孫鹿希，鄭文潔

白塞病(Beh?et’s disease，BD)是一種慢性復發(fā)性血管炎性疾病，以口腔、生殖器潰瘍，眼炎和皮膚病變?yōu)橹饕卣?，并可累及消化道、神?jīng)、血管等重要臟器和組織。BD多發(fā)生于青壯年，病情反復，有較高的致殘率和致死率，嚴重影響患者的生存質(zhì)量。研究表明BD是遺傳因素及環(huán)境因素共同參與致病的疾病[1-2]。BD具有較強的地區(qū)特異性和種族差異，高發(fā)于中國、日本、中東和地中海地區(qū)[3]，又稱為“絲綢之路病”。BD多數(shù)為散發(fā)病例，但也有一定家族聚集性，人類白細胞抗原(HLA)-B51是已知與BD發(fā)病風險相關最強的遺傳易感因素[4]。但 HLA-B51僅增加20%遺傳易感風險[5]，候選基因和全基因組關聯(lián)研究(GWAS)揭示了更多BD相關基因參與其發(fā)病[6-7]，除了遺傳因素外，細菌、病毒等微生物因素也與BD發(fā)病密切相關。BD患者存在多種免疫失衡表現(xiàn)，例如Th1及Th17細胞過度激活、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)數(shù)量及功能異常。人體微生物，尤其是腸道菌群在調(diào)節(jié)Th1，Th17和Treg等免疫細胞中起到至關重要的作用。近年來，多項研究顯示腸道菌群紊亂與炎癥性腸病、1型糖尿病、多發(fā)性硬化癥和類風濕關節(jié)炎等多種自身免疫性疾病發(fā)病相關[8-11]。本綜述旨在討論腸道菌群組成與BD的關聯(lián)以及它在該疾病發(fā)展中的潛在作用。

1 腸道菌群特點和分析方法

人體內(nèi)存在大量的共生微生物，特別是腸道微生物，對維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起著非常重要的作用。其中，腸道微生物由腸道內(nèi)的細菌、真菌和病毒等各種微生物構成，是人體最龐大的微生態(tài)系統(tǒng)，已知種類超過1000種，其編碼的基因含量遠遠超過人類基因組，又被稱為人體的“第二基因組”。

目前已知的腸道細菌超過50個門，主要包括厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形桿菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)。按照功能可分為三大類，包括(1)與人體共生的生理性細菌，如雙歧桿菌和乳酸菌等，可以通過能量代謝、發(fā)揮免疫刺激等功能維持微生物環(huán)境穩(wěn)態(tài)；(2)條件致病菌：如腸桿菌、腸球菌和鏈球菌等，在機體免疫監(jiān)視低下時可成為致病菌；(3)致病菌：如變形桿菌、假單胞菌、金黃色葡萄球菌和梭桿菌等，可通過菌群易位、產(chǎn)生毒素和對機體有害的物質(zhì)促進疾病發(fā)生。

傳統(tǒng)微生物研究采取單一菌種培養(yǎng)的方法進行，但超過99%的微生物無法在體外進行培養(yǎng)，極大的限制了人們對微生物的認知。隨著高通量測序和宏基因組關聯(lián)分析等技術在人類疾病研究中的廣泛應用，人類對腸道微生物多樣性有了更深入的了解。其中，基于16s rRNA的分子測序技術通過檢測細菌16s rRNA的全序列或V3、V6、V8可變區(qū)，達到對菌群結構的定性和相對定量分析，已被廣泛應用于腸道等人體微生物研究中。但16s rRNA測序具有操作技術環(huán)節(jié)多、影響因素復雜、難以標化等不足。宏基因組學(Metagenomics)是通過以全部微生物群體基因組(又稱為宏基因組)為研究對象，對樣本的總DNA直接進行高通量測序，然后進行序列組裝和基因注釋，可以獲得完整的微生物基因組信息，從而發(fā)現(xiàn)腸道菌群結構改變、系統(tǒng)全面地研究微生物與其生存環(huán)境間的關系。

越來越多的證據(jù)顯示，腸道菌群具有多種功能，除了物質(zhì)代謝、黏膜屏障、免疫調(diào)控及宿主防御等，還能合成多種小分子代謝產(chǎn)物，在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著著重要的作用。

2 BD患者的腸道菌群改變

Consolandi等[12]的研究首次揭示了BD患者與健康對照之間存在的腸道菌群差異及潛在機制。該研究收集了地中海地區(qū)的22例BD患者及16名與其共同生活的健康親屬的腸道菌群，通過16s rRNA測序方法比較發(fā)現(xiàn)，兩者的腸道菌群在門級別分布大致相同，但BD患者的腸道菌群的種屬多樣性顯著降低，尤其是羅斯氏菌(Roseburia)和罕見小球菌(Subdoligranulum)兩種重要梭菌屬的豐度顯著減少。

