童譯慶，王秋月，李康馨，周子陽(yáng)，方陽(yáng)欣，唐建國(guó)

復(fù)旦大學(xué)附屬第五人民醫(yī)院創(chuàng)傷-急救-危重病醫(yī)學(xué)中心， 上海 200240

隨著人口老齡化、侵入性醫(yī)療操作的增加及廣譜抗生素的應(yīng)用，血流感染和侵襲性真菌感染逐年增加。侵襲性真菌病是重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit，ICU)常見真菌病，病死率極高。白假絲酵母(Candidaalbicans，C.albicans；又稱白念珠菌)是常見的條件性致病真菌，于正常人體呼吸道、消化道、泌尿生殖道均有定植。白念珠菌移位所致感染疾病居侵襲性真菌病首位[1-3]。臨床上念珠菌血癥的診斷主要依靠血培養(yǎng)，但目前陽(yáng)性率不高，因此尋找早期白念珠菌感染的生物標(biāo)記是迄需解決的難題。

代謝組學(xué)(metabonomics)是后基因組學(xué)時(shí)代興起的跨領(lǐng)域?qū)W科，研究生命體被外界刺激后的病理生理變化及自身基因變化等導(dǎo)致的體內(nèi)代謝水平的多元?jiǎng)討B(tài)反應(yīng)[4-5]。非靶向代謝組學(xué)是盡可能多地定性和相對(duì)定量生物體中的代謝物，最大限度地反映代謝物的特點(diǎn)。目前，超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography/quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry，UHPLC-Q-TOF-MS)已廣泛用于代謝組學(xué)研究。親水互相作用色譜(hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC)是專門針對(duì)極性極強(qiáng)的代謝物而開發(fā)的色譜柱，因?yàn)槠溆信c反相液相色譜(reversed phase liquid chromato-graphy，RPLC)互補(bǔ)的選擇性而得到廣泛應(yīng)用[6]。研究表明，親水互相作用色譜-電噴霧電離四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(hydrophilic interaction liquid chromatography-electrospray ionization/quadrupole-time-of-flight mass spectrometry，HILIC-ESI-Q-TOF-MS)能提供中心碳循環(huán)代謝的最大信息量，受到很大關(guān)注[7]。本研究采用HILIC UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)依賴性采集方式對(duì)白念珠菌感染組和對(duì)照組進(jìn)行全譜分析，同時(shí)獲得一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜，然后采用XCMS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取和代謝物鑒定，尋找兩組的差異代謝物，為早期白念珠菌的診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 10231購(gòu)自上海魯微科技有限公司。40只無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)雄性Wistar大鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體重約250 g，其中20只用于構(gòu)造白念珠菌感染模型，20只用于白念珠菌血流感染代謝組學(xué)分析。大鼠飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院動(dòng)物房，于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)2周。

1.2 儀器和試劑

使用的儀器主要有：Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀(AB Sciex公司)、Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜儀(Agilent 公司)、Eppendorf低溫高速離心機(jī)5430R (Eppendorf公司)、色譜柱(Waters公司；型號(hào)：ACQUITY UPLC BEH Amide column 1.7 μm，2.1 mm×100 mm)。試劑主要有：乙腈(Merck公司)、乙酸銨(Sigma公司)、沙氏培養(yǎng)基(Sabouraud dextrose agar，SDA)(上海魯微科技有限公司)、水合氯醛(廣州彬鵬公司)、氫化可的松(天津生物化學(xué)制藥有限公司)。凍存管及EP管購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)用水均為Mili-Q純水儀制備的去離子水。

