崔旭蘭，陳錦桃，何杜朋，袁勁松

（1.南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院，廣東深圳 518000；2.北京大學深圳醫(yī)院，廣東深圳 518036）

銀杏葉為銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥葉，被譽為植物界的“活化石”。據(jù)《本草綱目》記載，其性平、味甘苦，具有活血化瘀、通絡止痛、斂肺平喘、化濁降脂之功效；現(xiàn)代研究表明，銀杏葉中含有黃酮類、內(nèi)酯類、多糖類、酚類等多種活性物質(zhì)，具有保護神經(jīng)系統(tǒng)、改變血液流變學、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂等生物活性[1，2]。

近年來，銀杏葉多糖成分在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等方面的活性不斷被發(fā)現(xiàn)，具有十分可觀的藥用價值和潛在的醫(yī)藥開發(fā)前景。目前，關于銀杏葉多糖類化合物的提取方法主要有水提醇沉法、酶解法、超聲波法、微波法及其相互間的技術聯(lián)用等。單一提取方法的工藝研究時有報道[3]，但不同提取方法間的比較尚無相關文獻報道。因此，本研究在相關提取工藝研究報道的基礎上，以多糖提取物的得率及含量為檢測指標，觀察水提醇沉法、酶法—水提醇沉法、超聲波—水提醇沉法、微波—水提醇沉法對銀杏葉多糖含量的影響，為銀杏葉多糖的進一步開發(fā)應用提供借鑒。現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料

1.1 藥物 銀杏葉由江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司提供（產(chǎn)地：山東；批號：1702001），經(jīng)北京大學深圳醫(yī)院主任中藥師袁勁松鑒定為銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥葉。

1.2 儀器 UV-1700紫外分光光度計[島津企業(yè)管理（中國）有限公司]；DL-720E超聲儀（上海之信儀器有限公司）；WG900CSL23-K6微波爐（佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司）；高速離心機（安徽中佳中科科學儀器有限公司）；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；SHZ-D循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；CP-225D十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；BS-224S萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.3 試劑 D-無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201506）；苯酚、濃硫酸、無水乙醇、丙酮、乙醚、纖維素酶均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 銀杏葉多糖的制備 將銀杏葉烘干、粉碎、過80目篩，備用。

2.1.1 水提醇沉法[4，5]稱取銀杏葉粉末10 g，平行6份，加入30倍量純水浸泡1 h，90℃加熱回流提取3次，每次2 h，將提取液離心20 min（3 500 r/min），取上清液濃縮，再加入無水乙醇（調(diào)節(jié)至乙醇體積分數(shù)為75%）沉淀，4℃靜置12 h，離心20 min（3 500 r/min），沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，60℃真空干燥，即得銀杏葉多糖物質(zhì)。實驗平行3次。

2.1.2 酶解—水提醇沉法[6，7]稱取銀杏葉粉末10 g，平行6份，加入30倍量純水和5 g/L纖維素酶浸泡1 h，90℃加熱回流提取3次，每次2 h，余者操作同上。

2.1.3 超聲波—水提醇沉法[8，9]稱取銀杏葉粉末10 g，平行6份，加入30倍量純水浸泡1 h，90℃加熱超聲（功率500 W）提取3次，每次0.5 h，余者操作同上。

2.1.4 微波—水提醇沉法[10，11]稱取銀杏葉粉末10 g，平行6份，加入30倍量純水浸泡1 h，微波加熱（功率500 W）提取3次，每次10 min，余者操作同上。

2.2 銀杏葉多糖提取物得率計算 按“2.1”項下方法操作，以每種提取方法平行制備6份樣品，將所得銀杏葉多糖提取物烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量，計算提取物得率（p）。由實驗結果可知，不同提取方法所制備的銀杏葉多糖提取物的得率不一，由高至低依次為超聲波—水提醇沉法＞酶解—水提醇沉法＞微波—水提醇沉法＞水提醇沉法；同時利用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行T檢驗分析發(fā)現(xiàn)，其組間兩兩相比未見顯著性差異。具體結果詳見表1。

表1 不同提取方法的銀杏葉多糖提取物得率Table 1 Comparison of the yield of polysaccharide extracts from Folium Ginkgo by different extraction methods （n=6）

2.3 銀杏葉多糖含量測定方法[12，13]

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取無水葡萄糖對照品25.09 mg，加入超純水溶解、定容于250 mL容量瓶中，配制成含無水葡萄糖濃度為0.1004mg/mL的對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取不同提取方法的銀杏葉多糖50 mg，置于250 mL容量瓶中，加入超純水，超聲溶解，定容，配制成含樣品濃度分別為0.202 2 mg/mL（水提醇沉法）、0.201 6 mg/mL（酶解—水提醇沉法）、0.202 5 mg/mL（超聲波—水提醇沉法）、0.201 5 mg/mL（微波—水提醇沉法）的供試品溶液。

