莫非，王桂芳

1. 上海健康醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 201318； 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院呼吸科，上海 200040

曲霉屬(Aspergillus)有200余種，包括黑曲霉(Aspergillusniger)、黃曲霉(Aspergillusflavus)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)等。其中煙曲霉是臨床上最常見(jiàn)的致病性曲霉，可導(dǎo)致過(guò)敏性哮喘、煙曲霉腫和侵襲性煙曲霉病，后者可播散至全身多個(gè)器官，肺是主要靶器官，尤其易發(fā)生于免疫低下人群。國(guó)內(nèi)流行病學(xué)資料顯示，在非血液惡性疾病中，肺曲霉病居肺真菌病首位，比例達(dá) 37.9%[1]。目前，煙曲霉感染存在早期診斷困難、治療藥物不良反應(yīng)大及易耐藥等問(wèn)題[2]，臨床治療十分棘手。系列報(bào)道表明，正常環(huán)境暴露與煙曲霉感染率上升沒(méi)有必然聯(lián)系；但接受化療等免疫力低下人群中煙曲霉感染率明顯高于正常人群，表明在人體免疫力正常時(shí)煙曲霉難以入侵，免疫低下時(shí)易被煙曲霉侵襲[3]。在煙曲霉與機(jī)體相互作用中，機(jī)體免疫狀態(tài)是首要因素。前期研究顯示，天然免疫在抗煙曲霉感染尤其是早期進(jìn)程干預(yù)中起決定性作用，其中單核細(xì)胞的直接殺傷作用僅次于中性粒細(xì)胞[4-5],并間接參與抗感染調(diào)節(jié)，具有早期抵御和診斷價(jià)值，頗受關(guān)注。本文對(duì)近年來(lái)有關(guān)單核細(xì)胞在煙曲霉感染中作用的研究進(jìn)行綜述。

1 煙曲霉的生物學(xué)特性

1.1 煙曲霉大小與溫度適應(yīng)性

煙曲霉在自然界中廣泛存在，孢子直徑2～3 μm，易吸入經(jīng)氣道直達(dá)肺泡。其胞壁富含疏水蛋白，易分散于空氣中，且在一定濕度范圍內(nèi)變化不大，較其他同等大小的孢子更易被肺泡攝取。煙曲霉孢子最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，pH 3.7～7.6，但在12～65 ℃和pH 2.1～8.8 環(huán)境中仍可分離到煙曲霉孢子。與其他真菌孢子相比，煙曲霉孢子表面存在厚厚的外膜，具有耐熱、耐冷凍、耐壓力和耐干燥特性。70 ℃處理30 min仍保持活性，在液氮中可存活18年，凍干脫水狀態(tài)下可存活60年，這種能在超一般溫度下生存的機(jī)制尚不清楚[3]。Albrecht等分析煙曲霉30～48 ℃的蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)變化在2 h內(nèi)已發(fā)生，且一些蛋白持續(xù)增高，如熱休克蛋白。這是否與煙曲霉耐熱性直接相關(guān)，有待探討[6]。

1.2 煙曲霉自身組分

煙曲霉細(xì)胞壁是與宿主首先接觸的成分，在培養(yǎng)條件和環(huán)境壓力改變時(shí)會(huì)不斷發(fā)生變化。煙曲霉細(xì)胞壁由β-(1,3)葡聚糖、β-(1,4)葡聚糖、α-(1,3)葡聚糖、幾丁質(zhì)和半乳甘露聚糖組成，其中β-(1,3)葡聚糖和半乳甘露聚糖具有強(qiáng)免疫原性，是重要病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)。β-葡聚糖存在于幾乎所有真菌，已用于侵襲性真菌病診斷( G試驗(yàn))；同時(shí)單核細(xì)胞通過(guò)Dectin-1識(shí)別真菌孢子表面β-D-葡聚糖而吞噬真菌孢子[7]。煙曲霉孢子較其他曲霉屬孢子表面有較多帶負(fù)電荷的唾液酸殘基存在，更易定植于宿主細(xì)胞表面[8]。

