茅燕萍,王億平,陳成,張磊,魏玲,任克軍,金華,王東,章雪蓮

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科，安徽合肥 230031）

慢性腎小球腎炎（chronic glomerulonephritis，CGN）簡(jiǎn)稱慢性腎炎，為免疫介導(dǎo)的腎臟損傷，已成為我國(guó)導(dǎo)致終末期腎病的首要病因[1]。糖皮質(zhì)激素及細(xì)胞毒類藥物等免疫抑制劑控制CGN蛋白尿的療效顯著，但其毒副作用較大，并存在全身免疫抑制而導(dǎo)致機(jī)會(huì)性感染的風(fēng)險(xiǎn)增加。中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)免疫功能、減少免疫抑制劑所帶來的代謝紊亂和抵抗力下降等方面有獨(dú)特的作用。本課題組的前期研究結(jié)果認(rèn)為，CGN的基本病機(jī)是脾腎虧虛、精微下注。參地顆粒由清朝新安醫(yī)學(xué)名家程林所著《圣濟(jì)總錄纂要·卷十三·虛勞門》中的人參湯化裁而成，功效為健脾益腎、固攝精微[2]。前期大量臨床研究[3-11]表明，參地顆?？梢悦黠@改善脾腎虧虛型CGN患者的臨床癥狀，降低證候積分，減少24 h尿蛋白定量及尿紅細(xì)胞量。隨著免疫學(xué)的快速發(fā)展，自身免疫性疾病的病變機(jī)制研究及治療有長(zhǎng)足的進(jìn)步，免疫反應(yīng)參與CGN病程已經(jīng)得到廣泛的證實(shí)和高度的重視。在參地顆粒的臨床研究中也發(fā)現(xiàn)其對(duì)于患者免疫功能的調(diào)節(jié)作用[3，4]，尤其是對(duì)于T細(xì)胞活化及外周單個(gè)核細(xì)胞B7-1（CD80）水平的異常表達(dá)；在參地顆粒對(duì)于系膜增生性腎小球腎炎大鼠干預(yù)研究中也展現(xiàn)出了一定的調(diào)節(jié)能力[12]。B7-1作為重要的共刺激分子在抗原提呈細(xì)胞（anti-gen presenting cells，APC）表面表達(dá)，其與T細(xì)胞表面CD28分子相互結(jié)合可介導(dǎo)T細(xì)胞的增殖與分化，從而引起細(xì)胞與體液免疫。B7-1分子的配體為 T細(xì)胞表面的CD28∕CTLA-4。其中CD28作為正性信號(hào)可促進(jìn)T細(xì)胞活化，外周細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（CTLA-4）則是T細(xì)胞活化的下調(diào)因子[13]。大多數(shù)研究表明，觸發(fā)CTLA-4可以下調(diào)整個(gè)T細(xì)胞群的增殖以及抑制細(xì)胞因子的合成。此外，CTLA-4∕B7-1與Th細(xì)胞密切相關(guān)，B7-1能促進(jìn)Th細(xì)胞分化，產(chǎn)生白細(xì)胞介素2（IL-2）、干擾素γ（IFN-γ），造成Th1∕Th2細(xì)胞紊亂，調(diào)節(jié)腎臟病的進(jìn)展。因此，擬通過開展本研究以進(jìn)一步明確參地顆粒對(duì)于CTLA-4∕B7-1介導(dǎo)的免疫炎癥紊亂的調(diào)節(jié)機(jī)制，也為其臨床應(yīng)用提供必要的依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及分組 本研究病例均為2015年1月至2017年1月安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科收治的符合納入標(biāo)準(zhǔn)的脾腎虧虛型CGN患者，共60例。按就診的先后順序依隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組，每組各30例。另從本院體檢中心選擇20例同期健康體檢者作為正常組。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理要求并獲醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) CGN診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《內(nèi)科學(xué)》[14]診斷標(biāo)準(zhǔn)。慢性腎臟病分期標(biāo)準(zhǔn)參照2012年國(guó)際腎臟病組織“改善全球腎臟病預(yù)后”（Kidney Disease；Improving Global Outcomes，KDIGO）分期標(biāo)準(zhǔn)[15]。中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[16]制定的脾腎虧虛證標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合上述西醫(yī)學(xué)CGN診斷標(biāo)準(zhǔn)、慢性腎臟病分期標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)脾腎虧虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)；②為慢性腎臟病Ⅰ、Ⅱ期患者（腎小球?yàn)V過率 ＞ 60 mL∕min）；③24 h尿蛋白定量（24hUPr）＜3 g者；④年齡為18～70歲；⑤自愿參加本研究并簽署知情同意書的患者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并有心腦血管疾病或嚴(yán)重傳染病患者；②正在服用激素、細(xì)胞毒藥物者；③妊娠期或哺乳期婦女；④生活不能自理或患精神疾病，不能按規(guī)定服藥者。

