楊黎鴻，徐迎陽，關(guān) 凱，李俊達(dá)，李麗莎，王子熹，崔 樂

職業(yè)性呼吸道過敏性疾病指從業(yè)者在接觸工作環(huán)境中的職業(yè)性有害物質(zhì)而引起的氣道變態(tài)反應(yīng)性疾病，可以表現(xiàn)為過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、氣道高反應(yīng)、工作相關(guān)性哮喘等。通?？蓪⒄T發(fā)職業(yè)性呼吸道過敏性疾病的有害物質(zhì)按照分子量分為兩大類[1-3]：一類為高分子量物質(zhì)，多為蛋白質(zhì)及糖肽，如動物性或植物性產(chǎn)品、真菌、蛋白酶等，它們通過IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)而誘發(fā)氣道癥狀，也是引發(fā)職業(yè)性呼吸道過敏性疾病的主要致敏物質(zhì)。另一類為低分子量物質(zhì)，如二異氰酸鹽、酸酐類、丙烯酸單體、金屬鹽類、藥物等，其中少部分可作為半抗原，通過與血清白蛋白結(jié)合而引發(fā)I型變態(tài)反應(yīng)，但大部分此類物質(zhì)的致病機(jī)制不清，但認(rèn)為與IgE無關(guān)。

隨著工業(yè)、經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，以及健康意識的不斷提高，可誘發(fā)職業(yè)性呼吸道過敏性疾病的變應(yīng)原種類不斷增加，也隨之得到更多的社會關(guān)注與重視。由于職業(yè)環(huán)境中暴露因素復(fù)雜，鑒定潛在致病變應(yīng)原并非易事。目前常用于鑒定變應(yīng)原的方法包括支氣管激發(fā)試驗(yàn)(包括實(shí)驗(yàn)室激發(fā)和作業(yè)現(xiàn)場激發(fā))、變應(yīng)原特異性IgE檢測以及皮膚試驗(yàn)。

鱟試劑主要用于檢測細(xì)菌內(nèi)毒素及真菌葡聚糖，被廣泛應(yīng)用于藥品及食品工業(yè)中。本文報(bào)道2例長期從事內(nèi)毒素檢測的實(shí)驗(yàn)室工作人員，在接觸鱟試劑后快速出現(xiàn)鼻結(jié)膜炎或哮喘表現(xiàn)，通過皮試及現(xiàn)場激發(fā)診斷為鱟試劑引發(fā)的職業(yè)性呼吸道過敏癥，并通過血清學(xué)實(shí)驗(yàn)初步分析了鱟試劑中的致敏蛋白條帶。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究2例可疑鱟試劑過敏患者來自北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科門診。試驗(yàn)前2例患者均簽署了知情同意書。2例患者為同一藥廠實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員，其主要工作內(nèi)容為使用鱟試劑檢測內(nèi)毒素，每日需配制鱟試劑6～40安瓿不等。

例1，女，32歲，從事鱟試劑相關(guān)工作10年。近半年患者反復(fù)在配制鱟試劑后出現(xiàn)發(fā)作性噴嚏、流涕伴鼻癢、眼癢，嚴(yán)重時有胸悶、喘息，常在接觸鱟試劑數(shù)分鐘至2 h內(nèi)發(fā)作，癥狀持續(xù)數(shù)十分鐘至數(shù)天不等，可自行緩解。患者平日換床單時可誘發(fā)噴嚏，未重視。既往診斷鎳金屬過敏，否認(rèn)其他特應(yīng)性疾病史。

例2，女，39歲，從事鱟試劑相關(guān)工作8年。近4年出現(xiàn)發(fā)作性噴嚏、流涕伴咳喘，癥狀均在配制鱟試劑后出現(xiàn)，初期僅有鼻癢、耳癢、眼癢，近3年加重并逐漸出現(xiàn)咳嗽、胸悶。脫離工作環(huán)境后數(shù)小時可自行緩解，按需使用沙丁胺醇?xì)忪F劑。既往患秋季花粉癥，蘋果、桃、櫻桃、芒果、榛子等多種食物過敏，青霉素過敏。

1例無特應(yīng)性疾病史的志愿者作為健康對照。

1.2 方法

吸入性變應(yīng)原皮內(nèi)試驗(yàn)：試劑均來自北京協(xié)和醫(yī)院變應(yīng)原制劑室，常規(guī)30項(xiàng)吸入變應(yīng)原包括室內(nèi)塵土、粉塵螨、夏秋季花粉Ⅰ、夏秋季花粉Ⅱ、春季花粉Ⅰ、春季花粉Ⅱ、春季花粉Ⅲ、多價真菌Ⅰ、多價真菌Ⅱ、多價真菌Ⅲ、大籽蒿、豚草、桑蠶絲、蕎麥皮、混合羽毛、狗毛、多價昆蟲、圓柏、蟑螂、枝孢芽枝菌、貓毛、白臘樹、地膚、臭椿、法國梧桐、葎草、互隔交鏈孢。陰性對照使用生理鹽水，陽性對照使用0.01 mg/ml磷酸組胺溶液，15 min后判讀結(jié)果[4]。