煙曲霉細(xì)胞壁表面疏水蛋白參與生物膜形成，也與其致病性有關(guān)。疏水蛋白R(shí)odA在煙曲霉分生孢子表面聚集成有規(guī)律的簇狀結(jié)構(gòu)，形成表面疏水膜，有助于避開(kāi)免疫細(xì)胞識(shí)別[9]。破壞rodA基因?qū)е聼熐规咦訉?duì)膠原蛋白和白蛋白的黏附力下降，敲除該基因后煙曲霉仍具有致病性，但對(duì)肺部炎癥反應(yīng)減弱[10]。此外，煙曲霉細(xì)胞壁中含有1,8二羥基萘黑色素，呈藍(lán)綠色，可保護(hù)孢子抵御紫外線照射[11]。該色素缺失會(huì)使煙曲霉產(chǎn)生白色孢子，導(dǎo)致其致病性減弱并對(duì)氧化劑更敏感，更易被宿主免疫系統(tǒng)捕獲及清除。

1.3 煙曲霉代謝產(chǎn)物

煙曲霉的代謝產(chǎn)物主要是毒素和蛋白酶類，可幫助其適應(yīng)不同環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)需求，與煙曲霉孢子在自然界中的廣泛分布有關(guān)[3]。其中，對(duì)膠霉毒素的研究較多。膠霉毒素被宿主細(xì)胞吸收后，通過(guò)與靶蛋白形成二硫鍵，使靶蛋白失活，并通過(guò)誘導(dǎo)單核細(xì)胞凋亡而抑制宿主免疫應(yīng)答[12]。小鼠實(shí)驗(yàn)提示，感染早期膠霉毒素生物合成活躍，提示膠霉毒素是煙曲霉的重要侵襲因素，同時(shí)受損的宿主細(xì)胞進(jìn)一步被蛋白酶利用，為煙曲霉提供能量。煙曲霉產(chǎn)生豐富的糖基化水解酶和胞外蛋白酶，有助于其通過(guò)降解宿主細(xì)胞的胞壁多糖和蛋白質(zhì)獲取氮源[3,13]。此外，富含特殊功能的酶類也是煙曲霉的優(yōu)勢(shì)之一，其中抗氧化系列超氧化物歧化酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、過(guò)氧化氫酶可有效清除活性氧，相應(yīng)酶基因缺失可導(dǎo)致菌株在免疫低下小鼠模型中致病力降低[7,14]。

2 單核細(xì)胞的生物學(xué)特性

單核細(xì)胞源自骨髓，可分化為樹(shù)突細(xì)胞和組織中的巨噬細(xì)胞，也可直接參與抗病原體反應(yīng)或間接激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞而啟動(dòng)適應(yīng)性免疫發(fā)揮保護(hù)作用[15]。近年研究已明確單核細(xì)胞及其前體特征[16]。早期研究認(rèn)為單核細(xì)胞亞群包括CD14+CD16-/CD14+CD16+，人類90%的循環(huán)單核細(xì)胞為CD14+CD16-單核細(xì)胞。Serbina等分離了干細(xì)胞捐獻(xiàn)者的CD14+CD16-和CD14+CD16+單核細(xì)胞，比較吞噬和抗真菌效果。觀察到兩個(gè)亞群的單核細(xì)胞均可有效吞噬煙曲霉孢子，CD14+CD16-亞群煙曲霉孢子發(fā)芽伴隨少量腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)分泌，相反CD14+CD16+亞群可分泌大量TNF[17]。近年來(lái)，根據(jù)表面分子表達(dá)情況，單核細(xì)胞可進(jìn)一步細(xì)分為經(jīng)典型(CD14++CD16-)、中間型(CD14++CD16+)和非經(jīng)典型(CD14+CD16++)單核細(xì)胞。目前認(rèn)為，經(jīng)典型單核細(xì)胞吞噬能力最強(qiáng)，中間型單核細(xì)胞呈遞抗原，非經(jīng)典型單核細(xì)胞作為巡邏細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)。關(guān)于對(duì)應(yīng)型別細(xì)胞因子的分泌報(bào)道不一，可能與刺激因子和細(xì)胞狀態(tài)不同有關(guān)。3種型別單核細(xì)胞與成熟度有關(guān)，可互相轉(zhuǎn)化，核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)可能是重要轉(zhuǎn)錄因子[18]。鑒于單核細(xì)胞異質(zhì)性較強(qiáng)，進(jìn)行分子標(biāo)記結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察的綜合分析更有必要。人與小鼠單核細(xì)胞的同源性較高，很多功能實(shí)驗(yàn)借助于小鼠模型觀察完成，小鼠CX3CR1intLy6Chi單核細(xì)胞亞群中，CD14++CD16-與CD14++CD16+單核細(xì)胞亞群具有相似功能，而小鼠CX3CR1hiLy6Clow/-單核細(xì)胞亞群則對(duì)應(yīng)人CD14+CD16++單核細(xì)胞亞群[19-20]。