短鏈脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)是由腸道菌群產(chǎn)生的參與宿主免疫調(diào)控的重要代謝產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸和丁酸[13]。大量研究表明SCFA具有誘導細胞分化[14]、凋亡[15]和抗炎[16-18]等重要生理功能。目前已知短鏈脂肪酸是重要的組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDAC)抑制劑，特別是丁酸被證實具有廣泛HDAC抑制作用。SCFA可以通過抑制外周血單個核細胞[17-18]、巨噬細胞[16]和樹突細胞[19-20]的HDAC抑制炎癥反應。體外實驗顯示，SCFA可以通過抑制HDAC使NF-κB失活并下調(diào)TNF-α的表達[17-18]，從而抑制局部促炎細胞因子產(chǎn)生。除了影響固有免疫細胞，丁酸等SCFA還可以通過其HDAC抑制作用，促進Treg細胞分化和免疫抑制功能增強，從而維持結腸的免疫穩(wěn)態(tài)[20-22]。

該研究通過檢測糞便的短鏈脂肪酸水平，揭示了BD患者腸道菌群產(chǎn)生的丁酸含量顯著下降[12]。而丁酸鹽水平降低可通過上述機制促進各種炎癥成分的表達、Th17/Treg等細胞分化和功能異常，從而導致宿主免疫穩(wěn)態(tài)失衡。同時BD患者的腸道羅斯氏菌與丁酸水平存在顯著正相關性。提示腸道菌群中梭菌屬等產(chǎn)短鏈脂肪酸菌減少所導致的短鏈脂肪酸生成不足可能與BD的發(fā)生相關。

日本的一項研究指出，BD患者的11種腸道細菌亞群的相對豐度與健康對照存在差異[23]。該研究通過16s rRNA測序對比了12例BD患者和12名健康對照的腸道菌群，結果顯示BD患者中雙歧桿菌(Bifidobacterium)和愛格士菌(Eggerthella)兩種菌屬顯著增加，普雷沃菌(Prevotella)和巨單胞菌屬(Megamonas)兩種菌豐度減少。有研究指出口服雙歧桿菌可以誘導出無菌小鼠的Th17細胞激活和關節(jié)炎表現(xiàn)[24-25]。雙歧桿菌與腸道內(nèi)乳酸的產(chǎn)生和pH調(diào)節(jié)密切相關[26]，部分梭菌屬可以利用乳酸產(chǎn)生丁酸鹽或丙酸鹽等短鏈脂肪酸[27-28]，而且梭菌屬與調(diào)節(jié)性T細胞的活化相關[22]。BD患者中的雙歧桿菌和梭狀桿菌的失衡可能引起局部酸堿平衡和黏膜免疫系統(tǒng)紊亂。與Consolandi等[12]研究不同的是，該研究中個體和群體的腸道菌群多樣性與正常人無明顯區(qū)別，菌群的豐度變化也與疾病活動度無明確相關性。這可能與該研究所招募的BD患者病情活動度相對較低相關。

以上兩項研究主要基于16s rRNA測序分析，該測序方法有一定的局限性，例如由于擴增子偏倚造成的微生物組成偏差以及無法達到菌種和菌株水平的鑒定。為了更全面的探究BD患者微生物的組成，Ye等[29]首次采用宏基因組的測序技術研究BD患者和健康人腸道菌群組成的差異。結果顯示兩者的主要菌群分布一致，主要為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，但在96個菌屬和23個菌種的豐度中存在顯著差異。BD患者中富集的菌屬主要包括子囊菌真菌、變形桿菌和放線菌。同時，BD患者中富集的菌種主要包括多種窄食單胞菌屬、放線菌屬和棒狀桿菌中的條件致病菌。

通過LEfSe分析和差異基因聚類分析顯示，硫酸鹽還原細菌(Bilophilaspp.)和副桿狀菌屬(Parabacteroides)等多種條件致病菌在BD患者中顯著富集，而產(chǎn)甲烷菌(Methanoculleusspp.和Methanomethylophilusspp.)以及產(chǎn)丁酸鹽細菌(Clostridiumspp.)在健康人群中富集。同時基于宏基因組物種分析譜(metagenomic species，MGSs)確立了13個差異MGSs，從而構建了能夠區(qū)分BD患者與健康者的疾病監(jiān)測模型，經(jīng)分析該模型AUC=81.1%(95%CI=70%～92%)，為通過腸道菌群檢測識別BD患者提供依據(jù)。

