尤 放， 王美蓮

(中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 病原生物學教研室，遼寧 沈陽 110122)

瘧疾是最常見的蟲媒傳染病之一,對全球公眾健康構成了極大威脅，已成為嚴重的世界衛(wèi)生問題。據世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)發(fā)布的最新數據顯示，全球近91個國家和地區(qū)屬于瘧疾的高度和中度流行區(qū)，主要集中在熱帶和亞熱帶地區(qū)，包括非洲、東南亞、東地中海的多個國家和地區(qū)[1]。在非瘧疾流行地區(qū)，瘧疾依然是造成嚴重輸入性感染的最常見原因[2]。2016年我國瘧疾報告病例中99.9%為境外輸入性病例，而本地瘧疾傳播主要在云南邊境地區(qū)和西藏林芝地區(qū)。人類一直在與瘧疾做著各種斗爭，消除瘧疾是人類共同的目標。使用殺蟲劑處理過的蚊帳(Insecticide-treated nets，ITNs)與室內殘留噴灑(Indoor residual spraying，IRS)是最重要的兩項病媒控制措施[3]。青蒿素及其衍生物是目前強有力的抗瘧藥物，以其為基礎的聯(lián)合用藥策略(Artemisinin-based combination therapies，ACTs)是目前控制非復雜性瘧疾的一線選擇[4]。然而，多重耐藥性瘧原蟲以及具有殺蟲劑抗性按蚊的出現(xiàn)，對瘧疾的控制與消除又構成了巨大的挑戰(zhàn)[5]。安全、高效、價格低廉的瘧疾疫苗作為現(xiàn)有抗瘧手段的理想補充，顯示出其重要作用。

瘧疾之所以成為一個持續(xù)的全球疾病，一個重要的原因是瘧原蟲復雜的生命周期[6]。引起瘧疾的瘧原蟲生活史可分為兩個階段，第一階段是在終宿主按蚊體內的有性生殖，紅細胞內配子體的形成，為有性期的開始；第二階段則是在中間宿主人體內的裂體增殖，感染后蟲體在肝細胞內的發(fā)育和裂體增殖，形成成熟的紅外期裂殖體(exo-erythrocytic schizont)，在漲破被寄生的肝細胞后，以裂殖子(merozoite)形式釋放，經血流侵入紅細胞，隨之開始紅內期裂體增殖過程。

針對瘧原蟲發(fā)育的不同場所或時期，人們研制了以下三類瘧疾疫苗：紅前期(肝期)瘧疾疫苗、紅內期(血液階段)瘧疾疫苗以及蚊期的傳播阻斷疫苗。就疫苗的有效組成成分而言，可將其分為全蟲減毒活(Whole, attenuated live parasites)疫苗和亞單位(Subunit)疫苗[7]。目前抗瘧疫苗研制中存在的問題主要有：①瘧原蟲生活史較為復雜，在宿主體內經歷多個發(fā)育階段，且每一階段表達的抗原不盡相同，多達數百種的獨特抗原使得疫苗的研發(fā)相對困難。②瘧疾感染后，機體的保護性免疫應答機制至今在很大程度上仍然是未知的，針對某一階段的免疫反應可能無法在以后的階段提供保護。③作為生物制品的抗瘧疫苗的安全性問題頗具爭議。雖然大量的實驗已經證明全蟲疫苗可以對已識別的同種蟲株提供持久的保護[8]，但是減毒活全蟲疫苗的性質并不十分穩(wěn)定，因而在實際應用中亦受到限制[9]。④現(xiàn)有疫苗候選抗原的免疫原性較弱,抗原變異及存在的多種免疫逃避機制也增加了疫苗研發(fā)的難度。⑤缺乏合適的佐劑(adjuvant)或載體(vector)，亞單位疫苗在流行區(qū)的表現(xiàn)低于預期，但若輔以強效的佐劑/載體將發(fā)揮極佳的抗瘧潛力，極大地提高疫苗的有效性。

1 紅細胞前期瘧疾疫苗(Pre-erythrocytic malaria vaccines)

