(福建工程學(xué)院 材料科學(xué)與工程學(xué)院, 福建 福州 350118)

目前甾體皂苷類化合物的應(yīng)用及研究領(lǐng)域主要集中在中樞神經(jīng)損傷的治療方面，甾體皂苷類化合物應(yīng)用于骨缺損治療領(lǐng)域的研究報(bào)告還很少見。江洋珍等[1]研究了薯蕷皂苷元(麥冬甾體皂苷的主要水解產(chǎn)物，分子式：C27H42O3，相對(duì)分子質(zhì)量：414.63Da)對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)液中添加質(zhì)量濃度(0.015～0.150 μg/mL)的薯蕷皂苷元后，成骨細(xì)胞增殖、分泌堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的水平明顯提高。

與此同時(shí)，構(gòu)建具有時(shí)空控制釋放特點(diǎn)的載藥微球已成為一個(gè)新的研究方向[2-3]。連續(xù)梯度的化學(xué)信號(hào)能引起濃度依賴性的細(xì)胞特異類型反應(yīng)，從而引起不同的生物學(xué)作用[4]。這種微球?qū)τ诠侨睋p的修復(fù)具有較好的藥物緩釋作用。微球可直接植入骨缺損部位以刺激骨細(xì)胞的增殖。此外，這種尺寸可控的載藥微球也可以注射的方式修復(fù)損傷組織，從而避免手術(shù)創(chuàng)傷。因此，這種治療方式可有效提高骨細(xì)胞的生物活性并刺激骨再生。

基于此，本實(shí)驗(yàn)嘗試以麥冬甾體皂苷為模型藥物，以明膠為載體構(gòu)建緩釋系統(tǒng)并研究其對(duì)小鼠成骨細(xì)胞的生物效應(yīng)。

1 材料與方法

本實(shí)驗(yàn)以從麥冬提取物中分離得到的甾體皂苷類化合物(相對(duì)分子質(zhì)量介于771-962Da)作為模型藥物，應(yīng)用新型乳化-化學(xué)交聯(lián)技術(shù)，制備載藥明膠微球。微球在制備過程中, 麥冬-明膠溶液與油相形成W/O型乳劑, 再經(jīng)EDC/NHS固化交聯(lián)處理形成微球。

具體過程如下：

(1)配制藥物-明膠溶液。將0.3 g麥冬皂苷溶于100 mL水中, 超聲處理,配制成飽和溶液后, 稱取明膠溶液，配制成適宜濃度的麥冬皂苷-明膠溶液。

(2)乳化。在三口瓶中加入250 mL液體石蠟，然后加入3.1 mLSpan80，攪拌使液體石蠟與Span80 混勻。并在攪拌下緩慢滴加含藥明膠溶液，控制一定的攪拌速度，適時(shí)取樣，用顯微鏡進(jìn)行觀察。水相與油相體積比控制為1∶5，石蠟與Span80的體積比控制為80∶1。并調(diào)控乳化時(shí)間為40 min。

(3)交聯(lián)階段和后處理。當(dāng)液滴完全分散均勻形成W/O型乳劑后，立即轉(zhuǎn)移至冰水浴中；待乳劑溫度降至5 ℃左右時(shí)，加入2.5 mg/mL的EDC交聯(lián)固化40 min，隨后加入異丙醇約50 mL，繼續(xù)攪拌至有大量固體顆粒析出(約15 min)，抽濾，用異丙醇洗滌3次，用石油醚洗滌3次，直至抽干，放在表面皿上，拿到真空干燥箱里真空干燥12 h，即可得粉末狀麥冬-明膠微球。

2 載藥明膠微球的性能檢測(cè)

2.1 載藥明膠微球的微觀結(jié)構(gòu)觀察及粒徑分析

利用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察載藥明膠微球的表面形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)，并在光學(xué)顯微鏡下測(cè)量100個(gè)微球粒徑，繪制粒徑分布圖。

2.2 載藥明膠微球的藥物釋放動(dòng)力學(xué)和質(zhì)量變化分析

采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)載藥微球在PBS中的釋放動(dòng)力學(xué)，繪制體外藥物釋放曲線；并稱量釋藥前后微球的質(zhì)量變化，繪制降解曲線。

2.3 載藥明膠微球?qū)?xì)胞的生物效應(yīng)檢測(cè)