1.5 治療方法

1.5.1 西醫(yī)常規(guī)處理 2組患者均給予西醫(yī)常規(guī)處理，包括：①低鹽低脂飲食；②改善腎臟微循環(huán)；③對(duì)于高血壓患者應(yīng)控制血壓低于140∕90 mmHg，降壓藥物的選擇依次為鈣通道阻滯劑、β受體阻滯劑、中樞性降壓藥等。

1.5.2 治療組 在西醫(yī)常規(guī)處理的基礎(chǔ)上，給予參地顆粒治療。用法：參地顆粒（藥物組成：紅參、茯苓、雞內(nèi)金、川芎、熟地黃、五味子、桑螵蛸；由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中草藥加工中心生產(chǎn)，規(guī)格：10 g×3包，每包含生藥34 g；批準(zhǔn)文號(hào)：皖藥制字BZ20080025；生產(chǎn)批號(hào)：20140418），每日3次，每次1袋。

1.5.3 對(duì)照組 給予纈沙坦膠囊治療。用法：纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：80 mg×7粒；批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20040217），口服，每日1次，每次80 mg。

1.5.4 療程 2組療程均為12周。

1.6 觀察指標(biāo)及療效評(píng)價(jià)

1.6.1 臨床療效評(píng)價(jià) 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[16]制定。其中癥狀量化評(píng)分，按照癥狀的無、輕、中、重分別計(jì)0、2、4、6分。臨床疾病療效分臨床控制、顯效、有效和無效4級(jí)；中醫(yī)證候療效分臨床痊愈、顯效、有效和無效4級(jí)。

1.6.2 24 h尿蛋白定量（24hUPr） 采用常規(guī)生化法檢測(cè)24hUPr，尿液標(biāo)本分別于治療前和治療后每隔4周收集1次，共4次。

1.6.3 血清IL-2、IL-6、IFN-γ、B7-1水平及尿B7-1水平檢測(cè) 運(yùn)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)患者血清IL-2、IL-6、IFN-γ、B7-1水平及尿B7-1水平。所有實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。試劑盒均由上海源葉生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)批號(hào)分別為20161102A、20161122A、20161220A、20160122A、20160122A。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，計(jì)數(shù)資料采用率或構(gòu)成比表示。若資料符合正態(tài)分布且方差齊，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，若資料不符合正態(tài)分布或方差不齊則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用方差分析；單向有序定性資料采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者脫落剔除情況 治療組有2例患者因在治療期間加用潑尼松，與本次試驗(yàn)病例選擇標(biāo)準(zhǔn)不符而剔除；對(duì)照組有1例在治療期間加服雷公藤多甙片，2例未按規(guī)定服用纈沙坦而剔除，共剔除3例。最終實(shí)際完成試驗(yàn)的治療組為28例，對(duì)照組為27例。