1.3 方法

1.3.1菌液配制及模型構(gòu)造37 ℃條件下，將白念珠菌于沙氏培養(yǎng)基(2%瓊脂、2%蛋白胨和4%葡萄糖)行平板分離培養(yǎng)，隨后于沙氏液體培養(yǎng)基(2%蛋白胨和4%葡萄糖)中增殖培養(yǎng)，120 r/min搖菌48 h，測(cè)光密度(optical density，OD)并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，倍比稀釋至1×1010CFU/mL、1×109CFU/mL、1×108CFU/mL、1×107CFU/mL、1×106CFU/mL備用。于念珠菌感染大鼠前3 d，每只大鼠每天皮下注射氫化可的松25 mg，第4天用不同密度的菌液尾靜脈注射感染大鼠，共5組，每組4只，注射量為1 mL/100 g。感染24 h后，通過(guò)心臟取血留1 mL全血，處死大鼠，取腎臟、脾臟和肝臟組織，每只大鼠每個(gè)器官取 0.5 g組織，加入2 mL無(wú)菌生理鹽水研磨成組織勻漿。將100 μL全血和組織勻漿于37 ℃沙氏培養(yǎng)基行平板分離并培養(yǎng)48 h，然后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。通過(guò)觀察大鼠精神狀態(tài)、感染24 h后器官中白念珠菌負(fù)荷及該時(shí)段內(nèi)大鼠存活情況來(lái)篩選合適的模型。

1.3.2動(dòng)物模型建立將大鼠隨機(jī)分為白念珠菌組10只、正常對(duì)照組10只。白念珠菌組注射白念珠菌菌液(2.5×108CFU)，建模方法同模型構(gòu)造，正常對(duì)照組注射無(wú)菌生理鹽水，注射量均為1 mL/100 g。白念珠菌組于感染后24 h通過(guò)心臟取血收集血液標(biāo)本，放入乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝管中，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝血漿并于 -80 ℃儲(chǔ)存。

1.3.3樣品預(yù)處理于4 ℃緩慢解凍后分裝，每100 μL加入400 μL預(yù)冷的甲醇/乙腈(體積比1∶1)溶液，振蕩混勻，-20 ℃靜置10 min。4 ℃ 14 000 r/min離心15 min，取上清液，凍干，用100 μL乙腈/水(體積比1∶1)溶液復(fù)溶待用。

1.3.4樣品分析條件①色譜條件：采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)HILIC進(jìn)行分離，柱溫25 ℃，流速 0.3 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。流動(dòng)相組成A：水+25 mmol/L乙酸銨+25 mmol/L氨水；組成B：乙腈。洗脫程序如表1所示。②質(zhì)譜條件：采用ESI模式。超高效液相色譜分離后，用Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀進(jìn)行分析：霧化氣氣壓60 psi(413 685 Pa)，輔助氣氣壓60 psi(413 685 Pa)，氣簾氣壓30 psi(206 842 Pa)，溫度600 ℃，毛細(xì)血管電壓 5 500 V，去簇電壓±60 V，碰撞能量(35±15)eV。TOF-MS掃描范圍：60～1 000 Da；子離子掃描范圍：25～1 000 Da。TOF-MS掃描累積時(shí)間 0.20 s/譜圖，產(chǎn)物離子掃描累積時(shí)間 0.05 s/譜圖。二級(jí)質(zhì)譜采用信息依賴性采集(information-dependent acquisition，IDA)，高靈敏度模式。

表1 色譜洗脫程序

1.4 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)通過(guò)XCMS軟件進(jìn)行鋒對(duì)齊、保留時(shí)間矯正和提取峰面積。對(duì)XCMS軟件提取的數(shù)據(jù)，刪除組別總和>2/3的離子峰，應(yīng)用SIMCA-P14.1 版本(瑞典Umetrics公司)進(jìn)行模式識(shí)別，Pareto-scaling預(yù)處理后進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，包括無(wú)監(jiān)督的主成分分析(principal component analysis，PCA)、有監(jiān)督的偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal PLS-DA，OPLS-DA)。選擇變量投影重要度(variable importance in the projection，VIP)>1作為差異代謝物的選擇標(biāo)準(zhǔn)，將這些差異代謝物的質(zhì)核比(m/z)與網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)如HMDB(http://hmdb.ca)、METLIN(http://metlin.scripps.edu)等對(duì)比，初步確定差異物的相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)式，然后根據(jù)分子式及質(zhì)譜圖、標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間、質(zhì)核比等確定差異代謝物。采用R(3.4.4 版本)軟件對(duì)代謝物的樣品表達(dá)進(jìn)行聚類分析。采用GraphPad 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異代謝物的單變量比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)白念珠菌組與對(duì)照組的差異代謝物建立受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)，計(jì)算曲線下面積(area under curve，AUC)及95%CI。最后，在KEGG網(wǎng)站(http://www.kegg.jp)對(duì)代謝物進(jìn)行Pathway富集分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠模型

