吳還梅，盧洪洲,2,3

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心感染科， 上海 201508； 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科， 上海 200040； 3. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)系， 上海 200032

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的發(fā)現(xiàn)距今已超過35年，其感染引發(fā)的獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是導(dǎo)致感染者死亡的主要原因。根據(jù)聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署2018年最新報道，截至2017年，全球約有3 690萬HIV感染者，其中2017年新發(fā)感染180萬。總計約有 2 170 萬HIV感染者接受規(guī)范化聯(lián)合抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(combination antiretroviral therapy，cART)。自2000年以來，新發(fā)HIV感染人數(shù)及AIDS相關(guān)死亡人數(shù)逐年下降[1]，這無疑得益于有效的cART，但同時也與生存期延長的HIV慢性感染者所占比例上升有關(guān)，即宿主免疫系統(tǒng)與HIV復(fù)制之間的博弈日趨平衡。眾所周知，目前國內(nèi)常用cART治療方案的用藥劑量相對較大，患者服用后往往伴隨嚴重的藥物毒副反應(yīng)，如肝腎損傷。因此，在探索抗HIV藥物減量及多藥合一方案的同時，研究人員仍致力于揭示宿主自身免疫對抗機制及篩選胞內(nèi)抗病毒因子，以期能通過調(diào)動機體自身免疫應(yīng)答，配合減量的cART治療，從而提高患者生存質(zhì)量，實現(xiàn)HIV感染的功能性治愈。

干擾素(interferon，IFN)是一種具有廣譜抗病毒作用的宿主因子。它作用于相鄰細胞表面的干擾素受體(interferon receptor，IFNR)，激活Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號通路，誘導(dǎo)數(shù)百種干擾素刺激基因(interferon-stimulated gene，ISG)的表達，包括干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor，IRF)、蛋白激酶R(protein kinase RNA-activated，PKR)、γ干擾素誘導(dǎo)蛋白10(interferon γ-inducible protein 10，IP10)、2′，5′寡聚腺苷酸合成酶(2′，5′-oligoadenylate synthetase，OAS)、類泛素蛋白ISG15等，介導(dǎo)了宿主自身抑制HIV復(fù)制的過程。其中，ISG15為IFN刺激后上調(diào)表達最顯著的胞內(nèi)宿主因子之一，與其共同表達的還有ISG15共價結(jié)合靶蛋白所需的連接酶復(fù)合體[2]。一直以來，ISG15的抗病毒作用備受關(guān)注，近期研究更提出ISG15具有免疫調(diào)節(jié)功能。

1 ISG15的生物學(xué)特征及表達情況

isg15編碼的泛素樣蛋白分子ISG15又稱為泛素交叉反應(yīng)蛋白(ubiquitin cross-reactive protein，UCRP)，是第1個被鑒定的類泛素修飾蛋白。成熟的ISG15相對分子質(zhì)量為 15 000，由相對分子質(zhì)量為 17 000 的前體蛋白水解去掉C端的8個氨基酸和N端的蛋氨酸而來。C端和N端為兩個泛素樣結(jié)構(gòu)域，分別與泛素有29%和31%的同源性[3]。與廣泛存在于各種真核生物中的泛素及其他類泛素分子不同，ISG15只在脊椎動物中表達，包括人類、猴和小鼠，且在不同物種間遺傳學(xué)差異較大。

ISG15在胞內(nèi)外以游離蛋白分子形式存在，能誘導(dǎo)天然殺傷(natural killer，NK)細胞和T細胞產(chǎn)生IFN-γ[4]，但機制尚不明確。單核細胞、T細胞、B細胞、樹突細胞(dendritic cell，DC)、NK細胞和粒細胞在未經(jīng)IFN刺激的情況下能表達ISG15[5]，提示ISG15在正常生理條件下發(fā)揮一定的作用，可能抑制自身免疫的發(fā)生和機體的過度活化。上皮細胞來源的細胞系及健康人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)經(jīng)IFN-β刺激24 h后，胞內(nèi)及培養(yǎng)上清液中均能檢測到ISG15蛋白，且胞內(nèi)表達量顯著高于胞外[6]。人肺癌細胞系A(chǔ)549經(jīng)IFN-β刺激后也能顯著上調(diào)ISG15表達[7]。

原代淋巴細胞和單核細胞經(jīng)IFN-α或IFN-β刺激后能上調(diào)ISG15的表達，單核細胞系THP-1在同樣刺激下可將游離的ISG15緩慢分泌到培養(yǎng)基中[8]。在cART療效良好的HIV合并丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染的患者中，漿細胞樣樹突細胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)中也能檢測到上調(diào)表達的ISG15[9]。病毒感染時，ISG15的上調(diào)表達依賴IRF。其中，IRF3為IFN信號通路的關(guān)鍵因子，其編碼的蛋白能結(jié)合到含有干擾素刺激應(yīng)答元件(interferon-stimulated response element，IRSE)的ISG15啟動子區(qū)，上調(diào)ISG15表達[10]。此外，淋巴細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子PU.1能與IRF4或IRF8形成異源復(fù)合體，激活I(lǐng)SG15轉(zhuǎn)錄[11]。