2.2 2組患者及正常組的基線資料比較 治療組28例患者中，男16例，女12例；平均年齡（38.12±12.58）歲；平均病程為（3.55±1.32）個(gè)月；就診時(shí)血壓高于140∕90 mmHg者15例。對(duì)照組27例患者中，男13例，女14例；平均年齡（39.34±12.03）歲；平均病程為（3.26±1.38）個(gè)月；就診時(shí)血壓高于140∕90 mmHg者13例。2組患者的性別、年齡、病程及血壓情況等基線資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。正常組20例健康體檢者中，男10例，女10例；平均年齡（42.45±10.18）歲。3組受試者的性別、年齡等基線資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），也具有可比性。

2.3 2組患者治療前后中醫(yī)證候積分比較 表1結(jié)果顯示：治療前，2組患者的中醫(yī)證候積分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，2組患者的中醫(yī)證候積分均較治療前下降（P＜0.05），且治療組的降低作用明顯優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 2組患者治療前后中醫(yī)證候積分比較Table 1 Comparison of TCM symptom scores in the two groups before and after treatment （，s∕分）

表1 2組患者治療前后中醫(yī)證候積分比較Table 1 Comparison of TCM symptom scores in the two groups before and after treatment （，s∕分）

①P＜0.05，與治療前比較；②P＜0.05，與對(duì)照組治療后比較

治療后30.59±3.39①19.68± 2.33①②組別對(duì)照組治療組N 28 27治療前40.37±4.15 40.50±3.28

2.4 2組患者中醫(yī)證候療效及臨床疾病療效比較 表2～表3結(jié)果顯示：治療組和對(duì)照組的中醫(yī)證候療效總有效率分別為92.86%、55.56%，臨床疾病療效總有效率分別為89.29%、62.96%；組間比較，治療組的中醫(yī)證候療效和臨床疾病療效均優(yōu)于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 2組患者治療前后24hUPr含量比較 表4結(jié)果顯示：治療前，2組患者的24hUPr含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后各個(gè)時(shí)點(diǎn)，對(duì)照組的24hUPr含量與治療前比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；治療組在治療8周、12周后的24hUPr含量均較治療前明顯降低（P＜0.05），且其降低作用明顯優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

表2 2組患者中醫(yī)證候療效比較Table 2 Comparison of effect on TCM symptoms in the two groups n（p∕%）

表3 2組患者臨床疾病療效比較Table 3 Comparison of clinical efficacy on CGN in the two groups n（p∕%）

表4 2組患者治療前后24hUPr含量比較Table 4 Comparison of 24hUPr in the two groups before and after treatment （，m∕g）

表4 2組患者治療前后24hUPr含量比較Table 4 Comparison of 24hUPr in the two groups before and after treatment （，m∕g）

治療12周后0.99±0.12 0.54± 0.12①②組別對(duì)照組治療組N 27 28治療前1.76±0.56 1.76±0.66治療4周后1.64±0.45 1.63±0.52治療8周后1.29±0.75 0.98± 0.79①②

2.6 2組患者治療前后血清IL-2、IL-6、IFN-γ水平比較 表5結(jié)果顯示：治療前，2組患者血清IL-2、IL-6、IFN-γ水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），2組患者血清IL-2水平均較正常組下降，血清IL-6、IFN-γ水平均較正常組升高（P＜0.05）。治療后，2組患者血清IL-2水平均較治療前升高（P＜0.05），血清IL-6、IFN-γ水平均較治療前下降（P＜0.05）；組間比較，2組患者對(duì)血清IL-2表達(dá)水平的升高作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；而對(duì)血清IL-6、IFN-γ表達(dá)水平的降低作用治療組優(yōu)于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.7 2組患者治療前后血清和尿液B7-1表達(dá)水平比較 表6結(jié)果顯示：治療前，2組患者血清和尿B7-1表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），均較正常組水平明顯升高（P＜0.05）。治療后，2組患者血清和尿B7-1表達(dá)水平均較治療前下降（P＜0.05），但治療后2組患者的表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 2組患者治療前后血清IL-2、IL-6、IFN-γ水平比較Table 5 Comparison of serum IL-2，IL-6，and IFN-γ levels in the two groups before and after treatment（）

