趙玉叢，王篤學，鄒華威

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 動物醫(yī)藥學院，河南 鄭州 450046)

辛伐他汀(Simvastatin ，SV)是一種新型的調脂藥物，可以通過抑制內源性膽固醇的合成，達到調節(jié)機體中血脂的作用，是治療高脂血癥的首選藥物之一[1,2]。為了進一步研究辛伐他汀的體內代謝，為其在人體內的生物利用度研究提供依據(jù)，本試驗用雄性比格犬作為實驗動物，采用LC-MS/MS聯(lián)用技術，用單劑量辛伐他汀片灌服比格犬后，測定了SV在比格犬體內的血藥濃度，使用WinNonlinV5.2.1統(tǒng)計軟件計算出藥動學參數(shù)，并與同類文獻中SV的藥動學相關數(shù)據(jù)進行了對比。

1 材料

1.1 試藥

辛伐他汀片(北京萬生藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，規(guī)格:40mg/片)；辛伐他汀對照品(購于中國藥品生物制品檢定所，純度：100.0%)；內標:普萘洛爾(Propranolol，上海睿智化學研究有限公司提供)。

1.2 儀器

LC-MS/MS-21 (API6500, Qtriple)(日本島津公司產(chǎn)品)、XW-80A旋渦混合儀(海門其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品)、5415R型臺式低溫離心機(艾本德中國有限公司產(chǎn)品)。

1.3 動物

健康雄性比格犬3只(編號分別為1號犬，2號犬，3號犬)，體重7kg-10 kg，由上海睿智化學研究有限公司大動物研究中心提供。實驗前正常飼養(yǎng)2周且未服任何藥物。并在實驗前12h禁止喂食，但是可以飲水。

2 LC-MS/MS分析條件

2.1 色譜條件

waters BEH C18色譜柱(2.1×50 mm, 1.7 μm)，柱溫60 ℃；流動相選擇A、B混合流動相進行梯度洗脫，流速0.6 mL·min-1(見表1，其中A為含0.025%甲酸和1 mmol·L-1醋酸銨的水溶液，B為含0.025%甲酸和1 mmol·L-1醋酸銨的甲醇溶液)；進樣量10 μL。

2.2 質譜條件

采用ESI離子源，MRM檢測模式，MRM監(jiān)測離子對為辛伐他?。篞1/Q3 Masses: 441.50/325.20 Da，內標普萘洛爾：Q1/Q3 Masses: 260.10/116.20 Da。

表1 梯度洗脫條件

3 方法與結果

3.1 對照品儲備液及內標溶液的配制

配制濃度為200 μg·mL-1的辛伐他汀母液，再將辛伐他汀母液用乙腈-水(v/v，1：1)稀釋，得濃度分別為0.02、0.04、0.2、0.6、2、6、20 μg·mL-1的對照品儲備液，冰箱冷藏保存。

精密稱取適量內標普萘洛爾，用乙腈溶解配制成1 mg·mL-1的普萘洛爾儲備液，在4℃的冰箱中保存。臨用前用乙腈稀釋得內標溶液(濃度40 ng·mL-1)。

3.2 標準血漿樣品的配制

分別取各對照品儲備液10 μL于干燥離心管中，再加入內標溶液(普萘洛爾濃度為40 ng·mL-1)10 μL，再加入空白血漿180 μL，配成辛伐他汀濃度分別為 1、2、10、30、100、300、1000 ng·mL-1的系列標準血漿樣品，冰箱冷藏保存。

3.3 給藥劑量的確定

于實驗前將3只雄性比格犬分別稱重，稱其體重分別為7.67 kg，7.84 kg，7.76 kg。根據(jù)表2中不同實驗動物與人等效劑量比值，查得犬與人的等效劑量比為1.87。按阿伐他汀的人用劑量每日0.5 mg/kg，計算得出1號、2號、3號比格犬有效給藥劑量分別為7.133 mg、7.291 mg、7.217 mg。取1片辛伐他汀片(規(guī)格為40 mg/片)稱其質量為224.6 mg，最終計算得出1號、2號、3號比格犬分別給予辛伐他汀片的質量為40.1 mg、40.9 mg和40.5 mg。

將辛伐他汀片粉碎均勻，分別稱取40.1 mg、40.9 mg、40.5 mg裝入3只膠囊中并編號為1、2、3。

表2 不同實驗動物與人等效劑量比值(劑量按mg/kg算，人按60kg算)

3.4 血漿樣品的采集

利用給藥器將3只膠囊分別對相應編號的比格犬進行給藥，在給藥之前及給藥之后的0.083 h、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、24 h作為采血時間點，分別從比格犬前肢橈靜脈采取0.5 mL血液，置于加有EDTA-K2抗凝劑的離心管中，混勻，離心5 min(離心條件4 ℃、3 000 r·min-1)，將上清液在-80 ℃的條件下冷凍保存、備用。