中性粒細胞為血液循環(huán)系統(tǒng)中豐度最高的細胞亞群，是機體抵抗感染的第1道防線。研究人員從約氏瘧原蟲感染的小鼠紅細胞裂解液中分離到ISG15蛋白，并證明其具有顯著的中性粒細胞趨化作用[12]，提示ISG15可能在中性粒細胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)中發(fā)揮一定作用。此外，Poly (I∶C)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或IFN-β刺激中性粒細胞后，ISG15的表達也顯著上調(diào)[13]。研究人員發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞中可觀察到ISG15與明膠酶和分泌顆粒的共定位，提示ISG15在粒細胞中通過分泌途徑表達[5]。由此可見，IFN應(yīng)答通路廣泛存在于各亞群細胞，不管在胞外還是胞質(zhì)中均能檢測到游離的ISG15蛋白，只是表達量有較大差異。

2 ISG15的抗病毒作用

病毒感染能顯著上調(diào)ISG15表達，不同細胞亞群對IFN刺激的響應(yīng)性也存在差異。已有的報道顯示，ISG15具有抗流感病毒、Sindbis病毒、皰疹病毒、HIV和埃博拉病毒的作用[14-16]。研究人員在ISG15基因敲除小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，ISG15缺失導(dǎo)致小鼠對流感病毒A和B亞型、單純皰疹病毒1型[17]及仙臺病毒[15,17-18]的易感性增加，從而證明了ISG15的抗病毒作用。

2.1 ISG15與靶蛋白的共價結(jié)合

分泌到胞外的ISG15能與靶蛋白共價結(jié)合，發(fā)揮類泛素化修飾功能，稱為ISG化(ISGylation)。這些靶蛋白包括IFN誘導(dǎo)的抗病毒因子，如PKR、GTP酶MxA、HuP家族、維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ (retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)等，以及介導(dǎo)RNA剪切、染色體重建、聚合酶轉(zhuǎn)錄、細胞骨架構(gòu)建等功能的蛋白分子[19]。近期有研究顯示，ISG15的E3泛素蛋白連接酶HERC5催化ISG15與IRF3共價結(jié)合，減弱IRF3與其負調(diào)節(jié)因子Pin1的相互作用，從而導(dǎo)致IRF3持續(xù)性激活[20]，表現(xiàn)為機體持續(xù)的IFN抗病毒反應(yīng)。

ISG化過程為可逆共價結(jié)合，去ISG化由泛素特異性肽酶18(ubiquitin specific peptidase 18，USP18)介導(dǎo)。USP18為ISG15的去共價結(jié)合蛋白酶，由usp18基因編碼，又稱為UBP43。缺失UBP43的小鼠對IFN-β刺激異常敏感，能誘導(dǎo)持續(xù)的STAT1酪氨酸磷酸化，激活I(lǐng)FN信號通路[3]。表明ISG化通過JAK/STAT信號通路激活I(lǐng)FN應(yīng)答，且UBP43為ISG化的負調(diào)節(jié)因子。usp18基因敲除小鼠能抵抗淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒的感染，抑制該病毒的復(fù)制，且機體表現(xiàn)出更高水平的ISG化[21]。不僅表明UBP43為降解ISG15類泛素化的蛋白酶，還再次證明ISG15介導(dǎo)的ISG化過程具有抗病毒作用。

2.2 ISG15的抗HIV作用及機制

研究顯示，胞外分泌的ISG15可能作為一種細胞因子或趨化因子發(fā)揮作用，從而調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，這在HIV感染過程中表現(xiàn)得尤為復(fù)雜。Ⅰ型IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生的ISG15能誘導(dǎo)LPS活化的CD3+T細胞分泌IFN-γ，并伴隨著吲哚胺2,3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)活性增強[22]，從而增強細胞毒性，表現(xiàn)出抗病毒效應(yīng)。同樣，在B細胞刪除的原代培養(yǎng)條件下，ISG15能刺激CD3+T細胞產(chǎn)生IFN-γ，作用于NK細胞，促進NK細胞增殖及對HIV的殺傷能力[23]。研究人員通過體外T細胞和單核細胞系的HIV感染模型發(fā)現(xiàn)，HIV Tat蛋白存在時，轉(zhuǎn)導(dǎo)ISG15能顯著上調(diào)IFN信號通路活化，抑制HIV復(fù)制[24]。IFN-ω能顯著上調(diào)ISG15表達，并特異性抑制HIV復(fù)制[25]。小腸上皮細胞Toll 樣受體3(Toll-like receptor 3，TLR-3)信號通路活化后，誘導(dǎo)上皮細胞表達IRF3和IRF7并分泌趨化因子，釋放包含ISG15蛋白的外體，抑制HIV在巨噬細胞中的復(fù)制[26]。雖然ISG15對HIV的抑制作用明顯，但機制不清楚，可能是由于胞內(nèi)因子之間的相互作用。