紅前期抗瘧疫苗，旨在臨床癥狀(寒戰(zhàn)、發(fā)熱等)出現(xiàn)前對原蟲的發(fā)育進行遏制，即對孢子蟲侵襲易感機體肝細胞的過程進行阻斷，抑制或殺滅已進入體內而尚未進入肝細胞前的子孢子，阻止肝期(紅細胞前期)瘧原蟲感染，本類疫苗以降低瘧原蟲感染率為指標。

目前研究最為先進的是已進入IV期臨床試驗的RTS,S亞單位抗瘧感染疫苗，該疫苗可對嬰幼兒臨床和嚴重瘧疾提供部分的保護性效應，故而其研究目標在于降低臨床瘧疾的發(fā)病率以及減少年幼兒童中嚴重病例的發(fā)生[10]。RTS,S/AS01是由一種基于脂質體的佐劑(AS01)和乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B surface Antigen，HBsAg)病毒樣的顆粒組成，核心是由源于惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)的環(huán)孢子蟲蛋白(Circumsporozoite protein，CSP)基因融合于Hepatitis B Virus(HBV)基因表面形成。有研究表明，6周齡至17月齡的嬰幼兒可對惡性瘧原蟲及B型肝炎病毒產生主動免疫?；赗TS,S最初的研究表明其可保護流行區(qū)志愿者不受同源蟲株的感染。相關研究中新生兒接種后可獲得良好的耐受，不良反應主要為發(fā)熱，但產生相對較低水平的免疫應答。新的研究證實RTS,S/AS01 在疫苗接種后的一年內均可產生有效的保護性作用，隨著時間的推移，疫苗的效力逐漸減弱[11]。在一個包含223例5～17月齡兒童給予3劑疫苗后長達7 a的隨訪中，由負二項回歸分析評估的疫苗效力僅為4.4%(95%置信區(qū)間[CI], -17.0 to 21.9; P=0.66)[12]。這一問題或可通過加強針(第4劑)的注射來彌補[13]。最新臨床試驗的數據表明，RTS,S/AS01 疫苗不論是在合并接種/不接種增強針的情況下，都可在3～4 a內預防低齡嬰幼兒臨床瘧疾癥狀的發(fā)生[14]。此外，在接種增強針的兩個年齡段患者中(34～41/39～50月齡)，疫苗效力(Vaccine efficacy,VE)的提高均得到了證實，其中34～41月齡組為18.3%→25.9%，39～50月齡組為28.3%→36.3%[15]。除此之外，在5～17月齡組中，該疫苗的總體效力也取決于當地寄生蟲種群中與之匹配的等位基因所占的比例，這對于今后的研究又提出了新的方向[16]。若在高危地區(qū)，將此疫苗與其他有效控制手段聯(lián)合應用，將極大地發(fā)揮防控瘧疾的潛力[17]。