鱟試劑：采用2例患者所屬實(shí)驗(yàn)室提供的鱟試劑(湛江博康海洋生物有限公司，中國)。

鱟試劑皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)：將鱟試劑按配制步驟溶于0.1 ml去離子水中，稀釋成0.25 EU/ml，使用該稀釋液在2例患者及1例健康志愿者前臂屈側(cè)進(jìn)行皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)。陰性對照使用生理鹽水，陽性對照使用10 mg/ml磷酸組胺溶液，15 min后判讀結(jié)果。

鱟試劑現(xiàn)場激發(fā)試驗(yàn)：在配備搶救藥物和設(shè)備的激發(fā)單元分別對2例患者進(jìn)行鱟試劑現(xiàn)場激發(fā)試驗(yàn)?；颊吣M在實(shí)驗(yàn)室配制鱟試劑的過程：開啟6個安瓿，使用加樣器各加入純凈水0.1 ml，然后將配制好的鱟試劑運(yùn)送5 m距離(現(xiàn)實(shí)配制是在配制完成后放置于5 m外冰箱內(nèi))。整個操作大約持續(xù)10 min。記錄患者癥狀和體征，操作前和操作后15 min進(jìn)行肺功能檢測、鼻阻力。

鱟試劑蛋白電泳和免疫印跡：鱟試劑水溶液經(jīng)4%～12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，后使用考馬斯亮藍(lán)染色2 h，脫色至背景干凈。通過半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜于5%牛奶封閉2 h。PBST洗滌膜3次，每次5 min。使用PBST將患者血清按1∶4稀釋，加入膜上，4 ℃孵育過夜。孵育完成后PBST洗滌3次，每次5 min。加入HRP標(biāo)記的鼠標(biāo)抗人IgE(Abcam，ab99806)室溫孵育1 h。PBST洗滌3次，每次5 min。電化學(xué)發(fā)光法顯色。

2 結(jié)果

2.1 吸入性變應(yīng)原皮內(nèi)試驗(yàn)

例1常規(guī)30項(xiàng)吸入性變應(yīng)原皮內(nèi)試驗(yàn)提示粉塵螨、桑蠶絲陽性。

例2常規(guī)30項(xiàng)吸入性變應(yīng)原皮內(nèi)試驗(yàn)提示粉塵螨、夏秋季花粉Ⅰ、春季花粉Ⅱ、多價真菌Ⅲ、大籽蒿、圓柏、葎草、地膚陽性。

2.2 鱟試劑皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)

兩例患者鱟試劑皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)均為陽性，而健康對照鱟試劑皮試為陰性(圖1)。

2.3 鱟試劑現(xiàn)場激發(fā)試驗(yàn)

例1 患者在鱟試劑配制完成后6 min出現(xiàn)鼻癢、流涕，30 min出現(xiàn)眼癢，癥狀在1 h左右消失。例2 患者在鱟試劑配制完成后10 min出現(xiàn)鼻癢、眼癢，1 h出現(xiàn)咽癢、咳嗽、胸悶。未給予藥物治療，癥狀在1 h 20 min消失。1例健康對照在配制鱟試劑后無任何不適癥狀。

兩例患者通氣功能及鼻阻力檢查均未出現(xiàn)陽性改變。

2.4 蛋白電泳和免疫印跡

經(jīng)SDS-PAGE電泳，鱟試劑在相對分子質(zhì)量10 000～185 000間可見10余條蛋白條帶(圖2)。使用鱟試劑及2例患者血清進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果顯示例1血清IgE主要與相對分子質(zhì)量20 000、185 000蛋白條帶結(jié)合，例2血清IgE可與相對分子質(zhì)量20 000、25 000、40 000蛋白條帶結(jié)合(圖3)。健康對照者血清無明顯條帶出現(xiàn)。

2.5 轉(zhuǎn)歸

2例患者均被診斷為鱟試劑引發(fā)的職業(yè)性呼吸道過敏反應(yīng)。建議患者避免繼續(xù)接觸變應(yīng)原。但因個人原因，例1難以脫離接觸環(huán)境，囑其在日常鱟試劑配制過程中加強(qiáng)了個人防護(hù)，包括佩戴口罩及在生物安全柜中操作以減少變應(yīng)原的接觸。例2在確診后很少進(jìn)行鱟試劑相關(guān)操作。此后兩例患者極少在工作環(huán)境中再出現(xiàn)呼吸道過敏癥狀。