HIV的出芽釋放依賴蛋白運輸所需的內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體(endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT)，其中ESCRT-Ⅰ蛋白Tsg101的UEV結(jié)構(gòu)域與HIV Gag蛋白的PTAP基序結(jié)合，介導(dǎo)HIV的出芽。ISG15則阻斷兩者相互作用，在一定程度上抑制了成熟HIV的出芽和釋放[16,27]，且這種抑制作用呈ISG15表達量依賴性[16]。這是目前唯一報道的ISG15直接抑制HIV復(fù)制的機制。近期有報道顯示，ISG化的E3連接酶HERC5能通過與HIV Gag蛋白相互作用，在不影響Gag蛋白從胞內(nèi)到胞膜運輸途徑的情況下抑制多輪HIV復(fù)制[28]。提示在胞內(nèi)ISG化抑制HIV成熟過程中，介導(dǎo)蛋白相互作用的分子可能不止一種。

2.3 HIV感染者隊列中ISG15的抗病毒作用

從轉(zhuǎn)錄水平來看，HIV感染者未經(jīng)抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(antiretroviral therapy，ART)時ISG15的上調(diào)表達最明顯，經(jīng)長期cART治療后，ISG15的表達量下調(diào)。在高病毒載量和低CD4 T細胞計數(shù)的患者中，ISG15表達量較高[29]。表明HIV感染者中ISG15表達與病毒載量呈正相關(guān)，與CD4 T細胞計數(shù)呈負相關(guān)，即感染者中ISG15轉(zhuǎn)錄水平與疾病進展一致。HIV感染者中，IP-10表達上調(diào)，導(dǎo)致患者免疫功能紊亂進而引發(fā)疾病進展。miR-21能抑制LPS活化的單核細胞上調(diào)表達IP-10，而HIV感染者體內(nèi)的miR-21表達顯著低于健康人群，因此miR-21對IP-10的調(diào)節(jié)作用能有效延緩疾病進展。而在單核細胞分化為巨噬細胞的過程中，ISG15的表達顯著上調(diào)，伴隨miR-21對IP-10表達的調(diào)控作用減弱[30]。因此，ISG15可能是miR-21控制AIDS疾病進展過程中的關(guān)鍵角色。

健康細胞在免疫激活的情況下，ISG15的上調(diào)表達十分顯著[31]，顯示其對IFN的應(yīng)答正常且迅速。但在HIV感染無癥狀期，ISG15的表達下調(diào)，且對IFN-α的應(yīng)答能力減弱[32]，表明HIV感染造成了ISG15介導(dǎo)的IFN應(yīng)答通路損傷。巨噬細胞為HIV的主要潛伏庫之一，HIV的功能性蛋白Vpr能在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平誘導(dǎo)巨噬細胞中ISG15表達上調(diào)[33]。因此，ISG15的上調(diào)表達同步于HIV的擴增，為HIV感染后抗病毒效應(yīng)的表現(xiàn)。研究者對HIV感染者的臨床信息進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)HIV慢性感染者PBMC和T細胞中的ISG15表達均上調(diào)，且CD4 T細胞中ISG15作為IFN抗病毒信號通路中的關(guān)鍵分子，在抗HIV免疫應(yīng)答中起主要作用[34]。由此可見，ISG15在HIV感染者中的功能遠比體外實驗復(fù)雜，包括對炎癥因子、IFN應(yīng)答通路分子及非功能性小RNA等的調(diào)控。

3 HIV逃逸ISG15的抗病毒作用

慢病毒的功能輔助蛋白能特異性靶向宿主胞內(nèi)限制因子，抑制其發(fā)揮抗病毒作用，從而增強病毒自身的復(fù)制能力。流感病毒NS1蛋白通過抑制UBE1L的催化反應(yīng)來抑制ISG15與靶蛋白的共價結(jié)合[35]；嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)病毒能編碼ISG15去結(jié)合酶[36]；牛痘病毒E3蛋白通過與ISG15結(jié)合而競爭性阻斷其抗病毒作用[37]；HCV通過誘導(dǎo)ISG15對RIG-Ⅰ泛素化來抑制IFN產(chǎn)生[38]，從而逃逸IFN的抗病毒作用。

