李玉潔 陳鑫超 徐曉蘭, 繆曉青, 吳珍紅,

（1 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2 福建農(nóng)林大學(xué)蜂療研究所，福州 350002；3 天然生物毒素國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

蜂蜜是一種天然、粘稠、穩(wěn)定的甜味劑[1]，主要由糖類(lèi)（7 0%～8 5%）組成，其中大部分（85%～95%）是單糖，即果糖和葡萄糖[2]，此外，蜂蜜含有少量微量成分，如蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、酶、維生素、有機(jī)酸和酚類(lèi)化合物[3-5]。蜂蜜具有滲透壓高、pH低、粘度高、含有抗菌物質(zhì)等特性[6-9]，因此，蜂蜜中的微生物較少，只生長(zhǎng)嗜滲透和耐滲透的微生物，主要為芽孢桿菌、肉毒桿菌和酵母菌。

大多數(shù)天然蜂蜜樣品含有可檢測(cè)水平的酵母[10]，酵母菌的生長(zhǎng)代謝會(huì)消耗蜂蜜中的單糖，將其轉(zhuǎn)化為二氧化碳和乙醇，導(dǎo)致蜂蜜發(fā)酵，并降低蜂蜜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[11]，但酵母菌在高滲透壓下能夠通過(guò)滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)緩解高滲脅迫，聚集多種代謝物為滲透壓保護(hù)物質(zhì)[12]，如甘油、海藻糖、D-阿拉伯糖醇、赤蘚糖醇等物質(zhì)[13]，可作為發(fā)酵工程菌。本文從鴨腳木蜂蜜中分離鑒定出魯氏接合酵母，研究高糖對(duì)其生長(zhǎng)和氧化酶活力的影響，從而了解魯氏接合酵母在不同高糖濃度下的生理特性，為篩選耐糖工程菌提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

鴨腳木蜜采自福建省泉州市惠安縣凌溪水庫(kù)。

蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自O(shè)XOID公司，無(wú)水葡萄糖、甘油購(gòu)自國(guó)藥有限公司，氯硝胺18%甘油瓊脂、氯霉素購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司，DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，SOD、POD、CAT、BCA法蛋白定量測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，色譜級(jí)乙腈購(gòu)于默克公司，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自TMstandard公司，果糖、麥芽糖、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。

HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱（蘇州培英），Q5000超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Quawell公司），G154DS自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋（廈門(mén)致微），Infinite 200Pro 酶標(biāo)儀（Tecan），SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化）。

1.2 培養(yǎng)基配制

YPD培養(yǎng)基：對(duì)照培養(yǎng)基，10g/l的酵母提取物，20g/l蛋白胨，20g/l葡萄糖，自然pH值，12l ℃滅菌20min。

高糖培養(yǎng)基：10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨，分別添加300g/l、400g/l、500g/l、600g/l葡萄糖，自然pH值，12l ℃滅菌20min。

1.3 蜂蜜中酵母菌的分離

根據(jù)GB14963-2011，用30%葡萄糖溶液對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋后，取0.2ml涂布于氯硝胺18%甘油瓊脂（DG18）上，在30℃下培養(yǎng)7d，挑取形態(tài)符合酵母菌菌落且具有代表性的單菌落，在30%葡萄糖液體培養(yǎng)基中30℃、180r/min搖培3d。

1.4 ITS鑒定

根據(jù)酵母菌D N A 提取試劑盒提取酵母菌D N A。使用I T S 1 和I T S 4 引物（正向引物：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和反向引物：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下：預(yù)變性溫度94℃，3min；變性溫度94℃，40sec；退火溫度60℃，45sec；延伸溫度72℃，45sec；復(fù)性溫度72℃，10min；40個(gè)循環(huán)，保存溫度4℃。PCR體系為25μl，體系如下：2×Taq PCR masterMix，12.5μl；Primer F（10μmol/l），1μl；Primer R（10μmol/l），1μl；DNA模版，80～100ng；加ddH2O至25μl。之后將PCR產(chǎn)物送于上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。運(yùn)用BLAST工具，將得到的ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有序列進(jìn)行比對(duì)分析，分析分離酵母菌與已知酵母菌序列的同源性，鑒定分離酵母菌的種屬。