基于惡性瘧原蟲子孢子的瘧疾疫苗(PfSPZ-based malaria vaccines)研究廣泛開展。目前，最早被研究的放射減毒活疫苗(radiation-attenuated sporozoites，RAS)已進入II期臨床試驗階段。RAS通過一定劑量的輻射誘導保護使原蟲轉化為不具有感染性的裂殖體，從而阻止其感染。目前市場上暫無該類亞單位疫苗銷售，也就是說，我們尚不能通過接種該疫苗而避免全球每年約2.16億感染病例的產生。但是相關的研究結果表明RAS可呈現(xiàn)出劑量-閾值效應，即通過注射最大劑量獲得最高的無菌保護效應[18]?？梢源藶槌霭l(fā)點，進行更深入的研究?；驕p毒孢子蟲(Genetically attenuated parasites，GAP)疫苗與藥物減毒子孢子(Chemoprophylaxis and sporozoites/ Infection-treatment-vaccination，CPS/ITV)疫苗都處于I期臨床研究階段。CPS/ITV策略則是通過抗瘧藥物(氯喹CQ、青蒿琥酯AS等)化學預防，在一定覆蓋范圍內抑制或清除肝細胞內寄生(裂體增殖)階段寄生蟲而達到抗感染的目的[19]。它的優(yōu)勢在于，可通過與抗瘧相關的化學藥物的聯(lián)合注射，強化疫苗的效力，故較之于RAS可以更為有效地降低瘧疾的感染率[20]。新近的人體試驗結果表明，聯(lián)合CQ進行化學預防(PFSPZ-CVac)的新型疫苗在最后一次注射后的10周內，該疫苗仍能對受試者提供100%免疫保護[21]。目前研究人員又通過一種新的前臨床鼠瘧模型對CPS-CQ疫苗進行了相關實驗，結果表明使用來自肝階段的P.falciparum孢子蟲(Pfspz)聯(lián)合氯喹免疫DRAGA鼠可以誘導更強的抗體反應，繼而產生更強有力的保護，未來有望在人體試驗中達到更好的紅前期(肝期)免疫保護效果[22]。GAP則是通過敲除或雙敲除特定基因(如p36/p52等)，使處于肝臟的晚期發(fā)育階段的或一旦釋放進入血液階段的原蟲立即被捕獲而避免后續(xù)的感染發(fā)生，并且不需要注射抗瘧藥物。在P.berghei鼠瘧模型試驗中已經證實注射PbΔb9ΔslarpGAP后，不僅誘導了高水平的保護效應，并且未出現(xiàn)疫苗免疫失敗[23]。由于在肝臟階段被捕獲的基因減毒瘧原蟲，可作為強有力的免疫原，進而對抵抗孢子體相關的瘧疾感染提供完全的、持久的保護。新的研究通過在P.yoelii鼠瘧模型中PlasMei2 和 LISP2(Liver-Specific Protein 2)兩個基因的敲除，合成了一種致死的表型(即P.yoeliiplasmei2-/lisp2-)，使得在原蟲感染后的3 d內即可在肝臟晚期階段被清除，從而避免了向紅內期階段的突破性感染[24]。這些發(fā)現(xiàn)為今后對引起人體瘧疾感染的P.falciparum的探索提供了一條新的路徑，即創(chuàng)建一個完全的、惡性瘧原蟲相關的基因減毒孢子蟲疫苗，這對于人瘧的控制意義重大。

2 紅細胞內期瘧疾疫苗(Blood-stage malaria vaccines)

紅內期抗瘧疫苗發(fā)揮作用是通過抑制pRBC(parasitized red blood cell)內原蟲的增殖發(fā)育以干擾感染RBC的黏附過程，可針對于預防感染的疫苗起到補充的作用。諸多流行病學研究為血液階段疫苗的可行性提供了有效支持[25]。P.falciparum是一種致命的專性細胞內寄生蟲，在宿主體內可通過一系列的寄生蟲蛋白而加速紅細胞的侵襲，其中裂殖子頂端膜抗原1(Apical membrane antigen-1，AMA1)作為存在于P.falciparum中的一種膜蛋白，是寄生蟲裂殖子完成侵襲過程所必需的。人們對AMA1的疫苗研究取得了重要進展。在一項試驗中，使用來自P.falciparum的AMA1-3D7 蛋白與佐劑系統(tǒng)AS02A 進行重組 (即FMP2.1/AS02A)，這一基于AMA1的疫苗增強了對瘧原蟲的生長抑制，然而這種作用與瘧疾流行季節(jié)的等位基因特異性無關[26]。在實地研究中我們得到證實，僅單獨應用AMA1疫苗雖可對部分同源寄生蟲產生免疫應答，然而在同源性CHMI的實驗中卻未能提供保護性效應[27]。最近的一項動物免疫研究表明，聯(lián)合注射AMA1和RON2(Rhoptry neck protein 2)肽復合體(即亞單位疫苗AMA1-RON2)可產生保護性作用，使小鼠雖感染P.yoelii但并不發(fā)病[28]。目前AMA1相關疫苗尚處于前臨床研究階段，但這些研究結果為以后實地對與臨床瘧疾相關免疫保護功能的研究提供了一個框架，并且有助于對下一代疫苗的研發(fā)進行相似的分析。

