米佳 閆冠池 朱浩宇 王國強(qiáng) 王秀閣 李香艷

(1長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林 長春 130021；2長春中醫(yī)藥大學(xué))

胰島素抵抗(IR)是糖耐量異常及2型糖尿病(T2DM)的重要發(fā)病機(jī)制，且貫穿于糖尿病(DM)的整個(gè)病程，因此改善IR是治療T2DM及減輕靶器官損害的重要策略〔1〕。據(jù)“國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)糖尿病地圖”中流調(diào)顯示，中國DM患病人數(shù)達(dá)到1.144億，居全球首位〔2〕。肝臟是能量代謝的主要場所，同時(shí)是胰島素作用的重要效應(yīng)器官，糖酵解、糖異生及脂質(zhì)合成等過程是通過攝取葡萄糖及游離脂肪酸(FFA)而達(dá)到的，進(jìn)而維持能量穩(wěn)態(tài)。當(dāng)肝臟儲(chǔ)能作用失衡，肝糖輸出增加，促使高胰島素血癥進(jìn)一步加重，進(jìn)而形成T2DM。AMP活化蛋白激酶(AMPK)是細(xì)胞內(nèi)的能量感受器，通過絲氨酸/蘇氨酸殘基的磷酸化控制細(xì)胞的葡萄糖和脂質(zhì)代謝。AMPK的激活影響脂質(zhì)代謝中多個(gè)酶的表達(dá)及活性水平，并能影響轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，例如通過增強(qiáng)脂肪酸氧化，抑制脂質(zhì)合成和抑制糖異生，是降低肝臟中脂質(zhì)積累水平的重要步驟。

前期研究證實(shí)，苦酸通調(diào)方在臨床應(yīng)用和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有改善糖代謝作用，其可通過改善胰島素受體底物-1/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(IRS-1/PI3K/Akt)信號(hào)通路傳導(dǎo)，增加葡萄糖消耗，減少肝糖原合成，從而增強(qiáng)肝臟糖異生〔3，4〕。其中主要藥物黃連、丹參、大黃等具有增強(qiáng)胰島素敏感性、減輕炎癥反應(yīng)等作用，可用于T2DM的治療〔5～7〕。還有研究顯示大黃黃連合劑能夠改善T2DM大鼠模型的糖代謝情況〔8〕。本實(shí)驗(yàn)旨在已有的前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討苦酸通調(diào)方對(duì)棕櫚酸聯(lián)合高糖誘導(dǎo)HepG2胰島素抵抗細(xì)胞胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)、脂質(zhì)代謝及AMPK/ACC/SREBP-1的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 HepG2細(xì)胞人肝癌細(xì)胞株，購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2藥物及試劑 苦酸通調(diào)方(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房提供)；二甲雙胍(HY-17471A，MCE公司)；DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清(12100061、16140071，Gibco公司)；細(xì)胞裂解液、噻唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(P0013、C0201，武漢碧云天生物公司)；棕櫚酸(MB7088，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；油紅O染色試劑盒、三酰甘油(TG)檢測試劑盒、膽固醇檢測試劑盒(D027、A110、A111，南京建成生物工程研究所)；兔抗人單克隆抗體AMPKα，單克隆抗體p-AMPK(Thr172)，單克隆抗體乙酰輔酶A羥化酶(ACC)，多克隆抗體p-ACC(Ser79)(美國Cell Signaling公司，批號(hào)分別為5832，50081，9272，9336)；兔單克隆抗體SREBP-1(557036，美國BD公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔多克隆抗體免疫球蛋白(Ig)G、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠單克隆抗體IgG(BA1054、BA1050，武漢博士德生物工程有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(A0216，碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.1.3儀器 濕化型CO2恒溫培養(yǎng)箱(3111，Thermo)；YZ-875超凈工作臺(tái)(江蘇蘇州凈化設(shè)備廠)；低溫高速離心機(jī)(5804R，德國Eppendorf)；DK-S2微型振蕩器(浙江金華實(shí)驗(yàn)儀器廠)；鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅醫(yī)療生物儀器公司)；M200 PRO酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；超低溫冰箱(900，美國Thermo Fisher)；ECL發(fā)光儀(美國Protein Simple公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在37℃，5%CO2濕化條件中，給予10%胎牛血清(FBS)、青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度約80%時(shí)進(jìn)行傳代。各干預(yù)組加入無血清低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，使各組細(xì)胞生長同步化后再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT比色法檢測細(xì)胞活力 將MTT溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)為5 mg/ml過濾除菌后備用，選擇細(xì)胞融合度約80%的HepG2細(xì)胞，胰酶消化后，以8 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板。細(xì)胞貼壁生長24 h，吸棄原培養(yǎng)基，加入不同的干預(yù)液100 μl，培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT溶液10 μl，置細(xì)胞于培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育4 h。震蕩混勻，490 nm處測定吸光度。以對(duì)照組細(xì)胞的存活率為100%計(jì)算不同組別細(xì)胞存活率。