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)成骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞足夠多時(shí)，加入0.25%的胰酶消化成骨細(xì)胞，1～2 min后棄除胰酶，加入培養(yǎng)液中止消化，沖下貼壁的成骨細(xì)胞，吹打均勻制成細(xì)胞懸液，于紅細(xì)胞記數(shù)板上記數(shù)。根據(jù)細(xì)胞記數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞懸液密度稀釋成1×104個(gè)/mL和 2×104個(gè)/mL兩種，備用。之后，將20 mg經(jīng)γ射線消毒后的微球置于培養(yǎng)板中，用培養(yǎng)液浸泡24～48 h。之后，除去培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，加入配制好的細(xì)胞懸液，隔天換新的培養(yǎng)液。細(xì)胞與微球組裝一定時(shí)間后，采用四唑鹽(MTT法)比色法檢測(cè)細(xì)胞生長的情況，采用鐵氰化鉀法檢測(cè)細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，并采用相差顯微鏡觀察細(xì)胞的礦化特征，評(píng)價(jià)明膠微球釋放的甾體皂苷藥物對(duì)成骨細(xì)胞的生理活性。

3 載藥明膠微球的性能特征

3.1 載藥明膠微球的微觀形貌及粒徑分析

圖1為包裹了麥冬甾體皂苷藥物和未載藥明膠微球的掃描電鏡形貌圖。從圖1可以看出未載藥的微球表面更光滑，而包裹了藥物的微球表面較粗糙。微球粒徑在1 μm到9 μm之間，粒徑分布如圖2所示，平均粒徑為(7.5±0.8)μm。

圖1 明膠微球的掃描電鏡形貌圖Fig.1 Scanning electron micrographs of the gelatin microspheres

圖2 明膠微球的粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of gelatin microspheres

采用的雙乳化技術(shù)可以通過控制表面活性劑濃度和混合轉(zhuǎn)速來控制明膠微球的粒徑。但是，這種技術(shù)也存在局限性。在乳化過程中，有機(jī)介質(zhì)對(duì)明膠的流體力學(xué)作用會(huì)破壞明膠的螺旋結(jié)構(gòu)，并降低其力學(xué)強(qiáng)度，從而導(dǎo)致藥物從明膠基質(zhì)中快速擴(kuò)散出來。為了改善這種缺陷，本實(shí)驗(yàn)對(duì)明膠微球進(jìn)行了交聯(lián)處理。此外，通過交聯(lián)，也可以對(duì)明膠構(gòu)建最佳密度的纖維網(wǎng)絡(luò)，這對(duì)于藥物的緩釋進(jìn)而促進(jìn)骨傳導(dǎo)具有極其重要的作用。

3.2 載藥明膠微球的藥物緩釋特征

圖3為載藥微球溶液經(jīng)高速離心后，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度測(cè)定所得曲線。藥物在波長274 nm處的吸收峰為麥冬甾體皂苷的特征吸收峰，表明微球載藥成功。

圖3 藥物明膠微球的吸光度曲線Fig.3 Absorbance curve of the gelatin microspheres

本實(shí)驗(yàn)研究了載藥明膠微球在PBS溶液中的藥物緩釋特征。圖4為明膠微球的藥物釋放特征和降解速率曲線。從圖4(a)可以看出，在起初的6 d，藥物具有較快的釋放速率。隨后，釋放速率減慢并保持在相對(duì)平穩(wěn)狀態(tài)。藥物在0～3、4～6、7～9、10～12 d的釋放量分別是5.15、1.93、1.07、0.73 μg/mL。

圖4 明膠微球在PBS溶液中的藥物釋放曲線和降解曲線Fig.4 Drug release curve and degradation curve of gelatin microspheres in PBS solution

另外，從圖4也可以看出，明膠微球在PBS中的降解曲線與藥物釋放曲線的變化趨勢(shì)非常類似。表明在微球降解過程中，藥物釋放速率與明膠降解速率相一致。而且微球的藥物突釋現(xiàn)象并不太明顯，具有較好的釋放特征。事實(shí)上，甾體皂苷從微球中釋放既包含擴(kuò)散機(jī)制，也有生物侵蝕的原因。明膠微球的釋放曲線主要取決于明膠的降解，而甾體皂苷的持續(xù)釋放可以被解釋為明膠的降解。明膠在PBS中可以快速降解，但是本實(shí)驗(yàn)的交聯(lián)處理減緩了明膠的降解速率，并延長了藥物的釋放時(shí)間。