除此之外，P.falciparum中存在的網織紅細胞結合類似同源蛋白5(Plasmodiumfalciparumreticulocyte-binding protein homologue 5，PfRH5)也是一種被廣泛研究的亞單位候選疫苗。在原蟲入侵RBC這一復雜過程中，PfRH5作為一種不可或缺的寄生蟲配體而與RBC受體結合。它具有有限的多態(tài)性，并可誘導產生一種強效的中和抗體。然而，缺乏跨膜結構域與GPI(Glycosyl phosphatidyl inositol)錨定[29]，因此針對PfRH5疫苗的研究目前進展到Phase I階段。先前的研究表明，該疫苗可誘導多克隆抗-PfRH5抗體的產生，從而抑制裂殖子與紅細胞的緊密附著，并且具有干擾PfRH5與其受體蛋白之間相互作用的能力[30]。體外實驗中抗-PfRH5血清抗體在功能上表現(xiàn)出對不同株系的生長發(fā)育抑制活性(Growth inhibition activity，GIA)，并且該抗體靶向于RH5構象性抗原表位，在RH5侵襲復合體的形成過程中發(fā)揮關鍵性的交互抑制作用[31],就P.falciparum而言，該疫苗具有不可預期的廣闊前景。

抗紅細胞內期原蟲疫苗的優(yōu)勢在于不論是同源還是異源蟲株均可誘導強有力的免疫。人們在美國和肯尼亞西部地區(qū)進行了一項試驗，結果表明受試者的血清在生長抑制試驗中產生了高滴度抗MSP1(Merozoite surface proteins 1)抗體，其對于血液階段寄生蟲具有顯著抑制作用。尤其是在美國的志愿者中，異源MSP1 等位基因與基于MSP1的疫苗(3D7等位基因)相比，產生的抗體表現(xiàn)出更好的交叉反應能力[32]。JAIVAC-1是針對惡性瘧原蟲而開發(fā)的一種候選瘧疾疫苗，它是由PfMSP-1的C末端19 kD的保守區(qū)域與Pf受體以及F2功能區(qū)的EBA175結合而成，即PfMSP-1(19)。注射接種后，志愿者對JAIVAC-1 耐受良好并未觀察到嚴重不良反應(Serious Adverse Drug Reaction，SADR)的發(fā)生。此外，從接種者血清中純化出的IgG抗體，對P.falciparumCAMP株的生長有顯著的抑制功效[33]。隨著對有效的血液階段抗瘧疫苗研究的開展，發(fā)現(xiàn)了一種加速抗瘧疫苗研究的方法，即在非流行區(qū)通過控制人類瘧疾感染來盡早地對已篩選的疫苗進行有效性測試[34]，這有助于及時剔除無效的候選疫苗，并發(fā)現(xiàn)更多的具有保護性免疫特征的疫苗。

3 傳播阻斷疫苗(Transmission-blocking vaccines，TBVs)

