夏天爽

摘 要：流式細(xì)胞術(shù)作為食品微生物質(zhì)量檢測(cè)的一種手段，不僅能夠在功能水平上對(duì)食品中的微生物進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析和純化分選，還可以對(duì)食品中微生物的物理或化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)量。因此，本文從微生物在食品中的危害、流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)與工作原理、流式細(xì)胞術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用這3個(gè)方面綜述了流式細(xì)胞術(shù)在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，期望為食品中微生物快捷、準(zhǔn)確檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用提供理論參考。

關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞術(shù)? 食品? 微生物? 檢測(cè)

前言

流式細(xì)胞術(shù)是集現(xiàn)代物理電子技術(shù)、激光技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)于一體的先進(jìn)細(xì)胞分析技術(shù)，具有檢測(cè)速度快、檢測(cè)指標(biāo)多、采集數(shù)據(jù)質(zhì)量高、分析全面、分選純度高和分選靈活等特點(diǎn)[1]。目前，流式細(xì)胞術(shù)已廣泛應(yīng)用在臨床醫(yī)學(xué)、食品安全、海洋生物基礎(chǔ)科學(xué)研究等眾多行業(yè)，特別是在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域，流式細(xì)胞術(shù)已成為重要的檢測(cè)手段之一，且呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景和發(fā)展趨勢(shì)。因此，本文就流式細(xì)胞術(shù)在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 微生物在食品中的危害

當(dāng)前，食品中的微生物可分為3類——可用于生產(chǎn)的微生物、引起食品變質(zhì)腐壞的微生物和食源性病原微生物[2]。其中，引起食品變質(zhì)腐壞的微生物和食源性病原微生物是導(dǎo)致食品安全問(wèn)題的主要原因，且此類微生物能夠?qū)θ祟悪C(jī)體造成直接的毒性作用——產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)或?qū)е履c道腹瀉，嚴(yán)重威脅人體健康。如2011年發(fā)生于德國(guó)的“毒黃瓜”事件，因其迅速席卷歐洲和美國(guó)，一度讓人們陷入恐慌，而此次疫情是由出血性大腸桿菌污染所引起，最終造成了12個(gè)國(guó)家近3000人感染，30多人死亡[3]。因此，加強(qiáng)食品中微生物的檢測(cè)不僅有助于防止微生物指標(biāo)不合格的食品流入市場(chǎng)，還能保障食品的安全，滿足人們對(duì)綠色食品的需求。

2 流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)與工作原理

流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)主要由4部分組成，即流動(dòng)室與液流系統(tǒng)、光源與光學(xué)系統(tǒng)、信號(hào)收集與信號(hào)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)與分析系統(tǒng)，其工作原理主要分為分選功能和分析功能。

2.1 流式細(xì)胞儀分選功能的工作原理

目前，流式細(xì)胞儀的分選功能主要由分選器根據(jù)所測(cè)定參數(shù)來(lái)完成。雖然其分選方式分為通道式分選和電荷式分選，但這兩種分選方式都通過(guò)分離含有單細(xì)胞的液滴而實(shí)現(xiàn)。其中，流式細(xì)胞儀分選功能的過(guò)程為：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據(jù)所測(cè)定的參數(shù)由邏輯電路判定是否將被分選，而后由充電電路對(duì)選定細(xì)胞液滴進(jìn)行充電，帶電液滴攜帶細(xì)胞通過(guò)靜電場(chǎng)時(shí)發(fā)生偏轉(zhuǎn)，進(jìn)入收集管路;未被收集的液體以廢液的形式被處理[4，5]。

2.2 流式細(xì)胞儀分析功能的工作原理

當(dāng)前，流式細(xì)胞儀分析功能的實(shí)現(xiàn)主要是通過(guò)3種信號(hào)來(lái)完成，即前向散射光、側(cè)向散射光和熒光信號(hào)。前向散射光的大小與細(xì)胞直徑成正相關(guān)，即細(xì)胞直徑越大，前向散射光越大;細(xì)胞直徑越小，前向反射光越小。側(cè)向散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)的質(zhì)量成正相關(guān)——細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，質(zhì)量越大，側(cè)向散射光越大;細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越簡(jiǎn)單，質(zhì)量越小，側(cè)向散射光越小。而熒光信號(hào)的強(qiáng)度則與細(xì)胞膜表面抗原強(qiáng)度或細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的濃度有關(guān)[5，6]。

3 流式細(xì)胞術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

就目前而言，流式細(xì)胞術(shù)在食品微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用主要可歸納為4個(gè)方面，即細(xì)菌計(jì)數(shù)、微生物活性的檢測(cè)、食物中致病菌的檢測(cè)、益生菌方面的應(yīng)用。