對(duì)沙氏培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，大鼠內(nèi)臟分布的白念珠菌負(fù)荷如表2所示。挑選感染后24 h時(shí)肝臟、脾臟、腎臟及血液中均有白念珠菌菌落且存活的大鼠的白念珠菌密度作為建模所需的白念珠菌密度。

表2 大鼠各器官及血液中白念珠菌負(fù)荷

Approximate CFU ofCandidaper 100 mL of tissue homogenates or blood cultured on SDA plates.

建模結(jié)果如表2所示，第1組大鼠(注射 2.5×1010CFU白念珠菌)于16 h內(nèi)全部死亡，未取血液及器官樣本；第2組大鼠(注射 2.5×109CFU白念珠菌)于24 h內(nèi)死亡3只，存活大鼠的血培養(yǎng)及肝、脾、腎組織勻漿中白念珠菌培養(yǎng)均陽(yáng)性；第3組大鼠(注射 2.5×108CFU白念珠菌)于24 h內(nèi)全部存活，2只血培養(yǎng)陽(yáng)性，大部分器官組織勻漿中白念珠菌培養(yǎng)陽(yáng)性，符合本研究系統(tǒng)性白念珠菌感染的建模要求；第4、5組(注射 2.5×107CFU、2.5×106CFU白念珠菌)大鼠于24 h內(nèi)全部存活，僅1只血培養(yǎng)陽(yáng)性，組織勻漿中均培養(yǎng)出白念珠菌，但陽(yáng)性率較低，發(fā)現(xiàn)白念珠菌血流感染早期易發(fā)生于泌尿系統(tǒng)。第1～4組大鼠感染白念珠菌后24 h出現(xiàn)精神萎靡、飲食不積極、嗜睡、活動(dòng)不積極、尾巴毛濕潤(rùn)等癥狀。

2.2 血漿代謝譜圖

采用OPLS-DA、PLS-DA、PCA模型分別進(jìn)行模式識(shí)別，結(jié)果見圖1。PCA、OPLS-DA及PLS-DA均能區(qū)分兩組。PCA模型的參數(shù)主要參考R2X的值，R2X越接近1，表明模型越穩(wěn)定可靠，一般 R2X>0.5 的模型可靠性較好。對(duì)兩組進(jìn)行PCA分析，R2X為 0.601 時(shí)PCA模型能較好地區(qū)分兩組。R2Y和Q2分別為SIMCA軟件中PLS-DA和OPLS-DA模型的參數(shù)，R2Y表示模型對(duì)Y軸的解釋能力，Q2表示模型的預(yù)測(cè)能力。R2Y和Q2越接近1，表明模型越穩(wěn)定可靠，一般Q2>0.5的模型穩(wěn)定可靠。PLS-DA模型中，R2Y為 0.976，Q2為 0.834，表示PLS-DA模型能解釋兩組 97.6% 的差異，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)樣品組別 83.4%。OPLS-DA模型中，R2Y為 0.976，Q2為 0.886，表示OPLS-DA模型能解釋兩組 97.6% 的差異，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)樣品組別 88.6%。結(jié)果提示，OPLS-DA、PLS-DA、PCA均能很好地鑒別白念珠菌組與對(duì)照組，兩組代謝物的生物差異明顯。

A: PCA. B: PLS-DA. C: OPLS-DA

2.3 對(duì)差異標(biāo)記的篩選

通過(guò)計(jì)算PLS-DA模型中的VIP值來(lái)衡量各代謝物的表達(dá)模式對(duì)各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力。一般以VIP>1作為候選蛋白標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)。本研究選擇同時(shí)具有多維統(tǒng)計(jì)分析篩選標(biāo)準(zhǔn)(VIP>1)和單變量統(tǒng)計(jì)分析篩選標(biāo)準(zhǔn)(P<0.05)的代謝物作為具有顯著性差異的代謝物，VIP>1且 0.05