1.5 酵母菌的活化

將酵母菌轉(zhuǎn)接至30%葡萄糖液體培養(yǎng)基中，30℃、180r/min下培養(yǎng)12～16h，活化3次，制備處于指數(shù)生長(zhǎng)期的酵母懸浮液，菌體密度為2×108CFU/ml[14]，以此作為種子液。

1.6 生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定

按7%的接種量接入已滅菌的YPD對(duì)照培養(yǎng)基，300g/l、400g/l、500g/l、600g/l高糖培養(yǎng)基中，30℃下180r/min搖培，每8h用超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)基在600nm處的光密度值[15]。

1.7 培養(yǎng)基中殘?zhí)橇亢头涿壑刑呛康臏y(cè)定

參照GB5009.8-2016《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》，每8h測(cè)定一次培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，同時(shí)測(cè)定鴨腳木蜜中的葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖含量。在配備有示差折光檢測(cè)器（RID）和氨基柱（InterSustain NH2，4.6mm×250mm，5μm）的高效液相色譜儀（島津）中測(cè)定培養(yǎng)基和蜂蜜中的糖含量。乙腈水溶液作流動(dòng)相，乙腈與水的比例為70:30（v/v），流速為1ml/min，進(jìn)樣量為20μl，柱溫為40℃。

1.8 酶活力測(cè)定

取培養(yǎng)至24h時(shí)的培養(yǎng)液，9000r/min，4℃離心酵母菌10min，用PBS洗滌4次，酵母菌再溶于PBS中至濃度為2×109CFU/ml，在液氮和水浴中反復(fù)凍融三次（在液氮中5min，在37℃中10min）[17]，酵母凍融后4℃、14000r/min離心10min，取上清液用于酶活力的測(cè)定，超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活力根據(jù)南京建成公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行，同時(shí)根據(jù)南京建成公司的BCA法蛋白定量測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液的蛋白含量[16]。一個(gè)SOD酶活力單位是在反應(yīng)體系中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)對(duì)應(yīng)的酶量。利用過(guò)氧化物酶（POD）催化過(guò)氧化氫反應(yīng)的原理，測(cè)定420nm處吸光度的變化得其酶活力，在37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化1μg底物的酶量定義為一個(gè)POD酶活力單位。過(guò)氧化氫酶（CAT）分解H2O2的反應(yīng)可通過(guò)加入鉬酸銨而中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用生成一種淡黃色的絡(luò)合物，在405nm處測(cè)定其變化量得出CAT的活力，每毫克蛋白每秒鐘分解1μmol的H2O2的量為一個(gè)CAT酶活力單位[18]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件分析。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，單因素ANOVA分析用于顯著性分析，p＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，p＜0.01表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS鑒定結(jié)果

圖1為魯氏接合酵母在DG18培養(yǎng)基上的形態(tài)特征，菌落呈圓形，形狀厚且大，表面濕潤(rùn)，乳白色，邊緣整齊。將ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有序列進(jìn)行比對(duì)，與Genbank登錄號(hào)KY106065.1的同源性為98%，比對(duì)結(jié)果為Zygosaccharomyces rouxii（魯氏接合酵母）。

圖1 魯氏接合酵母的形態(tài)特征

2.2 蜂蜜中的糖含量

表1為鴨腳木蜂蜜中各種糖類(lèi)的含量。蜂蜜中果糖和葡萄糖的含量相當(dāng)，這兩種單糖含量占總糖含量的71%，雙糖含量為29%。四種糖類(lèi)含量達(dá)68.978g/100g蜂蜜，魯氏接合酵母可以在蜂蜜中存活，其耐糖量也高達(dá)68.978g/100g以上。