表5 2組患者治療前后血清IL-2、IL-6、IFN-γ水平比較Table 5 Comparison of serum IL-2，IL-6，and IFN-γ levels in the two groups before and after treatment（）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與治療前比較；③P＜0.05，與對(duì)照組治療后比較

組別正常組對(duì)照組治療組治療后—19.81±2.13②13.87± 2.54②③N 20 27 28 IL-2[ρ∕（ng·mL-1）]治療前5.88±0.62 2.32±0.22①2.16±0.21①治療后—3.23±0.10②4.66±0.31②IL-6[ρ∕（pg·mL-1）]治療前101.85±40.25 196.32±36.89①200.54±37.98①治療后—162.41±39.56②122.65± 36.29②③IFN-γ[ρ∕（pg·mL-1）]治療前12.54±1.85 24.56±3.51①25.89±2.98①

表6 2組患者治療前后血清和尿液B7-1表達(dá)水平比較Table 6 Comparison of serum and urine B7-1 levels in the two groups before and after treatment （）

表6 2組患者治療前后血清和尿液B7-1表達(dá)水平比較Table 6 Comparison of serum and urine B7-1 levels in the two groups before and after treatment （）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與治療前比較

組別N正常組對(duì)照組治療組治療后—15.38±5.41②14.11±5.03②20 27 28血清B7-1[ρ∕（ng·mL-1）]治療前4.34±0.35 20.41±7.35①21.13±6.96①治療后—14.26±5.28②13.19±6.42②尿液B7-1[ρ∕（ng·L-1）]治療前12.88±3.21 18.66±4.55①18.72±4.36①

3 討論

CGN在歷代中醫(yī)古籍中歸屬于“慢腎風(fēng)”、“尿濁”、“水腫”、“腰痛”、“虛勞”等疾病范疇。CGN的病因病機(jī)雖然各醫(yī)家觀點(diǎn)有所不同，但主要?dú)w于脾腎虧虛。王億平教授認(rèn)為其病機(jī)屬脾腎虧虛，先后天相互為用，一損俱損；如遇外邪侵襲，則癥狀加重；同時(shí)，患者大多有瘀血阻絡(luò)的表現(xiàn)，故臨床以健脾益腎為治療大法，并以活血化瘀法貫穿治療始終[17]。參地顆粒的基礎(chǔ)方人參湯首載于《圣濟(jì)總錄纂要》一書中，功效為健脾益腎、固攝精微?；谌藚珓?chuàng)制的參地顆粒除上述功效外，尚具有活血化瘀之力。方中紅參補(bǔ)脾益肺、益腎助陽、固攝精微為君；茯苓、熟地黃健脾益腎，五味子養(yǎng)陰固精，桑螵蛸固精縮尿，雞內(nèi)金攝精止遺，共為臣藥；川芎活血化瘀，為佐使之用，全方合用，共奏健脾益腎、固攝精微之功，又兼活血化瘀之效。