傳播阻斷疫苗是一種用于干擾瘧疾傳播的針對寄生蟲有性階段發(fā)育的疫苗，其首要目標是阻斷中間宿主人-媒介按蚊-人之間的瘧疾傳播[35]。TBVs通過提高宿主群體免疫力，主要是針對蚊胃階段細胞外瘧原蟲發(fā)育階段，從而減少感染的發(fā)生，繼而對傳播形成有效控制。已經發(fā)現(xiàn)的具有傳播阻斷活性(Transmission blocking activity, TBA)的候選抗原主要有Pfs25、Pfs48/45、Pfs230、Pfs47、Pvs48/45、PfGAP50、AnAPN1(Alanyl aminopeptidase N)等[36-39]。研究較為成熟的兩種主要的亞單位疫苗中Pfs25和Pfs230均處于I期臨床研究階段，而僅出現(xiàn)在雌配子表面的Pfs47則尚處于前臨床研究階段。其中Pfs25為配子受精前靶抗原，而Pfs230則為受精后靶抗原。這兩種抗原候選疫苗的TBA都取決于原蟲的暴露程度以及抗體的滴度，即在一定范圍內，隨著接觸寄生蟲的減少，抗體滴度的增加，它們的效力也隨之提升，瘧疾的傳播隨之減少[40]。Pfs47在自然的P.falciparum種群中呈現(xiàn)出明顯的地域特征，這種現(xiàn)象與通過蚊免疫系統(tǒng)進行的單體型自然選擇有關[41]。它可介導瘧原蟲的免疫逃避，并可抑制在按蚊中腸進行的消化反應[42]。由于已發(fā)現(xiàn)的這些關鍵功能使得Pfs47有望成為阻斷瘧疾傳播的又一靶點，對其研究將更加廣泛深入。本實驗室主要從事瘧疾傳播阻斷疫苗(TBVs)的研究(獲美國國立衛(wèi)生研究院NIH支持)及瘧原蟲有性階段特異性基因的功能分析(由國家自然科學基金委批準)。由于TBVs主要靶向原蟲的有性階段(即蚊體內階段)進而發(fā)揮阻斷效應，生活史中蚊胃內配子體(gametocyte)的發(fā)育以及由動合子(ookinete)形成卵囊(oocyst)的過程至關重要。與此同時，在這一過程中，相關蛋白質又發(fā)揮著極為關鍵的作用[43]。基于生物信息學分析及鼠瘧模型的構建與研究，我們識別到有性階段中一個高度保守的蛋白Plasmodium PbPH (PBANKA_041720)，其所包含的PH結構域(Pleckstrin homology domain)可對傳播阻斷活性產生重要影響。Pbph基因對于P.berghei有性階段的發(fā)育十分必要，尤其是在體外實驗中重組蛋白可顯著影響雄配子的形成[44]。同時，動合子分泌蛋白(Putative secreted ookinete protein，PSOP)極具傳播阻斷潛能，尤其是PSOP7(PBANKA_135340)與PSOP25蛋白。其中PSOP7主要表達在原蟲的合子及成熟動合子階段，而PSOP25則在Retorts階段也有表達(間接免疫熒光試驗，IFA所證實)。本實驗室通過對伯氏瘧原蟲ANKA株這兩個基因截短片段(即rPbPSOP7與rPbPSOP25)的成功克隆與表達，發(fā)現(xiàn)重組rPbPSOP7蛋白具有較強的抗原性及免疫原性，在所建立的P.berghei感染小鼠模型中于實驗鼠體內可誘導極強的體液免疫應答反應，并隨之產生相關的特異性抗體。在直接蚊飼試驗(Direct mosquito feeding assay，DFA)中，發(fā)現(xiàn)被動免疫即注射抗-rPSOP25單克隆抗體(anti-rPSOP25 mAb)，可以降低感染率(31.2%→26.1%)并引起卵囊密度小幅減少(66.3%→63.3%)。PSOP25 基因敲除實驗表明，該基因可顯著影響動合子成熟及中腸卵囊的形成[45]。以上研究結果為PSOP7和PSOP25蛋白成為潛在的TBVs候選抗原奠定了堅實的基礎。除此之外，我們對另外兩個公認的動合子階段蛋白(即PBANKA_111920和PBANKA_145770)的研究發(fā)現(xiàn)，使用該重組蛋白免疫小鼠后可顯著降低卵囊密度(60.0%～70.7%)及適度抑制卵囊形成(10.7%～37.4%)[46]。盡管TBV在病媒傳播疾病方面的研究已取得了重大進展，然而目前候選TBVs抗原尚為有限，亟待識別新的抗原，未來仍需更進一步的深入研究[47]。

4 多抗原、多表位重組瘧疾疫苗(Multi-antigen/Multi-epitope recombinant malaria vaccines)