3 討論

鱟，是一種古老的海洋生物，主要分布于北美大西洋沿海及亞洲部分沿海地區(qū)[5]；通常也被稱為馬蹄蟹，體長可達(dá)60 cm，體重3～5 kg，體表覆蓋有幾丁質(zhì)外骨骼，頭胸部具有發(fā)達(dá)的馬蹄形背甲；平時鉆入海沙生活，退潮時在沙灘上步行。1956年Bang[6]首次報(bào)道了給鱟注射革蘭陰性菌后鱟很快因血液凝固而死，而后發(fā)現(xiàn)革蘭陰性菌細(xì)胞膜上的內(nèi)毒素激活了鱟血液中的一種酶。基于這一特點(diǎn)，鱟的血液凍干粉被制成鱟試劑，作為一個極敏感的測試內(nèi)毒素的方法被廣泛應(yīng)用。對于從事鱟試劑相關(guān)工作的職業(yè)者，它也可成為引發(fā)職業(yè)性呼吸道過敏性疾病的潛在病因。

圖 1鱟試劑皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)

Fig1Skin prick test with Tachypleus Amebocyte Lysate

圖 2 鱟試劑SDS-PAGE分析Fig 2 SDS-PAGE analysis of Tachypleus Amebocyte LysateMr:相對分子質(zhì)量

圖 3 免疫印跡結(jié)果Fig 3 Western blot of Tachypleus Amebocyte Lysate with patients’ sera其中條帶1為例1，條帶2為例2，條帶3為健康對照Mr:相對分子質(zhì)量

隨著工業(yè)化進(jìn)程，職業(yè)性呼吸道過敏癥已成為常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一。呼吸道過敏癥可以表現(xiàn)為過敏性鼻炎/結(jié)膜炎、支氣管哮喘，逾80%支氣管哮喘患者同時并發(fā)過敏性鼻炎，15%支氣管哮喘成人患者被認(rèn)為與工作接觸有關(guān)[7-8]，其中絕大多數(shù)證實(shí)為IgE介導(dǎo)[9]。呼吸道過敏癥的出現(xiàn)通常需要一定的致敏期，且致敏原多為高分子物質(zhì)。發(fā)生呼吸道過敏癥風(fēng)險較高的職業(yè)包括面包師、汽車油漆工、理發(fā)師和木材加工者，容易致病的過敏原包括小麥面粉、異氰酸鹽、過硫酸鹽、橡膠和醛類[10]。職業(yè)性呼吸道過敏癥除了疾病診斷外，最重要的是病因?qū)W診斷，可以采用皮膚試驗(yàn)(點(diǎn)刺試驗(yàn)或者皮內(nèi)試驗(yàn))、特異性IgE檢測、激發(fā)試驗(yàn)(變應(yīng)原鼻黏膜激發(fā)試驗(yàn)，變應(yīng)原支氣管激發(fā)試驗(yàn)，現(xiàn)場激發(fā)試驗(yàn)等)[11-12]。Li等[13]使用現(xiàn)場激發(fā)試驗(yàn)確診并在國內(nèi)首次報(bào)道吸入蜂王漿致職業(yè)性過敏性哮喘1例。

Ebner等[14]曾于1992報(bào)道過1例鱟試劑所致的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。與本文相似，該報(bào)道中患者亦為藥物實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員，主要從事內(nèi)毒素檢測工作。作者通過皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)及ELISA的方法確診患者為鱟試劑引發(fā)的IgE介導(dǎo)的I型變態(tài)反應(yīng)。

本文在國內(nèi)首次報(bào)道了鱟試劑這一罕見變應(yīng)原引發(fā)的呼吸道過敏反應(yīng)。2例患者分別是在接觸鱟試劑9年及4年后發(fā)病，主要表現(xiàn)為在配制鱟試劑后數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)的過敏性鼻炎、結(jié)膜炎及哮喘癥狀。鱟試劑皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)陽性，現(xiàn)場激發(fā)試驗(yàn)可誘導(dǎo)癥狀出現(xiàn)。提示這2例患者臨床表現(xiàn)為鱟試劑引發(fā)的I型變態(tài)反應(yīng)。鱟試劑現(xiàn)場激發(fā)試驗(yàn)中客觀觀測指標(biāo)(鼻阻力及肺功能)未能達(dá)到陽性診斷標(biāo)準(zhǔn)。出于患者安全考慮，本研究現(xiàn)場激發(fā)試驗(yàn)是在診室中完成，而非患者實(shí)際工作場所，可能導(dǎo)致患者變應(yīng)原暴露量及暴露時間低于實(shí)際工作場所，故而出現(xiàn)陰性結(jié)果。