3.3 載藥明膠微球?qū)Τ晒羌?xì)胞生理功能的調(diào)控作用

3.3.1 載藥明膠微球?qū)Τ晒羌?xì)胞增殖率的調(diào)控作用

圖5顯示了成骨細(xì)胞MC3T3-E1分別與純明膠微球、載藥明膠微球復(fù)合培養(yǎng)時(shí)的增殖率。從圖5可以看出，當(dāng)與載藥明膠微球復(fù)合培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞增殖數(shù)量更多(P<0.05)。這表明藥物在成骨過程中具有重要作用，可很好地促進(jìn)成骨細(xì)胞繁殖。

3.3.2 載藥明膠微球?qū)Τ晒羌?xì)胞分泌ALP的調(diào)控作用

細(xì)胞與兩種微球復(fù)合培養(yǎng)7 d后分泌的ALP水平如圖6所示。在本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分別以兩種初始濃度(1×104個(gè)/mL和2×104個(gè)/mL)種殖在20 mg的微球上。從圖6可以看出，在兩種濃度情況下，細(xì)胞與載藥微球復(fù)合培養(yǎng)時(shí)分泌的ALP水平更高。而且，細(xì)胞初始濃度越高，ALP增加的越多。這表明藥物能很好的激發(fā)細(xì)胞分泌成骨因子。

圖6 細(xì)胞分別與純明膠微球、載藥明膠微球復(fù)合培養(yǎng)7 d后分泌的ALP水平Fig.6 Level of ALP of secreted by cells after 7 days of co-culturing with pure gelatin microspheres and drugs-loaded gelatin microsphe resrespectively

明膠微球釋放的甾體皂苷藥物及微球材料均對(duì)細(xì)胞的粘附、增殖及分泌具有重要作用。因此，這種復(fù)合微球可構(gòu)建具有生理活性肽片段的親水表面，并以此作為細(xì)胞表面受體的配體。

3.3.3 載藥明膠微球?qū)Τ晒羌?xì)胞礦化的調(diào)控作用

采用相差顯微鏡觀察細(xì)胞的礦化，進(jìn)一步評(píng)價(jià)明膠微球釋放的甾體皂苷藥物的生理活性。從圖7(a)可以看出，細(xì)胞與載藥明膠微球復(fù)合培養(yǎng)10 d后有尖棱狀礦化晶體形成。

圖7 細(xì)胞分別與載藥明膠微球和純明膠微球復(fù)合培養(yǎng)10 d后的礦化形貌圖(×200)Fig.7 Mineralization topography (×200) of cells co-cultured with drug-loaded gelatin microspheres and pure gelatin microspheres for 10 days respectively

作為對(duì)照同時(shí)研究了未載藥的明膠微球?qū)?xì)胞礦化的影響。從圖7(b)可以看出，這些微球與細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)后，細(xì)胞未礦化形成晶體。由此也可以證實(shí)甾體皂苷藥物對(duì)細(xì)胞礦化的生理活性。

究其原因，可推測(cè)為甾體皂苷藥物對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)的護(hù)骨素(osteoprotegerin, OPG)和核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)mRNA表達(dá)具有影響?？赏ㄟ^顯著上調(diào)成骨細(xì)胞內(nèi)OPG/RANKL比值來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的生理活性。因此，這種具有骨誘導(dǎo)功能的載藥微球可被注射或移植到骨缺損處以刺激成骨細(xì)胞向骨組織分化，有效促進(jìn)新骨形成。

4 結(jié)論

1)選用麥冬的有效提取物甾體皂苷類化合物為模型藥物構(gòu)建的載藥明膠微球可有效緩解藥物突釋現(xiàn)象并延長藥物釋放時(shí)間。

2)該載藥微球?qū)Τ晒羌?xì)胞生物學(xué)功能有干預(yù)作用，載藥微球釋放的藥物可有效提高成骨細(xì)胞的增殖率和分化水平，促其礦化形成晶體。

3)未來需進(jìn)一步研究該載藥微球，揭示其在骨缺損修復(fù)中的生物效應(yīng)和成骨機(jī)制。