xué)特征發(fā)生改變的基礎(chǔ)。

綜上所述，我們的研究結(jié)果顯示miR-33a-5p是一種乳腺癌抑制基因，同時(shí)S1PR1為miR-33a-5p的重要靶基因且能被其顯著下調(diào)。我們的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)過表達(dá)miR-33a-5p和S1PR1分別顯著抑制、促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移；且miR-33a-5p能削弱S1PR1對(duì)癌細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)能力。因此，miR-33a-5p可能通過靶向S1PR1引起乳腺癌細(xì)胞遷移和增殖能力的改變，可作為乳腺癌細(xì)胞靶向分子治療的潛在靶點(diǎn)，也為后期進(jìn)一步進(jìn)行的詳盡機(jī)制研究奠定了理論基礎(chǔ)。