2.3 魯氏接合酵母在不同糖濃度下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

圖2為魯氏接合酵母在不同糖濃度下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，除在30%的培養(yǎng)基中，酵母菌生長(zhǎng)均呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的趨勢(shì)，而在30%的糖濃度下，酵母菌在24h前先快速生長(zhǎng)，24～40h內(nèi)生長(zhǎng)速度低于24h前的速度，而40h后酵母菌出現(xiàn)了二次生長(zhǎng)。在32h前酵母菌在對(duì)照組中的生長(zhǎng)速度大于在高糖培養(yǎng)基中的速度，對(duì)照組中酵母菌0～24h為生長(zhǎng)期，24h后到達(dá)了穩(wěn)定期，而在高糖培養(yǎng)基中的酵母菌的生長(zhǎng)期發(fā)生了延遲，除30%組，其他3個(gè)濃度的培養(yǎng)基48h后才到達(dá)穩(wěn)定期。由此可知隨著糖濃度的增加，滲透壓增加，酵母菌的生長(zhǎng)速率會(huì)降低，生長(zhǎng)期出現(xiàn)延遲。

圖2 魯氏接合酵母在不同糖濃度下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.4 不同糖濃度培養(yǎng)基的殘?zhí)橇?/h3>

圖3為不同糖濃度培養(yǎng)基的殘?zhí)橇?，由圖可知，在對(duì)照組中，24h后培養(yǎng)基中的葡萄糖含量為0，葡萄糖被消耗殆盡。在高糖組中，隨著糖濃度的增加，滲透壓增加，酵母菌的糖耗量下降，30%組的糖耗量最高。

圖3 不同糖濃度培養(yǎng)基的殘?zhí)橇?/p>

2.5 不同糖濃度下魯氏接合酵母的SOD活力變化

圖4為魯氏接合酵母在不同糖濃度的培養(yǎng)基中胞內(nèi)SOD活力的變化。在高糖培養(yǎng)基中，胞內(nèi)SOD活力較對(duì)照組極顯著增加（p＜0.01），且在高糖培養(yǎng)基中呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在50%組的酶活力達(dá)到最大，為（15.4182±2.7506）U/mg蛋白。30%、40%、50%、60%組的酶活力分別為對(duì)照組的1.75倍、3.49倍、4.70倍、4.12倍。

表1 蜂蜜中的糖含量

圖4 不同糖濃度下魯氏接合酵母的SOD活力變化

2.6 不同糖濃度下魯氏接合酵母的POD活力變化

圖5為魯氏接合酵母在不同糖濃度的培養(yǎng)基中胞內(nèi)POD活力的變化。由圖可知，在30%、40%、50%、60%的培養(yǎng)基中，酵母菌胞內(nèi)POD的活力都比對(duì)照組高，30%、40%組較對(duì)照組顯著增加（p＜0.05），50%組較對(duì)照組極顯著增加（p＜0.01），酶活力最大，為（9.5344±1.5518）U/mg蛋白，而60%組與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（p＞0.05）。30%、40%、50%、60%組培養(yǎng)后的酶活力分別為對(duì)照組的1.62倍、1.58倍、1.72倍、1.21倍。

圖5 不同糖濃度下魯氏接合酵母的POD活力變化

2.7 不同糖濃度下魯氏接合酵母的CAT活力變化

圖6 不同糖濃度下魯氏接合酵母的CAT活力變化

圖6為魯氏接合酵母在不同糖濃度的培養(yǎng)基中胞內(nèi)CAT活力的變化。由圖可知，高糖組酶活力比對(duì)照組高，40%與60%組較對(duì)照組顯著增加（p＜0.05），40%組的酶活力最高，為（6.2238±2.0924）U/mg蛋白。30%、40%、50%、60%組的酶活力分別為對(duì)照組的1.24倍、2.41倍、1.95倍、2.39倍。