瘧原蟲進化中抗原的不斷變異為其逃避宿主免疫捕獲提供了可能，與此同時也增加了相關疫苗研發(fā)的難度。由于蟲體相關抗原多種多樣，變異廣泛，不同抗原又存在各異的抗原決定簇(Antigenic determinant，AD)，即抗原表位。僅針對某一抗原或單一表位的抗瘧疫苗有時并不能發(fā)揮預期的療效，因此針對多種抗原、不同抗原表位進行的瘧疾候選疫苗的研發(fā)成為一個新的熱點。多抗原、多表位重組抗瘧疫苗可對人體提供多階段的保護性作用，具有絕對的優(yōu)勢。

重組B疫苗作為第一個具有等位基因特異性效應的血液階段多抗原抗瘧疫苗，它包含MSP1(K1等位基因)、 MSP2(3D7等位基因)及RESA (FCQ-27/PNG 等位基因) 抗原并且與油佐劑 Montanide ISA720 混合使用，在II期臨床試驗中，接種該疫苗的瘧疾暴露兒童感染MSP2的3D7形式的瘧原蟲的幾率小幅下降。

瘧原蟲隨機重組抗原-1(Malaria Random Constructed Antigen-1, M.RCAg-1)包含了來自8種惡性瘧原蟲的11種抗原表位，作為評估流行區(qū)瘧疾傳播強度的一種新的血清學標記物[48]，是公認的可在惡性瘧原蟲感染患者中自然獲得的抗瘧抗體，并且其與間日瘧原蟲感染的交叉反應非常有限。針對這一抗原所研制的候選疫苗(多表位重組蛋白疫苗)已在動物模型中得到證實，其具有較強的免疫原性,并且在體外試驗(invitro)中可以抑制惡性瘧原蟲的生長增殖。但是如果以納米乳單獨作為該重組蛋白疫苗的佐劑，其效應較弱,需要添加其他免疫增強劑。

目前，本實驗室基于聯(lián)合免疫的理論，將已篩選出的具有良好傳播阻斷活性的候選抗原進行兩兩聯(lián)合，即通過構建多抗原重組疫苗的方法以期獲得更好的傳播阻斷效果。在現(xiàn)有P.berghei鼠瘧模型的基礎上展開研究，我們通過原核表達系統(tǒng)表達截短蛋白(截取優(yōu)勢抗原表位區(qū))，并對優(yōu)質候選蛋白進行雙組合，顯著提升了傳播阻斷能力，后續(xù)研究正在進行中。

5 多階段融合蛋白瘧疾疫苗(Multistage fusion protein malaria vaccines)

多階段融合蛋白疫苗的研發(fā)對于間日瘧的控制具有重大意義，這是由于肝階段中存在的休眠子孢子以及早期形成的配子體使得由P.vivax所致的瘧疾在宿主臨床癥狀出現(xiàn)前即可造成傳播。靶向紅前期和有性階段瘧原蟲的多階段瘧疾疫苗可以有效保護個體，不僅可避免由蚊蟲叮咬而引起的感染，同時針對有性階段的瘧原蟲又可產生傳播阻斷活性。這一策略可能預防個體瘧疾的感染，在更大規(guī)模上，也可阻斷流行區(qū)瘧疾在社區(qū)內的傳播。新概念疫苗BDES-Pvs25-PvCSP兼具亞單位疫苗和DNA疫苗的功能，通過在體外實驗中利用桿狀病毒雙表達系統(tǒng)(Baculovirus dual-expression system，BDES)轉導入哺乳動物細胞中可高度表達，并可在病毒包膜上產生Pvs25-PvCSP融合蛋白，具有正確的空間構象，所誘導產生的高滴度抗體在鼠瘧模型(實驗所用瘧原蟲為可表達P.vivax相關抗原的轉基因P.berghei)中可產生誘導性保護效應(43%)以及良好傳播阻斷活性(82%)[49]。

6 展 望

紅前期抗瘧疫苗可規(guī)避向紅內期突破性感染的風險，相當于對原蟲的體內感染進行了源頭的控制，若能借助分子生物學技術進一步對亞單位疫苗RTS,S/AS01進行優(yōu)化，在保證安全的前提下盡早投入臨床使用，其必將成為瘧疾控制的有力工具。此外，可在現(xiàn)有鼠瘧模型的基礎上對孢子蟲相關疫苗(RAS、GAP、CPS等)在人瘧相關研究上繼續(xù)進行探索，如能開發(fā)出對耐藥性惡性瘧原蟲行之有效的疫苗，將對于全球疾控史具有里程碑式的意義。