3.1 細(xì)菌計(jì)數(shù)

食品中的細(xì)菌數(shù)量是判定食品受微生物污染程度的重要標(biāo)志。目前，常規(guī)的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法主要為活菌測(cè)定法和直接計(jì)數(shù)法。其中，活菌測(cè)定法主要包括平板計(jì)數(shù)、涂抹法、濾膜法和MPN法;直接計(jì)數(shù)法主要包括自動(dòng)菌數(shù)測(cè)定儀和計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法。但是，以上常規(guī)計(jì)數(shù)方法都存在一定的局限性，例如，細(xì)菌培養(yǎng)受特定培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件限制，死菌和受傷菌不能在檢測(cè)培養(yǎng)基上形成菌落，進(jìn)而導(dǎo)致無(wú)法計(jì)數(shù)。與常規(guī)的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法相比較，流式細(xì)胞術(shù)在進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)時(shí)，不僅無(wú)需使用培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，還能對(duì)受傷菌和死菌進(jìn)行檢測(cè)。Van Nevel S等[7]利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)飲用水中的微生物進(jìn)行常規(guī)評(píng)估，發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞術(shù)可快速準(zhǔn)確地對(duì)飲用水中的細(xì)菌豐度進(jìn)行量化。孫芝楊等[8]研究發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞術(shù)能消除乳制品中蛋白質(zhì)、體細(xì)胞和脂肪的干擾，并可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)乳制品中的細(xì)菌總數(shù)。綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)為食品微生物檢測(cè)中的細(xì)菌計(jì)數(shù)提供了新的思路。

3.2 微生物活性的檢測(cè)

在食品的生產(chǎn)過(guò)程中，對(duì)可用于食品生產(chǎn)的微生物、引起食品變質(zhì)腐壞的微生物和食源性病原微生物的活性進(jìn)行檢測(cè)，不僅能有效評(píng)價(jià)益生菌等產(chǎn)品的質(zhì)量，還可有效評(píng)價(jià)食品的滅菌效果。姜?jiǎng)P[9]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞術(shù)能夠檢測(cè)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的活菌數(shù)量，進(jìn)而評(píng)價(jià)發(fā)酵乳制品中的乳酸菌含量。張波等[10]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞術(shù)可用于啤酒酵母生長(zhǎng)的檢測(cè)，且該方法快捷、可靠。綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)可廣泛應(yīng)用于微生物活性檢測(cè)當(dāng)中。

3.3 食品中致病菌的檢測(cè)

食品在原料、生產(chǎn)、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸和銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)常常與土壤、水、操作人員、加工設(shè)備和包裝材料等發(fā)生不同方式的接觸，進(jìn)而容易引起微生物污染，并導(dǎo)致食源性疾病的爆發(fā)。目前，隨著人們對(duì)綠色食品要求的不斷提高，衛(wèi)生監(jiān)管力度的不斷加強(qiáng)，食品中微生物的檢測(cè)方法也在不斷完善。流式細(xì)胞術(shù)作為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的先進(jìn)技術(shù)，已成功應(yīng)用到食品中大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、霉菌和單增李斯特菌等致病菌的檢測(cè)之中。Williams A J等[11]基于流式細(xì)胞術(shù)建立了一種檢測(cè)菠菜中大腸桿菌O157：H7的新方法，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，新建立的方法優(yōu)于傳統(tǒng)的細(xì)菌分析方法。黃韻[12]采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)冷鮮肉中的單增李斯特菌進(jìn)行檢測(cè)，并與平板計(jì)數(shù)法、PMA-qPCR技術(shù)進(jìn)行比對(duì)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞術(shù)優(yōu)于平板計(jì)數(shù)法和PMA-qPCR技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)之所以能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中的致病菌，主要是因?yàn)橹虏【?jīng)過(guò)熒光染料處理后，在特定波長(zhǎng)激發(fā)光的激發(fā)下會(huì)產(chǎn)生熒光，并被流式細(xì)胞儀的信號(hào)收集與轉(zhuǎn)換系統(tǒng)收集，進(jìn)而特異性的檢測(cè)致病菌。