表3 代謝的差異標(biāo)記

2.4 對(duì)候選標(biāo)記的ROC分析

對(duì)質(zhì)譜采集及篩選的候選生物標(biāo)記在白念珠菌組與對(duì)照組之間的差異進(jìn)行t檢驗(yàn)和ROC分析，進(jìn)一步篩選和評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，這18個(gè)代謝產(chǎn)物在白念珠菌組血漿與對(duì)照組血漿中有明顯差異(P<0.05)(表3)。其中LysoPC(14∶0)、LysoPC(18∶1(9Z))、LysoPC(18∶0)、L-Tryptophan、L-Gulonic acid γ-lactone這5個(gè)代謝物AUC值均>0.90(圖2，表4)。

2.5 聚類分析與通路分析

為更加直觀地顯示代謝物的差異性及代謝物在各組中的表達(dá)差異，對(duì)差異代謝物的表達(dá)進(jìn)行層次聚類(hierarchical clustering)，結(jié)果見圖3。將得到的差異代謝物提交至KEGG網(wǎng)站，獲得33條代謝相關(guān)通路。分析相關(guān)通路，mTOR信號(hào)通路及cAMP信號(hào)通路引起了關(guān)注(圖4)。

表4 候選標(biāo)記的ROC分析

圖2 候選標(biāo)記的ROC分析

3 討論

近年來(lái)，隨著腫瘤發(fā)病率上升、人口老齡化及廣譜抗生素應(yīng)用，深部真菌感染已成為重要的醫(yī)院內(nèi)感染。盡管不斷有新的抗真菌藥物出現(xiàn)，但侵襲性真菌病的病死率仍居高不下，帶來(lái)了沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。白念珠菌感染是ICU常見真菌病，病死率極高[8]，但其確證主要依靠陽(yáng)性率并不高的血培養(yǎng)，因此如何早期診斷和有效控制成為刻不容緩的公共衛(wèi)生話題。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)白念珠菌的研究主要集中在基因組學(xué)和蛋白組學(xué)，代謝組學(xué)研究較少。但代謝物是細(xì)胞調(diào)控過(guò)程的終產(chǎn)物，其種類和數(shù)量變化被視為宿主對(duì)基因或環(huán)境變化刺激的最終響應(yīng)，與生物體的功能活動(dòng)變化有更加直接的聯(lián)系。

本研究采用HILIC UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)依賴性采集方式，對(duì)白念珠菌感染組和對(duì)照組進(jìn)行全譜分析，獲得一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜，尋找兩組的差異代謝物。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行矯正和歸一化處理后，采用SIMCA軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行判別。PCA是一種非監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析方法，將原本鑒定到的所有代謝物重新進(jìn)行線性組合，形成一組新的綜合變量，根據(jù)所分析的問(wèn)題從中選取幾個(gè)綜合變量，使它們盡可能多地反映原有變量的信息，從而達(dá)到降維的目的[9]。與PCA不同，PLS-DA和OPLS-DA為有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法[10]，采用它們建立代謝物表達(dá)量與樣品類別之間的關(guān)系模型，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品類別的預(yù)測(cè)[11]。OPLS-DA是在PLS-DA的基礎(chǔ)上進(jìn)行修正，濾除與分類信息無(wú)關(guān)的噪聲，提高了模型的解析能力和有效性[12]。本研究中這3種模型均能將白念珠菌組與對(duì)照組區(qū)分，表明兩組代謝物存在生物差異。OPLS-DA和PLS-DA通過(guò)R2Y和Q2對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，比PCA通過(guò)單一的R2X對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)有更好的穩(wěn)定性。PCA非監(jiān)督的模型判別可能受實(shí)驗(yàn)誤差、生物個(gè)體差異等因素的干擾。OPLS-DA通過(guò)正交方法濾除無(wú)關(guān)噪聲，可提高模型判別效率。