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)有研究已經(jīng)從蜂蜜中分離出了八孢裂殖酵母、蜂蜜接合酵母、暹羅接合酵母、魯氏接合酵母以及釀酒酵母等。樊潔等[19]對(duì)華北地區(qū)的13種蜂蜜的耐高滲酵母菌進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蜂蜜中存在有八孢裂殖酵母、蜂蜜接合酵母以及暹羅接合酵母，對(duì)其最適生長(zhǎng)條件和發(fā)酵液的成分進(jìn)行了研究。浦德雄等[20]從油菜蜂蜜中分離鑒定得到了蜂蜜接合酵母和暹羅接合酵母，研究了其在麥芽汁培養(yǎng)基上的菌落特征和酵母形態(tài)。邱巨香等[21]從中蜂蜜和意蜂蜜中分離鑒定出魯氏接合酵母，觀(guān)察了其菌落形態(tài)。目前關(guān)于從蜂蜜中分離魯氏接合酵母，及其在不同糖濃度下的生理特性變化和氧化酶活力變化的研究較少，本文從鴨腳木蜂蜜中分離酵母菌，經(jīng)ITS鑒定為魯氏接合酵母，研究其在YPD培養(yǎng)基、30%、40%、50%、60%的高糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)、耗糖量和氧化酶活力的變化，結(jié)果表明：隨著初始糖濃度的增加，酵母生長(zhǎng)速率降低，對(duì)數(shù)期延遲，且30%糖濃度下酵母出現(xiàn)二次生長(zhǎng)；隨著糖濃度的增加，酵母菌的耗糖量降低，30%糖濃度下酵母菌耗糖量最大；與對(duì)照組相比，高糖可以促進(jìn)氧化酶活力的增加，30%、40%、50%、60%糖濃度下的SOD、POD、CAT活力都有不同程度的增加。

本文結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，糖濃度增加，生長(zhǎng)速率降低，生長(zhǎng)期發(fā)生延遲，因?yàn)楦邼B透壓會(huì)引起細(xì)胞脫水，影響胞內(nèi)正常代謝[22]，因此魯氏接合酵母生長(zhǎng)受到抑制，而在30%組40h后出現(xiàn)二次生長(zhǎng)，應(yīng)是培養(yǎng)基內(nèi)的葡萄糖含量降低，滲透壓降低，酵母菌生長(zhǎng)速率增加。王珍珍等[23]從樹(shù)莓酵素中分離魯氏接合酵母后對(duì)其生長(zhǎng)特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)葡萄糖含量增加，酵母的延滯期也增加。Membre JM等[24]研究了不同糖濃度的合成培養(yǎng)基對(duì)魯氏接合酵母的影響，發(fā)現(xiàn)糖濃度從30%增加到80%后，酵母的生長(zhǎng)速率也會(huì)降低。

在本文中，隨著糖濃度的增加，魯氏接合酵母的糖耗量降低，這是因?yàn)楦邼舛鹊奶菍?duì)酵母有葡萄糖阻遏和葡萄糖抑制作用[25]，且高滲透壓會(huì)導(dǎo)致酵母細(xì)胞水分流失，生長(zhǎng)速率降低，因此糖濃度越高，糖耗量越低。李曉軍等[26]研究了釀酒酵母在高滲脅迫下的生理代謝，發(fā)現(xiàn)在高滲培養(yǎng)基中酵母消耗葡萄糖的速率減慢。彭酈等[27]研究低溫下高糖對(duì)釀酒酵母的影響，發(fā)現(xiàn)隨著糖濃度的增加，葡萄糖消耗速率降低。

酵母菌受到脅迫時(shí)，胞內(nèi)的氧化還原平衡被打破，內(nèi)源反應(yīng)性氧化物會(huì)對(duì)菌體造成傷害，但氧化酶可以消除自由基，從而保護(hù)細(xì)胞[28]，因此，本文對(duì)魯氏接合酵母在高糖培養(yǎng)基中三種氧化酶的活力進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，三種酶活力都有不同程度的增加，說(shuō)明這三種氧化物酶對(duì)維持胞內(nèi)正常滲透壓起到一定作用[29]。張穗生等[28]研究了釀酒酵母MF1002和呼吸突變株MF11a在高糖脅迫下的生理特性變化，發(fā)現(xiàn)在30%葡萄糖培養(yǎng)基中兩菌株SOD、POD、CAT、細(xì)胞質(zhì)ATP酶和線(xiàn)粒體ATP酶活力顯著上升。Li Chunsheng等[18]研究魯氏接合酵母在NaCl和Cd脅迫下的生理特性，發(fā)現(xiàn)NaCl從2%增加至6%時(shí)，SOD、CAT和POD活性顯著增加。本文中魯氏接合酵母在30%至60%的培養(yǎng)基中，SOD、POD、CAT酶活力較對(duì)照組都有不同程度的增加，與先前研究結(jié)果一致。