3 單核細(xì)胞與煙曲霉相互作用

3.1 煙曲霉刺激人單核細(xì)胞蛋白表達(dá)變化

使用煙曲霉孢子刺激健康人單核細(xì)胞，與對(duì)照組相比，刺激后單核細(xì)胞有超過(guò) 1 800 個(gè)基因表達(dá)[21]；進(jìn)一步刺激，有超過(guò)400個(gè)基因單獨(dú)表達(dá)于對(duì)煙曲霉孢子有反應(yīng)的單核細(xì)胞，而不表達(dá)于脂多糖刺激的單核細(xì)胞，提示了單核細(xì)胞抗煙曲霉孢子的獨(dú)特性[22]。Loeffler等設(shè)計(jì)不同狀態(tài)孢子與單核細(xì)胞共孵育，并動(dòng)態(tài)記錄。結(jié)果顯示，靜息、腫脹和萌芽3種狀態(tài)的孢子3 h內(nèi)均被攝入?；蛐酒@示，伴隨孢子萌芽，免疫相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。其中白細(xì)胞介素8(interleukin 8，IL-8)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白3α(macrophage inflammatory protein 3α，MIP-3α)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1/CCL2)可能是關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[23]。將人全血與煙曲霉菌絲共孵育，分離各白細(xì)胞亞群，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)到單核細(xì)胞內(nèi)TNF-α表達(dá)增高并依賴血漿組分，用針對(duì)表面分子CD14的抗體處理后可抑制TNF-α釋放[24]。血漿中單核細(xì)胞的協(xié)同成分還不清楚，此前有學(xué)者體外觀察到粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)可增強(qiáng)單核細(xì)胞抗真菌作用，其中促進(jìn)超氧離子釋放可能是機(jī)制之一。通過(guò)比對(duì)分析單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞中抗煙曲霉感染潛在基因的表達(dá)與多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)IL-1和IL-15信號(hào)通路在其中有重要作用[25]。