由于瘧原蟲對人體的致病作用主要是由紅內期原蟲裂體增殖所致，因此這一階段的疫苗對于控制瘧疾發(fā)作具有至關重要的作用。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)的無性血液階段疫苗候選抗原十分有限，未來對潛在的候選抗原的識別是非常必要的。就紅內期亞單位疫苗而言，未來仍需積極尋找合適佐劑提高疫苗的免疫保護效率和延長保護作用的持續(xù)時間。除此之外，或可通過提取紅內期全蟲瘧疾疫苗的有效成分，將其納入多階段抗瘧疫苗的研發(fā)之中，建立抗瘧疫苗新的研究方略。

蚊途徑的傳播是瘧原蟲感染過程中一個主要的瓶頸，而這同時也是對疾病傳播進行干擾的一個主要靶點[50]。傳播阻斷疫苗是目前最為理想、最具潛力的瘧疾疫苗，較之于肝期、紅內期疫苗而言，其可免受宿主機體免疫壓力等因素的影響，因此作為預防性疫苗其前景廣闊。然而目前的研究尚有局限，許多問題亟待解決。倒如，保證重組蛋白異源正確、高效地表達(TBA產生的前提)[51]，如何識別更多潛在的候選抗原等。理論上，血液階段抗瘧疫苗可降低疾病的發(fā)病率，減少死亡率[52]，然而原蟲減毒疫苗的安全性尚存在廣泛爭議，亞單位疫苗的效果也有待提高，如果能對重組蛋白所誘導產生的抗體的保護性效應進行提升，未來必將有所突破。

無論是多抗原、多表位重組疫苗，或者是多階段抗瘧疫苗，其本質都是基于聯(lián)合免疫的理論，我們追求的是產生“1+1≥2”的效應，將不同疫苗間的相互干擾作用降到最低，繼而降低疫苗有效性的風險比率，從而最大限度對人體提供保護性作用，這需要我們通過不斷優(yōu)化疫苗的配方、調整疫苗的有效成分等進行深入探索。除此之外，可以將轉基因瘧原蟲與體內(invivo)前臨床試驗模型結合起來[53]，用以評估候選疫苗的安全性、有效性并發(fā)現(xiàn)關鍵的保護性免疫反應，從而提高疫苗的接種策略。未來的研究或可集中于識別跨階段的保護性瘧疾抗原，從而使多階段抗瘧疫苗的開發(fā)成為可能。

瘧疾疫苗成功的另一關鍵限制因素是在免疫接種后機體難以維持長久的保護性，而這在一定程度上又歸因于抗原免疫原性的缺乏，以及瘧疾本身對宿主反應的抑制。盡管一種高效的針對瘧原蟲的疫苗的開發(fā)已經被證實是非常具有挑戰(zhàn)性的[54]，但是借助蛋白質組學技術將有助于發(fā)現(xiàn)潛在的新候選疫苗抗原[55], 基于擴增的深度測序技術有助于了解潛在的抗原異質性、瘧疾寄生蟲的種群遺傳學因素以及影響復雜、多克隆瘧疾感染的相關因素[56]。一個成功的疫苗既可強烈誘導持續(xù)的保護性免疫反應，又能降低免疫接種后嚴重不良反應(SARS)出現(xiàn)的風險。由于在臨床研制和開發(fā)中，大多數候選疫苗都是高度純化的蛋白質和多肽，它們依賴于佐劑來增強或直接免疫應答[57]。傳統(tǒng)的鋁佐劑因存在毒性而應用受限，可通過尋找新型佐劑(如納米乳佐劑、微晶酪氨酸MCT等)并與之結合使用，在增強免疫原性的同時，使抗體活性的持續(xù)時間延長，繼而研制出理想的抗瘧疫苗。