3.4 益生菌方面的應(yīng)用

益生菌作為一類能夠定植于人體腸道和生殖系統(tǒng)內(nèi)的有益微生物，不僅能夠促進(jìn)人體腸道微生態(tài)的平衡，還可提高人體對(duì)細(xì)菌病毒感染的抵抗能力。鄭亦舟等[13]研究發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞術(shù)可快速地對(duì)市場(chǎng)上含有保加利亞乳桿菌飲料中的活性菌進(jìn)行有效的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。杜耿記等[14]應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)建立了一種酸奶中乳酸菌含量的快速檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)該方法可大幅度縮短培養(yǎng)時(shí)間，且準(zhǔn)確率較高。綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)不僅可對(duì)含有微生物的食品進(jìn)行有效的監(jiān)測(cè)和放行，還有助于食品企業(yè)對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行自查、自檢。

4 結(jié)語(yǔ)

流式細(xì)胞術(shù)可直接對(duì)部分食品中的微生物進(jìn)行檢測(cè)，這不僅能夠極大縮短檢測(cè)時(shí)間，且獲得檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率較高。此外，隨著流式細(xì)胞儀產(chǎn)品的不斷更新，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的計(jì)數(shù)和識(shí)別等已實(shí)現(xiàn)多參數(shù)、多色熒光分析，且應(yīng)用范圍愈發(fā)廣泛。但流式細(xì)胞術(shù)在食品微生物檢測(cè)過(guò)程中也存在一定的局限性和欠缺，如食品中含有不同的基質(zhì)，且成分復(fù)雜，而流式細(xì)胞儀只能對(duì)細(xì)胞或生物顆粒乃至具有可溶性的生物分子進(jìn)行直接的檢測(cè)和分析;食品中含有的不同基質(zhì)需要不同的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，但標(biāo)記后的不同基質(zhì)存在熒光信號(hào)重疊現(xiàn)象，而重疊區(qū)域越大熒光信號(hào)檢測(cè)的準(zhǔn)確性越低;部分待檢查的食品細(xì)胞或生物顆粒自身大都攜帶基礎(chǔ)熒光，而這些基礎(chǔ)熒光的存在可能對(duì)檢查結(jié)果造成干擾;流式細(xì)胞術(shù)在檢測(cè)食品微生物時(shí)，其中的熒光染料能夠使食品中的基質(zhì)出現(xiàn)特異性熒光，而熒光染料具有一定的局限性，不能滿足食品中復(fù)雜基質(zhì)的檢測(cè)等。

參考文獻(xiàn)：

[1] 梁智輝，朱慧芬，陳九武.流式細(xì)胞術(shù)基本原理與實(shí)用技術(shù)[M].華中科技大學(xué)出版社，2008.

[2] 張新武，杜小波，徐素玲，等.食品中微生物危害的分析和控制[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2014（10）：3295-3299.

[3] 李乾學(xué).大腸桿菌超突變子產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)及其在耐藥性發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的作用[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2007.

[4] 吳后男.流式細(xì)胞術(shù)原理與應(yīng)用教程[M].北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2008.

[5] 王書奎，周振英.實(shí)用流式細(xì)胞術(shù)彩色圖譜[M].第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2004.

[6] 趙云.肉桂抑菌物提取工藝優(yōu)化及其抑菌機(jī)理研究[D].南京市：南京師范大學(xué)，2013.

[7] Van Nevel S， Koetzsch S， Proctor C R， et al. Flow cytometric bacterial cell counts challenge conventional heterotrophic plate counts for routine microbiological drinking water monitoring[J]. Water Research， 2017， 113：191-206.

[8] 孫芝楊，黃闖，李新建，等.流式細(xì)胞法對(duì)乳制品中細(xì)菌總數(shù)的快速檢測(cè)研究[J].食品工業(yè)，2016（11）：180-182.

[9] 姜?jiǎng)P.基于流式細(xì)胞術(shù)的乳酸菌快速計(jì)數(shù)方法研究和活性判定[D].上海市：上海師范大學(xué)，2018.

[10] 張波，陳君，盧啟威，等.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)啤酒酵母在含油酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的定量研究[J].現(xiàn)代儀器，2008（02）：19-23.

[11] Williams A J， Cooper W M， Summage-West C V， et al. Level 2 validation of a flow cytometric method for detection of Escherichia coli O157：H7 in raw spinach[J]. International Journal of Food Microbiology， 2015， 215：1-6.

[12] 黃韻.冷鮮肉中單增李斯特菌活菌分子檢測(cè)技術(shù)研究[D].廣州市：華南理工大學(xué)，2014.

[13] 鄭亦舟，王杰，劉洋，等.基于流式細(xì)胞術(shù)的保加利亞乳桿菌活性檢測(cè)方法的應(yīng)用研究[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2019，10（03）：33-36.

[14] 杜耿記，金珠，吳小慧，等.流式細(xì)胞儀快速檢測(cè)酸奶中乳酸菌含量[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2017（07）：450-454.