CGN的發(fā)病機(jī)理一直是臨床及科研工作者研究的熱點(diǎn)，病程中由于免疫反應(yīng)的異常出現(xiàn)腎臟病理損傷得到廣大腎臟病學(xué)者的認(rèn)同，即體液免疫與細(xì)胞免疫在腎臟病中交相作用。本研究通過檢測(cè)血清IL-2、IL-6、IFN-γ水平發(fā)現(xiàn)，CGN患者確實(shí)存在細(xì)胞因子紊亂。由Th細(xì)胞分泌的IL-2在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中起關(guān)鍵作用。本研究中患者血清IL-2水平明顯降低，通過治療后有所升高，說明參地顆?？梢酝ㄟ^刺激IL-2分泌保護(hù)腎臟，與既往研究結(jié)果相似[18]。IL-6是加速腎小球疾病的重要因子，發(fā)生系膜增生性腎小球腎炎時(shí)，在沉積的免疫復(fù)合物刺激作用下可分泌IL-6，其作為病理性細(xì)胞因子又可反過來刺激系膜增生、系膜基質(zhì)增多，加速腎臟病理惡化，因此，IL-6是與腎臟病變聯(lián)系最為緊密的細(xì)胞因子之一[19]。IFN-γ屬于典型的Th1細(xì)胞因子，其來源廣泛，CD4＋T細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞均可分泌，主要參與細(xì)胞免疫。發(fā)生自身免疫性疾病時(shí)可刺激CD4＋T細(xì)胞表達(dá)IL-2、IL-12等因子，導(dǎo)致Th1∕Th2細(xì)胞比例失衡。目前已經(jīng)證實(shí)IFN-γ與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、IgA腎病等有關(guān)[20]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)過治療后患者血清IFN-γ水平明顯下降，與既往研究結(jié)果相似。因此，IFN-γ可通過刺激系膜細(xì)胞增生對(duì)腎臟血流動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生影響，使血漿蛋白等大分子物質(zhì)通透性增加，從而加速腎臟病理變化。由此可見，CGN患者普遍存在Th1∕Th2細(xì)胞因子的失衡，IL-2、IFN-γ、IL-6不僅是免疫應(yīng)答時(shí)產(chǎn)生的免疫介質(zhì)，又可加速腎臟病理進(jìn)程。

自身免疫性疾病的發(fā)生主要是由于機(jī)體內(nèi)抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生的免疫復(fù)合物沉積造成的炎癥性反應(yīng)，其中免疫細(xì)胞的異?；罨且鸢l(fā)病的基礎(chǔ)。在活化的T細(xì)胞表面可見細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（CTLA-4）的表達(dá)，與CD28競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合B7（B7-1、B7-2）產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。CD28與B7結(jié)合后可促進(jìn)T細(xì)胞活化，CTLA-4（CD152）與B7結(jié)合后發(fā)揮抑制性作用，機(jī)體內(nèi)正常的功能活動(dòng)是先由CD28提供共刺激信號(hào)促進(jìn)T細(xì)胞活化，然后CTLA-4激活并競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合B7分子下調(diào)免疫反應(yīng)，抑制T細(xì)胞的過度激活[21]。實(shí)驗(yàn)研究表明[22]，敲除實(shí)驗(yàn)大鼠CTLA-4基因后會(huì)出現(xiàn)自身免疫疾病，因此推測(cè)CTLA-4∕B7在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)方面占有重要的作用，如出現(xiàn)平衡紊亂則易引起疾病的發(fā)生。B7-1（CD80）表達(dá)于B細(xì)胞表面，是CD28∕CTLA-4的共同受體，可在腎臟足突細(xì)胞上表達(dá)[23]，但正常腎臟上無表達(dá)，持續(xù)炎癥、缺氧的狀態(tài)體內(nèi)B7-1會(huì)上調(diào)，這與本研究結(jié)果一致，即治療組和對(duì)照組患者血清及尿液B7-1的表達(dá)均較正常組明顯增多，但經(jīng)治療后均下調(diào)。其引起蛋白尿的機(jī)制可能是影響腎小球?yàn)V過屏障，而敲除大鼠B7-1基因后則未發(fā)生蛋白尿。此外，CTLA-4∕B7與Th細(xì)胞密切相關(guān)，Th前體細(xì)胞（Th0）分化為Th1細(xì)胞這一過程需要B7-1的參與，從而促進(jìn)IL-2、IFN-γ等表達(dá)，因此共刺激分子可通過干擾Th1∕Th2因子紊亂，調(diào)節(jié)腎臟病的進(jìn)展。本研究結(jié)果表明，參地顆粒對(duì)于脾腎虧虛型CGN患者的中醫(yī)證候積分、臨床癥狀及24hUPr水平均有一定的改善作用，這可能是參地顆粒通過調(diào)節(jié)CTLA-4∕B7-1信號(hào)系統(tǒng)，抑制炎癥因子的異常分泌，減輕免疫復(fù)合物的沉積而發(fā)揮作用，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。