2例患者分別并發(fā)粉塵螨、花粉過敏，提示職業(yè)性呼吸道過敏癥的出現(xiàn)可能與特應(yīng)性體質(zhì)密切相關(guān)[15-16]。2例患者均無蝦蟹等甲殼類食物過敏史，與Ebner報(bào)道[14]相似，未發(fā)現(xiàn)鱟試劑與甲殼類食物存在交叉過敏。即使在脫離存在致敏原的工作環(huán)境，部分職業(yè)性呼吸道過敏癥患者的癥狀也可能持續(xù)數(shù)年，這可能與延誤治療、氣道重塑以及非特異性炎癥相關(guān)，所暴露的職業(yè)變應(yīng)原復(fù)雜、具有特應(yīng)性體質(zhì)、特別是不能調(diào)離原工作環(huán)境、用藥不規(guī)范的患者往往預(yù)后很差[17]。此2例患者均并發(fā)其他類吸入性過敏原，具有特應(yīng)性體質(zhì)，如有可能應(yīng)盡早脫離現(xiàn)有工作崗位，并積極治療并發(fā)過敏性疾病。

本文通過免疫印跡方法對鱟試劑中潛在致敏蛋白進(jìn)行初步分析，結(jié)果顯示例1患者血清IgE可與鱟試劑中相對分子質(zhì)量20 000、185 000蛋白條帶結(jié)合，例2在相對分子質(zhì)量20 000、25 000、40 000存在特異性IgE結(jié)合條帶。鱟試劑的主要功能蛋白是凝固蛋白原(凝膠形成)、凝固酶原(絲氨酸蛋白酶)、B因子(絲氨酸蛋白酶)、G因子(絲氨酸蛋白酶)和C因子(絲氨酸蛋白酶)，相對分子質(zhì)量分別為20 000、54 000、64 000、110 000、123 000，2例患者都能顯示出相對分子質(zhì)量20 000結(jié)合條帶，推測相對分子質(zhì)量為20 000的凝固蛋白原是鱟試劑的致敏蛋白。因病例數(shù)量少，難以確定鱟試劑中主要致敏蛋白所對應(yīng)相對分子質(zhì)量蛋白條帶。

職業(yè)性呼吸道過敏性疾病不僅僅是一種臨床疾病，因其涉及勞動保護(hù)及工傷賠償?shù)确蓛?nèi)容，而成為復(fù)雜的社會問題。早期發(fā)現(xiàn)并脫離變應(yīng)原環(huán)境、減少變應(yīng)原接觸對職業(yè)性呼吸道過敏性疾病的治療具有重要意義。因此，準(zhǔn)確鑒定變應(yīng)原對臨床醫(yī)生是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)。目前可采取的病因?qū)W診斷方法包括皮膚試驗(yàn)(點(diǎn)刺試驗(yàn)或者皮內(nèi)試驗(yàn))、特異性IgE檢測、激發(fā)試驗(yàn)(變應(yīng)原鼻黏膜激發(fā)試驗(yàn)，變應(yīng)原支氣管激發(fā)試驗(yàn)，現(xiàn)場激發(fā)試驗(yàn)等)[8-9]。部分職業(yè)性呼吸道過敏性疾病患者的癥狀在脫離存在致敏原的工作環(huán)境后仍可能持續(xù)數(shù)年，且對于所暴露的職業(yè)變應(yīng)原復(fù)雜、具有特應(yīng)性體質(zhì)、特別是不能調(diào)離原工作環(huán)境、用藥不規(guī)范的患者往往預(yù)后很差[13]。因此，除脫離原工作崗位外，規(guī)范的藥物治療同樣重要。

本研究為鱟試劑所致職業(yè)性呼吸道過敏癥的國內(nèi)首次報(bào)道，并在國內(nèi)外首次就鱟試劑致敏蛋白做了初步分析，推測相對分子質(zhì)量為20 000的凝固蛋白原可能是其致敏蛋白。內(nèi)毒素檢測在藥物及食品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，故接觸鱟試劑的工作人員均存在發(fā)展為職業(yè)性呼吸道過敏癥的風(fēng)險。因此，需要對鱟試劑所致職業(yè)性過敏進(jìn)行更為深入的研究，如易感人群、致敏蛋白組分、致敏途徑、預(yù)防措施等。