3.2 煙曲霉對(duì)人單核細(xì)胞凋亡的影響

在機(jī)體免疫細(xì)胞與病原體相互作用過(guò)程中，細(xì)胞凋亡頗受關(guān)注。體外血清學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察到，用煙曲霉膠霉毒素處理后，單核/淋巴細(xì)胞比例降低伴隨含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3)活化，表明該毒素介導(dǎo)單核細(xì)胞及單核細(xì)胞來(lái)源的CD83+樹(shù)突細(xì)胞凋亡而發(fā)揮免疫抑制作用[12]。也有研究顯示，煙曲霉孢子可通過(guò)阻止細(xì)胞色素C釋放而保護(hù)線粒體，發(fā)揮凋亡調(diào)節(jié)作用。煙曲霉是促單核細(xì)胞凋亡還是抗凋亡？這一過(guò)程如何發(fā)展？對(duì)機(jī)體影響怎樣？是不利于抗感染還是有助于機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定？德國(guó)科學(xué)家運(yùn)用遙感光譜成像技術(shù)觀察單個(gè)凋亡的單核細(xì)胞，借助升級(jí)版熒光顯微鏡，動(dòng)態(tài)檢測(cè)胞內(nèi)pH值，綜合分析色素化孢子對(duì)凋亡單核細(xì)胞命運(yùn)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑色素化的煙曲霉孢子可幫助凋亡單核細(xì)胞從線粒體酸化狀態(tài)中恢復(fù)[26]，重新開(kāi)始細(xì)胞周期，表明煙曲霉孢子對(duì)不同狀態(tài)細(xì)胞有不同作用。推測(cè)原因，可能二羥基萘 (dihydroxynaphthalene，DHN)黑色素是很好的電子接受體，可捕獲凋亡過(guò)程中產(chǎn)生的自由基[27-28]。這種基于經(jīng)典光譜測(cè)量和傳統(tǒng)數(shù)字圖像處理發(fā)展起來(lái)的遙感光譜成像技術(shù)，可詳細(xì)記錄單個(gè)樣品不同角度的光譜信息，并能實(shí)時(shí)定量分析，從而用于凋亡機(jī)制研究。

3.3 不同煙曲霉株對(duì)人單核細(xì)胞功能的影響

不同來(lái)源的煙曲霉株對(duì)人單核細(xì)胞氧化應(yīng)激功能是否有差異？法國(guó)學(xué)者Pastor等通過(guò)平均熒光強(qiáng)度比較不同煙曲霉株對(duì)人單核細(xì)胞氧化爆發(fā)活動(dòng)的影響，觀察7株來(lái)源于侵襲性曲霉病患者和11株來(lái)源于支氣管的定植菌對(duì)單核細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。結(jié)果未發(fā)現(xiàn)侵襲組與定植組有顯著差異，但結(jié)合序列特異性DNA引物(sequence-specific DNA primer，SSDP)分型方法觀察到單核細(xì)胞色素缺失株的氧化應(yīng)激反應(yīng)與其他非缺失株存在顯著差異[29]。該研究表明，煙曲霉入侵結(jié)局更側(cè)重于人體免疫狀態(tài)，可通過(guò)研究前向和側(cè)向散射光物理參數(shù)進(jìn)行細(xì)胞分類。但鑒于單核細(xì)胞群體的較強(qiáng)異質(zhì)性，細(xì)胞分類需更準(zhǔn)確定位。

3.4 體內(nèi)環(huán)境模擬嘗試

Chandorkar等建立了人支氣管和小氣道上皮細(xì)胞3D動(dòng)力模型[30]。運(yùn)用氣液相界面(air liquid interphase，ALI)系統(tǒng)培養(yǎng)正常人支氣管和小氣道上皮細(xì)胞，保障上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、纖毛運(yùn)動(dòng)和屏障作用。在氣流推動(dòng)下，上皮細(xì)胞分化加速，培養(yǎng)穩(wěn)定后加入單核細(xì)胞來(lái)源的抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)共培養(yǎng)，加入煙曲霉孢子，模擬體內(nèi)感染。借助不同顏色的熒光染料標(biāo)記，在激光共聚焦顯微鏡下結(jié)合三維成像技術(shù)，研究APC攝取真菌孢子的過(guò)程。結(jié)果觀察到真菌孢子可被巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞有效捕獲，如果沒(méi)有加入真菌孢子則APC未見(jiàn)活化跡象。該系統(tǒng)運(yùn)用ALI系統(tǒng)培養(yǎng)原代氣道上皮細(xì)胞，更好地模擬了體內(nèi)環(huán)境，比傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)體系更有效，但費(fèi)用較高。

3.5 小鼠單核細(xì)胞抗煙曲霉效應(yīng)