3 BD患者的口腔菌群改變

人口腔微生物是人體共生菌群的重要組成部分，口腔內(nèi)存在700多種豐富多樣的菌群[30]。其中，鏈球菌屬(Streptococcus)、韋榮菌屬(Veillonella)以及普氏菌屬(Prevotella)，是占最大比例的微生物菌屬。近年來許多研究顯示，除了腸道菌群，口腔菌群與全身疾病的發(fā)生也存在密切關聯(lián)，包括炎性腸病、胰腺癌和類風濕關節(jié)炎等[9,31-32]。而且由于唾液樣本易于獲取，口腔微生物有可能成為許多疾病的便捷使用的生物標志物來源。

BD患者常具有特征性的反復發(fā)作的口腔潰瘍，既往研究顯示BD和牙周病存在相關性，BD患者通常具有比其他類型口腔潰瘍患者更差且與BD疾病嚴重程度相關的牙周評分[33]，均提示BD患者口腔微生物與免疫反應之間的相互作用可能在疾病的發(fā)生中起到重要作用。

英國的一項研究首次探索了BD患者口腔微生物組成[34]。應用DNA微陣列分析方法，檢測了BD與復發(fā)口腔潰瘍(recurrent aphthous stomatitis，RAS)患者及健康對照的唾液和口腔黏膜微生物成分。結果顯示，BD患者存在口腔健康受損，BD患者齲齒指數(shù)、牙齦指數(shù)、菌斑指數(shù)和牙周探診深度和齦溝出血指數(shù)均較正常人高，且與RAS患者無差別。和RAS患者相比，BD患者非潰瘍部位齲齒羅菌(Rothiadenticariosa)定植增加，而潰瘍處唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)明顯增加。與健康對照相比，BD患者犬血鏈球菌(Streptococcussanguinis)明顯增加。既往研究曾多次報道以犬血鏈球菌為代表的鏈球菌屬感染與BD之間存在關聯(lián)。鏈球菌屬的細菌和單純皰疹病毒-1與熱休克蛋白等人體具有的蛋白質(zhì)具有高度同源性，可引起B(yǎng)D遺傳易感個體的交叉反應[35]。此外，近年也有研究證實在BD患者口腔中存在一些非典型鏈球菌的增多，如口腔犬血鏈球菌的特定菌株可以促進免疫細胞分泌IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子(TNF)-α等促炎因子[33,36]。雖然暫無明確直接證據(jù)指出BD患者口腔微生物失衡是致病性還是反應性，但這些證據(jù)提示在遺傳易感的基礎上，口腔等細菌感染引發(fā)的免疫反應可能促進BD進展。同時，通過患者特異性、個體化的益生菌治療恢復潰瘍部位的口腔微生物群落的平衡可以作為未來口腔潰瘍治療的新方向。

另一項來自美國密歇根大學的研究應用了16s rRNA測序方法檢測了BD患者唾液中微生物的組成。該研究同樣指出BD患者的口腔微生物組與對照組相比存在顯著差異，主要表現(xiàn)為菌群多樣性的減低。在BD患者中，副流感嗜血桿菌(Haemophilusparainfluenzae)和擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)的豐度顯著增加。兩種菌均是革蘭氏陰性桿菌，且與牙齦炎癥相關[37-38]。該研究還探索了免疫抑制劑的應用以及HLA-B基因型與口腔細菌群落組成間的關系。結果顯示，在BD患者中，是否服用免疫抑制劑以及是否具有高風險等位基因與口腔菌群的相對豐度之間沒有明確關聯(lián)。此外，既往研究顯示，牙周治療可以改善口腔環(huán)境，但唾液微生物組成在治療前后無明顯改變[39]。與此一致的是，BD患者經(jīng)過牙科治療后口腔環(huán)境改善，牙菌斑微生物組趨于正常，但唾液微生物組未見明顯改變，提示唾液微生物成分更穩(wěn)定，可作為潛在的BD生物標記物。

4 腸道及口腔微生物改變在BD發(fā)病中的潛在作用機制

由于口腔微生物可以通過唾液從口腔進入下游的消化道，其與腸道菌群也存在著值得探索的相關性。研究顯示，將從炎癥性腸病患者的唾液當中獲取的克雷伯氏菌，直接接種到無菌小鼠的口腔，結果發(fā)現(xiàn)這種菌可以通過吞咽作用，加重炎癥性腸病的反應[40]。Ye等[29]發(fā)現(xiàn)BD患者唾液中存在雙歧桿菌、普雷沃菌和斯卡多維亞菌屬(Scardovia)的富集，且BD患者的口腔和腸道中均檢測到普雷沃氏菌的異常，也對口腔和腸道菌群間存在關聯(lián)并共同參與致病有所提示。