研究顯示，HIV感染能下調(diào)未經(jīng)活化的原代巨噬細胞中IFN刺激后ISG15的表達[39]。巨噬細胞對IFN免疫應(yīng)答能力減弱，提示HIV可能通過某種途徑逃逸宿主免疫。P21為介導(dǎo)單核細胞分化成熟的細胞周期素依賴性激酶抑制劑，能抑制巨噬細胞和DC中HIV的復(fù)制。最新研究顯示，巨噬細胞中ISG15特異性水解酶USP18通過下調(diào)p21的表達，間接輔助HIV逃逸宿主免疫，增強其復(fù)制能力[40]。如前所述，IRF3能與ISRE特異性結(jié)合，誘導(dǎo)ISG15表達[10]，通過IFN信號通路發(fā)揮抗病毒作用。同時，ISG15抑制IRF3降解[41]，持續(xù)激活I(lǐng)FN的抗病毒免疫應(yīng)答。而HIV的Vpr蛋白和Vif蛋白能通過泛素化誘導(dǎo)IRF3降解，負向調(diào)節(jié)機體的抗病毒反應(yīng)[42]。ISG化能抑制HIV的出芽和釋放[27]。研究人員通過芯片矩陣分析發(fā)現(xiàn)，HIV的Vpu蛋白能靶向降解ISG15共價結(jié)合的E2連接酶UBE2L6，從而降低細胞整體ISG化水平，逃避宿主的免疫抑制作用[43]。

IFN-α的抗病毒作用在HIV感染者中并沒有得到很好的發(fā)揮，提示IFN-α信號通路很可能是HIV的靶標(biāo)，HIV通過干擾IFN-α發(fā)揮抗病毒作用來逃避宿主免疫。HIV感染誘導(dǎo)ISG15的上調(diào)表達由STAT1/STAT3介導(dǎo)[44]。而HIV的Vif蛋白則通過降解JAK/STAT信號通路中的分子來抑制IFN-α的抗病毒作用，表現(xiàn)為ISG15的表達水平下降。Vif正是通過與STAT1和STAT3直接結(jié)合，借助泛素化途徑降解后者[45]，從而阻斷宿主的抗病毒反應(yīng)。由此可見，HIV的非結(jié)構(gòu)蛋白通過靶向宿主ISG化過程和拮抗IFN信號通路中的關(guān)鍵分子，阻斷ISG15對病毒復(fù)制的抑制，從而逃避宿主免疫。

4 結(jié)語

到目前為止，ISG15的抗病毒作用僅在人源細胞離體實驗及小鼠模型中得到驗證。由于缺乏HIV感染小鼠模型，而恒河猴感染模型操作復(fù)雜、周期較長， 導(dǎo)致ISG15抗HIV的功能目前只在體外細胞系模型中得到驗證。HIV感染者中，ISG15更有可能參與免疫功能調(diào)節(jié)，輔助宿主發(fā)揮抗病毒作用。胞外的ISG15誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，介導(dǎo)機體的抗感染免疫；胞內(nèi)的ISG15則誘導(dǎo)IFN信號通路活化，介導(dǎo)下游細胞因子分泌。ISG化在人體內(nèi)可能并非抗病毒免疫調(diào)節(jié)中的唯一通路，因此研究人員發(fā)現(xiàn)ISG15缺失患者并未表現(xiàn)出對病毒易感性的增加，且IFN刺激也能誘導(dǎo)其他ISG表達，機體表現(xiàn)出更強的抗感染能力[46]。ISG15通過Ⅰ型IFN參與的免疫調(diào)節(jié)十分復(fù)雜，涉及宿主自身對病毒的限制作用及HIV逃逸宿主免疫。

ISG化及ISG15在HIV感染中的具體作用及機制尚未完全解析，其在宏觀水平對HIV復(fù)制的抑制作用表現(xiàn)出不同感染人群的差異性，在微觀水平的免疫調(diào)節(jié)信號通路更是錯綜復(fù)雜。因此，有必要進一步探索ISG15在HIV急性感染者、慢性感染者、長期不進展者和精英控制者中的作用和角色。此外，鑒于ISG15缺陷患者并未表現(xiàn)出病毒易感性增加，且ISG15的抗病毒作用均在小鼠模型中得到驗證，表明ISG15的種屬差異對其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用有至關(guān)重要的影響。因此，ISG15在HIV感染者中的作用可能不僅是抑制病毒復(fù)制，還有可能與其他IFN信號通路協(xié)同作用，參與不同細胞亞群的免疫調(diào)節(jié)。在明確ISG15對HIV感染不同時期的作用及可發(fā)揮作用的細胞群的前提下，探討其抗病毒效應(yīng)的臨床應(yīng)用前景，對尋求配合cART治療的HIV功能性治愈策略具有重要意義。