1.4高糖聯(lián)合棕櫚酸孵育建立HepG2 IR模型 稱取9.165 mg棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于0.25 ml無水乙醇中，將溶解后的棕櫚酸加入11.88 ml高糖DMEM培養(yǎng)〔其中含有0.12 ml FBS，0.25 g牛血清白蛋白(BSA)〕，55℃水浴15 min，冷卻后過濾除菌即為3 mmol/L棕櫚酸溶液，造模時(shí)稀釋至0.25 mmol/L，孵育細(xì)胞24 h，建立HepG2 IR模型。

1.5分組及處理 正常組加入正常培養(yǎng)液，模型組及苦酸通調(diào)方低、中、高劑量組均加入造模液，孵育24 h，建立IR模型。吸棄培養(yǎng)液，正常組、模型組加入無血清DMEM培養(yǎng)液，苦酸通調(diào)方組加入藥物溶液(50、100、200 μg/ml)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。

1.6細(xì)胞葡萄糖攝取量的檢測 分組干預(yù)處理后，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，每孔加入2 ml無糖DMEM培養(yǎng)液饑餓4 h，胰酶消化，收集細(xì)胞，加入含或不含100 nmol/L胰島素的2-NBDG處理，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min，吸棄上清，預(yù)冷PBS洗滌，1 000 r/min離心5 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.7三酰甘油含量檢測 HepG2培養(yǎng)于含10%FBS DMEM低糖培養(yǎng)液，以30 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，將造模液作用于HepG2細(xì)胞24 h，苦酸通調(diào)方組孵育24 h，吸取上清，10 000 r/min，離心5 min，檢測上清中三酰甘油含量；收集細(xì)胞，1 000 r/min，離心5 min，留細(xì)胞沉淀；用PBS清洗3次，同1 000 r/min，離心5 min，棄上清液，留細(xì)胞沉淀。加入0.2 ml的PBS充分混勻，低溫條件下超聲(功率：200 W，超聲4 s，間隔2秒，重復(fù)5次)，制備好的勻漿液測定蛋白濃度及三酰甘油含量。

1.8油紅O染色 細(xì)胞給予不同處理24 h后，吸棄原培養(yǎng)基，PBS洗滌。4%多聚甲醛固定。油紅O染液染色15 min，復(fù)染液染色5 s，水洗30 s，重復(fù)3次。

1.9Western印跡檢測AMPK，p-AMPK，ACC，p-ACC，SREBP-1蛋白水平 吸棄各處理組上清，預(yù)冷PBS沖洗2次，每孔加入預(yù)冷RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解，刮取細(xì)胞，4℃下10 000 r/min離心10 min。BCA法測定細(xì)胞蛋白濃度。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠(10%)和濃縮膠(5%)。上樣總蛋白40 μg，加入電泳緩沖液，電泳電壓及時(shí)間(濃縮膠為80 V，30 min；分離膠為100 V，1 h)。再將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(110 V，90 min)。5%BSA封閉1 h，加入相應(yīng)一抗(1∶1 000)，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠第二抗體(1∶5 000)，室溫孵育1 h。洗膜5次后，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，拍照。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取量的影響 與正常組〔(1.00±0.02)mmol/L〕比較，模型組細(xì)胞的葡萄糖攝取量明顯下降〔(0.63±0.02)mmol/L,P<0.05〕；與模型組相比，苦酸通調(diào)方高劑量組、陽性對(duì)照組顯著增多HepG2 IR細(xì)胞葡萄糖攝取量〔(0.84±0.05)mmol/L，(0.93±0.02)mmol/L，P<0.05〕，且增加細(xì)胞葡萄糖攝取量的效果呈劑量依賴性?？嗨嵬ㄕ{(diào)方低、中劑量組攝取量為〔(0.66±0.03)mmol/L,(0.72±0.03)mmol/L〕與模型組無差異(P>0.05)。

2.2油紅O染色 造模液作用后細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多，隨著苦酸通調(diào)方濃度的增加，細(xì)胞脂滴逐漸減少。見圖1。

圖1 苦酸通調(diào)方對(duì)HepG2 IR脂類物質(zhì)積累情況的影響(油紅O染色，×40)

2.3對(duì)HepG2 IR細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響 與正常組細(xì)胞中TG的含量〔(0.07±0.02)mg/g〕相比，模型組細(xì)胞中的含量均明顯增加〔(0.27±0.05)mg/g,P<0.05〕；與模型組相比，苦酸通調(diào)方各劑量組的細(xì)胞中TG的含量均有所降低，且降低效果呈劑量依賴性〔低劑量組(0.23±0.07)mg/g、中劑量組(0.21±0.03)mg/g、高劑量組(0.20±0.02)mg/g〕。其中中、高劑量組、陽性對(duì)照組(二甲雙胍)〔(0.210±0.02)mg/g〕TG含量較模型組明顯降低(P<0.05)。