2.3.3 標準曲線繪制 分別精密吸取無水葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于具塞試管中，平行3份，補足水至1.0 mL，并加入50 g/L苯酚溶液1.0 mL，混勻后緩慢加入濃硫酸5.0 mL，100℃恒溫水浴保溫10 min，取出放冷至室溫；同時，取超純水1.0 mL，同法同量加入50 g/L苯酚、濃硫酸，作為空白對照；于490 nm波長處測定吸光度[D（λ）]。以D（490 nm）為縱坐標、D-無水葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，計算得回歸方程Y=0.082 8X+0.058 4（R2=0.998 6），表明D-無水葡萄糖對照品在1.434～8.604 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系，結果詳見圖1。

圖1 標準曲線Figure 1 Standard curve

2.3.4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液0.3 mL，平行3份，按“2.3.3”項下操作進行顯色反應，于490 nm處連續(xù)測定6次，計算得平均D（490 nm）為0.396，sR=0.97%，表明儀器的精密度良好。

2.3.5 重復性試驗 精密吸取“2.1.1”項下（水提醇沉法）供試品溶液0.3 mL，平行6份，按“2.3.3”項下操作進行顯色反應后測定D（490 nm），計算得平均D（490 nm）為0.368，sR=1.12%，表明該法的重復性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.1.1”項下（水提醇沉法）供試品溶液0.3 mL，平行3份，按“2.3.3”項下操作進行顯色反應后每隔1 h測定D（490 nm），連續(xù)4 h，計算得平均D（490 nm）為0.361，sR=0.89%，表明該法的穩(wěn)定性良好。

2.3.7 回收率試驗 精密吸取已知含量的“水提醇沉法”供試品溶液0.3 mL，平行6份，分別加入質(zhì)量濃度為0.100 4 mg/mL的D-無水葡萄糖對照品溶液0.3 mL和超純水0.4 mL，混勻后加入50 g/L苯酚、濃硫酸進行顯色反應，應用紫外分光光度計測定D（490 nm），計算得平均回收率為98.75%，sR=0.99%，表明該法準確性良好。具體結果見表2。

2.3.8 不同提取方法的銀杏葉多糖含量測定 準確吸取“2.3.2”項下不同提取方法的銀杏葉多糖溶液0.5 mL，平行6份，按照上述方法進行顯色反應后測定D（490 nm），代入標準曲線計算出多糖含量，利用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行F檢驗及T檢驗，統(tǒng)計其組間兩兩的差異性，結果見表3。

由表3可知，4種不同提取方法所制備的銀杏葉多糖含量均較高，其中多糖含量、提取物得率以超聲波—水提醇沉法的6.82%、14.12%為最高，其次是酶解—水提醇沉法的6.68%、14.05%，再次之為微波—水提醇沉法的6.15%、13.31%，最后是水提醇沉法的5.69%、12.58%。此外，與水提醇沉法的多糖含量相比，超聲波—水提醇沉法（P＜0.01）、酶解—水提醇沉法（P＜0.01）、微波—水提醇沉法（P＜0.05）均具有顯著性差異。

表2 加樣回收率試驗結果Table 2 Recovery test results （n=6）

表3 不同提取方法的銀杏葉總多糖含量Table 3 Comparison of the contents of polysaccharide from Folium Ginkgo by different extraction methods（n=6）

3 討論

由上述研究結果可知，不同提取方法對銀杏葉多糖成分的含量具有一定影響，就多糖提取物得率及含量而言，超聲波—水提醇沉法＞酶解—水提醇沉法＞微波—水提醇沉法＞水提醇沉法。究其根本，新技術新方法的創(chuàng)新集成應用，起到了協(xié)同的效果。本研究采用新技術方法輔助水提醇沉法制備銀杏葉多糖，其中水溶性大、分子量較小的多糖成分可易溶出，但部分大分子多糖成分可能較難溶出；同時，在醇沉過程中，由于多糖分子量的不同，可能導致部分銀杏葉多糖成分損失。故與某些文獻報道相比，所測得銀杏葉多糖含量可能偏低。

對于提取的新技術新方法，如超聲提取法，其主要是利用超聲波的空化作用、機械效應和熱效應等加速胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴散和溶解；微波提取法是以高頻電磁波穿透至介質(zhì)內(nèi)部，通過熱能轉化提高細胞內(nèi)部壓力，促使細胞破裂而釋放有效物質(zhì)；酶法則是通過專一高效的活性酶來水解特定的某種物質(zhì)結構，使得其內(nèi)目標成分有效釋放。與傳統(tǒng)方法相比，均具有耗能少、時間短、效率高等特點[14]。如本研究中提取時間依次為水提醇沉法=酶解—水提醇沉法（6 h）＞超聲波—水提醇沉法（1.5 h）＞微波—水提醇沉法（0.5 h）。其中，與傳統(tǒng)水提醇沉法相比，超聲—水提醇沉法節(jié)省75%的時間，微波—水提醇沉法節(jié)省92%的時間。就多糖提取率而言，超聲波—水提醇沉法（6.82%）＞酶解—水提醇沉法（6.68%）＞微波—水提醇沉法（6.15%）＞水提醇沉法（5.69%），與傳統(tǒng)水體醇沉法相比，超聲—水提醇沉法、微波—水提醇沉法、酶解—水提醇沉法分別提高了19.86%、17.40%、8.08%。因此，改變傳統(tǒng)單一方法制備模式，創(chuàng)新應用現(xiàn)代化技術方法進行有機集成，必將是未來中藥有效成分提取分離純化的發(fā)展趨勢。