Ye等[29]還進一步分析了腸道菌群功能改變。京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)是整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫，能夠全面提供如代謝、膜轉運和信號傳遞通路等信息，被廣泛應用與菌群功能分析中。其中同源KEGG(KEGG Orthology，KO)是基于同源基因具有相似功能的假設，把和每個功能已知的基因同源的基因都歸為一類，用該基因的功能作為這個KO的功能，以此用不同物種的基因功能研究進行相互擴充，建立全面的基因功能數(shù)據(jù)庫。KEGG模塊是人為定義的功能單元的集合，被用于已測序基因組的注釋。BD患者中與氧化還原過程相關的KO有所增加，而能夠降解細胞壁中的肽聚糖而具有消炎作用的溶菌酶相關的KO則顯示減低。在KEGG模塊水平，BD患者中的莢膜多糖運輸系統(tǒng)、types Ⅲ和types Ⅳ分泌系統(tǒng)顯著增強。BD患者常合并葡萄膜炎，該研究利用糞菌移植的技術將BD患者的糞便菌群移植到葡萄膜炎小鼠動物模型中。組織學分析顯示BD受體組小鼠的視網(wǎng)膜結構嚴重紊亂，存在大量炎癥細胞浸潤和IL-17和IFN-γ等炎癥因子分泌增加。該研究首次應用動物模型揭示了BD患者的糞便可誘導或加重葡萄膜炎。

基于以上結果，我們總結腸道菌群紊亂參與BD的發(fā)病可能存在下述機制(圖1)。近年研究中均發(fā)現(xiàn)BD患者的腸道菌群中有多種致病菌和條件致病菌富集，而可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸和產(chǎn)生甲烷的有益菌群則相對減少。其中，BD患者腸道硫酸鹽還原菌的富集可能導致具有促炎作用的硫化氫的過度產(chǎn)生，硫化氫與腸道的健康息息相關，它可以作為蛋白質(zhì)酵解產(chǎn)生的毒素直接損害腸腔上皮或血管內(nèi)皮細胞，損害其屏障功能，也可轉化為硫代硫酸鈉，在炎癥期間可進一步氧化成連四硫酸鹽，促進沙門菌及部分變形菌類致病菌的生長。條件致病菌在BD患者腸道中的富集可引起其效應分子和病原體相關模式分子(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)侵入腸上皮細胞或血管內(nèi)皮細胞，被模式識別受體TLR2/TLR4識別，誘導Th1和Th17過度活化，從而導致導致腸道和血管炎癥，并最終導致BD的發(fā)生。

另一方面，產(chǎn)丁酸菌和產(chǎn)甲烷菌水平降低可能導致炎癥途徑的抑制作用下降，從而誘發(fā)BD全身性疾病表現(xiàn)。例如，產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生的甲烷可以改善氧化應激損傷并且可以抑制各種組織和器官中的炎癥反應[41-43]。產(chǎn)丁酸菌可以發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生丁酸鹽[44]，后者的減少可導致腸上皮屏障功能障礙[27]，引起Treg細胞數(shù)量減少，而Th17等致病性免疫細胞活化及其分泌的致炎因子增多，這與BD患者中發(fā)現(xiàn)的免疫細胞失衡表現(xiàn)相一致[45-47]。

5 總結

綜上所述，BD患者具有特征性的腸道微生物和口腔微生物組成改變(表1)，黏膜微生物群結構的變化可通過影響?zhàn)つて琳瞎δ?、觸發(fā)天然免疫、誘導Th1和Th17過度活化、Treg數(shù)量減少等多種機制促進BD發(fā)病(圖1)。進一步干預性研究，如飲食干預、益生菌治療、糞便微生物移植等重建BD患者菌群的組成可能對疾病的防治提供新方法。

表1 BD患者腸道和口腔菌群組成改變Table 1 Altered composition of gut and oral microbiota in BD patients

圖 1腸道菌群紊亂促進BD發(fā)病的潛在機制

Fig1Potential mechanism of dysbiosis of gut microbiota in the pathogenesis of BD

在遺傳和環(huán)境因素影響下，BD患者出現(xiàn)腸道菌群紊亂，表現(xiàn)為多種致病菌和條件致病菌富集，而產(chǎn)SCFAs等有益菌群則相對減少。致病菌生成多種促炎作用的有害物質(zhì)(如硫化氫等)，而益生菌生成的短鏈脂肪酸等物質(zhì)減少；菌群的代謝產(chǎn)物異?？善茐哪c腔上皮或血管內(nèi)皮細胞，引起屏障功能障礙，并引起其效應分子和病原體相關模式分子(PAMP)侵入腸上皮細胞或血管內(nèi)皮細胞，被模式識別受體識別，直接或間接誘導Th1和Th17過度活化、Treg細胞數(shù)量下降，從而導致導致腸道和血管炎癥，并最終導致BD的發(fā)生