2.4HepG2細(xì)胞AMPK，p-AMPK，ACC，p-ACC，SREBP-1的蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組p-AMPKα，p-ACC水平顯著降低，SREBP-1、ACC表達(dá)顯著增加(P<0.05)，與模型組比較，陽性對(duì)照組、苦酸通調(diào)方中、高劑量組p-AMPKα明顯增加，苦酸通調(diào)方高劑量組、陽性對(duì)照組p-ACC水平表達(dá)明顯增加，陽性對(duì)照組、苦酸通調(diào)方各劑量組SREBP-1表達(dá)顯著降低，陽性對(duì)照組、苦酸通調(diào)方中、高劑量組ACC表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。見圖2，表1。

1～6：正常組、模型組、苦酸通調(diào)方低劑量組、苦酸通調(diào)方中劑量組、苦酸通調(diào)方高劑量組、陽性對(duì)照組圖2 各組HepG2 IR細(xì)胞中AMPK，p-AMPK，ACC，p-ACC，SREBP-1蛋白表達(dá)

表1 苦酸通調(diào)方對(duì)HepG2細(xì)胞中p-AMPK，ACC，p-ACC，SREBP-1蛋白表達(dá)

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為T2DM屬“消渴”“脾癉”范疇，苦酸通調(diào)方依據(jù)六郁和絡(luò)滯病機(jī)，確立“苦酸制甜”、“辛開苦降”、“活血通絡(luò)”、“解毒通絡(luò)”為基本治法，選用丹參、黃連、黃芪、知母、天花粉、制紅曲、肉桂、烏梅、生地、酒大黃組成本方。諸藥辛苦酸并用，寒溫相佐，達(dá)到了苦酸制甜，辛開苦降，通達(dá)絡(luò)脈之功。

脂代謝紊亂是胰島素抵抗發(fā)生的始動(dòng)因素。TG是人體主要供能脂類之一，肝臟及脂肪在胰島素的刺激下可進(jìn)行TG的合成。TG合成增加、異常累積為肝細(xì)胞胰島素抵抗的重要病理改變之一。FFA增加使TG在脂肪、肌肉和肝臟中過度累積，超過各組織的儲(chǔ)存及代謝能力，最終引起IR。肝臟是脂肪酸代謝的主要場所，通過進(jìn)行糖異生、脂肪酸合成及分解等過程調(diào)節(jié)脂代謝。肝細(xì)胞攝取FFA主要通過兩種途徑進(jìn)行代謝，一是合成膽固醇、TG和磷脂等，二是進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化供能。肝臟脂質(zhì)合成增加是IR脂質(zhì)代謝紊亂的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔9〕。AMPK是細(xì)胞能量感受器，調(diào)節(jié)細(xì)胞脂代謝及胰島素信號(hào)傳遞，活化的AMPK抑制脂質(zhì)合成進(jìn)程的相關(guān)基因，如：SREBP-1。SREBP1是調(diào)節(jié)TG合成的重要轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)大多數(shù)涉及脂質(zhì)合成過程中的必要基因的表達(dá)，肝臟中的SREBP-1表達(dá)增加，轉(zhuǎn)錄活性升高，上調(diào)脂質(zhì)合成相關(guān)基因(如ACC)的表達(dá)〔10〕。同時(shí)SREBP-1c介導(dǎo)胰島素對(duì)脂肪生成基因的誘導(dǎo)，在葡萄糖刺激下，SREBP-1c和ChREBP協(xié)同誘導(dǎo)糖酵解和脂肪合成mRNA表達(dá)〔11〕。此外SREBP-1負(fù)調(diào)控肝細(xì)胞內(nèi)IRS-1/PI3K/Akt途徑為主的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路，減少肝糖原合成。同時(shí)增加葡萄糖轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)，促進(jìn)IR的形成。因此，抑制肝臟SREBP-1的表達(dá)不僅可以減少脂質(zhì)的合成，同時(shí)能夠改善IRS-1/PI3K/Akt的信號(hào)傳導(dǎo)，有效的抑制肝臟IR〔12,13〕。ACC是脂肪酸合成的第一個(gè)限速酶，包含ACC1和ACC2亞型，ACC1可催化脂肪酸合成，ACC2能夠抑制脂肪酸的氧化分解。激活A(yù)MPK可促進(jìn)ACC1磷酸化，從而抑制ACC的活性及脂質(zhì)合成，增加脂肪酸氧化〔14〕。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)提示苦酸通調(diào)方50、100、200 μg/ml的濃度對(duì)IR HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活性無明顯抑制作用。在本研究中，苦酸通調(diào)方作用HepG2 IR細(xì)胞后，糖攝取能力明顯增加，AMPK，ACC磷酸水平增加，SREBP-1，ACC蛋白表達(dá)減少。據(jù)此，提出假說，苦酸通調(diào)方調(diào)節(jié)胰島素抵抗模型HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝可能是通過調(diào)節(jié)AMPK、ACC、SREBP-1通路實(shí)現(xiàn)的。