單核細(xì)胞體內(nèi)實(shí)驗(yàn)一般以小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)熒光標(biāo)記、基因敲除等多種手段研究其功能。Jhingran等設(shè)計(jì)構(gòu)建FLARE(fluorescentAspergillusreporter)孢子模型，通過(guò)兩種熒光素分別顯示存活和被細(xì)胞攝入后的煙曲霉軌跡，觀察其與宿主的相互作用[5]。Espinosa等進(jìn)一步運(yùn)用限制和抗體介導(dǎo)的細(xì)胞缺失策略，研究小鼠體內(nèi)單核細(xì)胞抗真菌的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)以表達(dá)細(xì)胞表面C-C趨化因子受體2[chemokine (C-C motif) receptor 2，CCR2]為標(biāo)記的單核細(xì)胞可快速集中至炎癥部位并產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子。通過(guò)構(gòu)建基因工程小鼠，與CCR2表達(dá)組相比，CCR2缺失組煙曲霉侵襲性感染及中性粒細(xì)胞殺孢子活力降低；且CCR2表達(dá)組肺部單核細(xì)胞及其來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞聚集產(chǎn)生TNF、一氧化氮(nitric oxide，NO)和活性氧，展現(xiàn)了快速有效的殺孢子活力，明確了CCR2+單核細(xì)胞及其來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞在抵御吸入性孢子入侵中的直接和間接作用[4]。

3.6 小鼠單核細(xì)胞抗煙曲霉的信號(hào)分子

小鼠循環(huán)單核細(xì)胞主要分Ly6Chi和 Ly6Clo兩群，Ly6Chi單核細(xì)胞在C-C 趨化因子信號(hào)作用下經(jīng)G蛋白偶聯(lián)CCR2離開(kāi)骨髓[31]。Caffrey等通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IL-1α通過(guò)IL-1受體Ⅰ型(IL-1 receptor type I，IL-1RI)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)C-X-C趨化因子配體1[chemokine (C-X-C motif) ligand 1，CXCL1；也稱neutrophil-activating protein 3，NAP-3]表達(dá)，伴隨白細(xì)胞募集因子釋放；IL-1RI缺失小鼠則需通過(guò)補(bǔ)充細(xì)胞因子募集中性粒細(xì)胞以增強(qiáng)抗真菌能力。CCR2+單核細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)IL-1α和 CXCL1表達(dá)，在中性粒細(xì)胞早期募集中起重要作用，提示IL-1可能是單核細(xì)胞抗煙曲霉通路中的重要信號(hào)分子[32]。此外，TNF也是CCR2+單核細(xì)胞分泌的殺真菌孢子的效應(yīng)分子[33]。目前認(rèn)為，TNF在單核細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染免疫功能中是一把雙刃劍，適度分泌可有效抗感染，過(guò)度活化則會(huì)造成肺組織損傷，不利于遠(yuǎn)期康復(fù)，提示未來(lái)研究需關(guān)注細(xì)胞功能平衡。

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)分泌天然免疫分子、促炎細(xì)胞因子直接殺傷或調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)可能是機(jī)體單核細(xì)胞抗煙曲霉機(jī)制的核心。決定單核細(xì)胞分化與抵御的關(guān)鍵細(xì)胞因子、主要信號(hào)通路、與其他細(xì)胞間的聯(lián)系及其在不同免疫狀態(tài)人群中的功能特征均有待深入研究，以指導(dǎo)臨床抗煙曲霉治療。

天然免疫系統(tǒng)的活化與曲霉種類、形態(tài)學(xué)特征、生長(zhǎng)階段和環(huán)境敏感性等相關(guān)。入侵與抵御是一個(gè)互動(dòng)的過(guò)程，對(duì)生物特性及免疫機(jī)制的認(rèn)識(shí)，有助于探討煙曲霉與人體的相互作用。此外，反應(yīng)適度很重要：免疫應(yīng)答弱，難以阻擋煙曲霉入侵；免疫應(yīng)答過(guò)強(qiáng)，超范圍的炎癥反應(yīng)造成肺組織損傷也不利于患者康復(fù)。在與煙曲霉的相互作用中，免疫平衡是目標(biāo)，早期抵御是關(guān)鍵。