3.5 血漿樣品的處理

將上述條件下保存的血漿樣品在室溫下融化后，取30 μL置于EP管中，再在EP管中加入150 μL含有內標普萘洛爾(濃度為40 ng·mL-1)的乙腈，渦旋振蕩混合5 min后，在轉速為5 800 r·min-1的條件下離心10 min，取2 μL上清液，注入LC-MS/MS儀中進行分析。

3.6 方法學考察

3.6.1 專屬性考察

按上述色譜-質譜條件，分別測定來自6個不同樣本的空白血漿、空白血漿添加SV和內標、及給藥后4 h的血漿樣品，結果顯示SV和內標普萘洛爾的保留時間分別是1.21 min和1.03 min，二者可以完全分離，表明SV和內標的測定不受血漿中其他內源性物質的干擾。

3.6.2 標準曲線和定量下限

將“3.2”項下制得的標準血漿樣品，按“3.5”項下方法處理后分別進樣分析。以比格犬血漿中SV的濃度為橫坐標，以SV與內標Propranolol的峰面積比為縱坐標，采用加權最小二乘法進行回歸計算，得回歸方程Y=0.0027X-0.004 (r=0.99993)，SV血漿濃度在1-1000 ng·mL-1范圍內線性關系良好。以標準曲線的最低點濃度作為最低定量限，定量下限為1 ng·mL-1。

3.6.3 回收率考察

取高(3 μg·mL-1)、中(1 μg·mL-1)、低(0.1 μg·mL-1)濃度的標準血漿樣品、每個濃度各5份作為質控樣品，按“3.5”項下方法處理后，計算提取回收率，用標準曲線計算方法回收率，結果見表3。由表3中可知SV的回收率考察結果均滿足生物樣品分析的要求。

表3 血漿中SV的回收率(%，n=5)

3.6.4 精密度考察

取上述高(3 μg·mL-1)、中(1 μg·mL-1)、低(0.1 μg·mL-1)濃度質控樣品，每個濃度各取5份，按“3.5”項方法處理，計算日內精密度。每天取上述濃度質控樣品，每個濃度各取3份，連續(xù)3 d按“3.5”項下處理，計算日間精密度。結果見表4，RSD均小于6%，滿足測定要求。

表4 SV的日內、日間精密度(%，n=5)

3.7 血藥濃度-時間曲線與藥代動力學參數(shù)

分別于上述色譜-質譜條件下，測定各時間點3只比格犬血漿中SV的濃度，數(shù)據(jù)見表5。3只健康雄性比格犬在口服阿伐他汀片(口服劑量為0.93 mg/kg)后的血藥濃度-時間曲線見圖1。

將按上述色譜-質譜條件所測得的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)用WinNonlin V5.2.1統(tǒng)計軟件選擇非房室模型進行計算，得到SV在比格犬體內的主要藥代動力學參數(shù)。SV在比格犬血漿中的末端消除速率(Ke)選擇末端消除法來進行計算，在比格犬體內的藥時曲線下面積(AUC)選擇線性梯形法或者對數(shù)梯形法來進行計算。

表5 各時間點3只比格犬血漿中SV的濃度

圖1 3只健康雄性比格犬口服辛伐他汀片的血藥濃度-時間曲線

選擇非房室模型來計算辛伐他汀在比格犬體內的主要藥代動力學參數(shù)，計算結果見表6。由表6可知，辛伐他汀在3只健康雄性比格犬體內的藥代動力學參數(shù)差異較為明顯。

表6 SV在比格犬體內的主要藥代動力學參數(shù)

4 討論與結論

臨床應用劑量的辛伐他汀在體內經(jīng)肝臟代謝后，血藥濃度較低，要對SV進行定量測定必須要求所用的分析方法有極高的靈敏度，故一般的HPLC方法難以滿足其分析要求。本試驗建立了SV在比格犬體內血漿中的HPLC-MS/MS分析方法，該方法分析時間短(僅1.21 min)、靈敏度高、專屬性強、樣品處理簡單、定量下限較低(1 ng·mL-1)，可滿足辛伐他汀在比格犬體內血藥濃度的測定及藥代動力學研究的要求。

本試驗中血樣直接用乙腈沉淀蛋白后進樣分析，省略了萃取、過固相柱等繁瑣步驟，與文獻方法比較[3-5]，該方法操作簡單、內源性物質干擾少、成本低、提高了樣品處理效率，適用于大批量生物樣品濃度的檢測。

本試驗中辛伐他汀在3只雄性比格犬體內的藥動學參數(shù)差異較大，與文獻報道一致[6-8]，就本試驗來分析，原因可能與比格犬個體化差異大有關，這提示臨床用藥時要注意個體化給藥。本試驗的研究可為辛伐他汀藥物的臨床合理應用提供參考價值。