本研究結(jié)果表明，白念珠菌組與對(duì)照組大鼠血漿代謝組學(xué)存在明顯差異，最終確定18個(gè)代謝產(chǎn)物可能為白念珠菌代謝差異產(chǎn)物，大部分屬短肽類，主要參與代謝、碳循環(huán)、保持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性及維持生理穩(wěn)態(tài)。其中，L-色氨酸、吲哚乳酸及L-亮氨酸已有其他文獻(xiàn)證實(shí)在維護(hù)腸道穩(wěn)態(tài)、防止腸源性念珠菌移位、維持哺乳動(dòng)物腸道免疫平衡中發(fā)揮重要作用[13-14]。白念珠菌可通過(guò)改變宿主的色氨酸代謝來(lái)抑制白細(xì)胞介素17(interleukin 17，IL-17)的產(chǎn)生及調(diào)節(jié)IL-22的產(chǎn)生，從而改變宿主抗真菌的防御能力[13,15-16]。本研究中L-色氨酸的高表達(dá)可能與宿主體液免疫激活有關(guān)。L-亮氨酸是宿主免疫和腎臟疾病中的重要代謝產(chǎn)物，亮氨酸及亮氨酸氨基肽酶在急性肝損傷、腎損傷和慢性腎臟疾病中升高。本研究中亮氨酸升高可能與白念珠菌血癥導(dǎo)致腎臟損傷有關(guān)。既往研究證實(shí)，LysoPC有抗感染和抗炎作用[17-18]，本研究質(zhì)譜結(jié)果也顯示LysoPC增高，可能與宿主抗感染代謝途徑有關(guān)。LysoPC(14∶0)、LysoPC(18∶1(9Z))、LysoPC(18∶0)、L-Tryptophan、L-Gulonic acid γ-lactone這5個(gè)代謝物AUC值均>0.90，高于G實(shí)驗(yàn)用于深部真菌診斷的AUC值 0.83 及真菌血培養(yǎng)的AUC值 0.73[19-20]。本研究是對(duì)白念珠菌感染生物標(biāo)記進(jìn)行的初步探索，所得結(jié)論需更多臨床樣本來(lái)驗(yàn)證和支持。在富集到的33條通路中，mTOR信號(hào)通路及cAMP信號(hào)通路引起注意。mTOR信號(hào)通路通過(guò)整合細(xì)胞外的營(yíng)養(yǎng)、能量及生長(zhǎng)因子等多種信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答，是細(xì)胞自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)。本研究在通路分析中所富集到的mTOR信號(hào)通路可能與宿主通過(guò)抑制mTOR來(lái)調(diào)節(jié)自身免疫應(yīng)答以應(yīng)對(duì)真菌感染有關(guān)。此外，cAMP信號(hào)通路是一條細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典信號(hào)通路，細(xì)胞受外界刺激后可通過(guò)cAMP信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄，這條通路的激活可能與白念珠菌引起的促炎反應(yīng)有關(guān)。

本研究表明，采用UHPLC-Q-TOF-MS研究白念珠菌感染W(wǎng)istar大鼠中血漿代謝物方法可行，PCA、OPLS-DA及PLS-DA均可區(qū)分代謝物的差異表達(dá)。OPLS-DA及PLS-DA通過(guò)有監(jiān)督的方法減少誤差，為尋找白念珠菌早期感染的血漿代謝標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。初步篩選出的18個(gè)差異代謝物，可能是大鼠血漿代謝差異物。本研究也有不足之處：首先，建立模型時(shí)，由于設(shè)備條件有限，未能在更早時(shí)間(12 h內(nèi))建立白念珠菌感染模型而更早診斷和治療白念珠菌感染以降低病死率。其次，用于質(zhì)譜檢測(cè)的樣本量較小，進(jìn)行標(biāo)記評(píng)價(jià)時(shí)可能導(dǎo)致檢驗(yàn)效能降低。最后，本研究為白念珠菌血癥生物標(biāo)記的初步探索，缺乏后續(xù)的標(biāo)記驗(yàn)證。未來(lái)將在白念珠菌感染患者血漿中做進(jìn)一步的靶向驗(yàn)證，為早期診斷和治療提供可靠的臨床依據(jù)。