段紹鳳 陳庚 閆靜 覃忠明 張廣輝 梁艷麗

摘 ?要 ?本研究以三七（Panax notoginseng）植株及其產(chǎn)品和近緣種為研究對(duì)象，采用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)三七素的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，然后利用HPLC法檢測(cè)三七素含量，并對(duì)各樣品中的三七素含量進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明：優(yōu)化后的三七素提取條件為超純水、料液比1∶20（g/mL），提取1次（10 min）;三七素在三七花蕾中的含量最高，其次是根狀莖和主根，但是三七莖葉中也有較高含量的三七素，說(shuō)明三七花蕾和莖葉均可作為三七素的提取原料;在三七產(chǎn)品中三七花的三七素含量最高，達(dá)到3.33%，其次是剪口（根狀莖）、筋條（側(cè)根）和須根;但三七素的含量與三七個(gè)頭大?。^數(shù)）并無(wú)明顯的相關(guān)性;在三七近緣種姜狀三七（P. zingiberensis）和野三七（P. vienamensis var. fuscidiscus）主根、珠子參（P. japonicus var. major）根狀莖中的三七素含量顯著低于三七主根三七素含量，也顯著低于三七其他部位的三七素含量，說(shuō)明三七是最佳的三七素來(lái)源植物。三七素的含量主要受到物種和部位的影響，與產(chǎn)品規(guī)格無(wú)關(guān)。本文所建立的三七素提取方法和HPLC檢測(cè)方法，能夠快速簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠測(cè)定樣品中三七素含量;并可為三七素相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)，為三七的綜合利用開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 ?三七;三七素;HPLC;超聲提取

中圖分類(lèi)號(hào) ?R284 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?The extraction process of dencichine in Panax notoginseng was optimized by the L9（34） orthogonal test， and the content of dencichine was determined by HPLC. The optimized extraction condition for dencichine was extracted once with ultrapure water at solid-to-liquid ratio of 1∶20 （g/mL） for 10 min. Flower bud had the highest dencichine content， followed by rhizome， main roots and leaves. The content of dencichine in flower buds was 3.33%. There was no significant correlation between the content of dencichine and the rhizom size. The content of dencichine in the rhizome of P. zingiberensis and P. vienamensis var. fuscidiscus was significantly lower than that of the main root of P. notoginseng. It was also significantly lower than that of other parts of P. notoginseng， indicating that P. notoginseng was the best source of dencichine. The content of dencichine was mainly affected by species and parts， and had nothing to do with product specifications. The extraction method and HPLC detection method established in this paper could quickly and easily determine the content of dencichine. It can lay a foundation for the establishment of related standards of dencichine and provide a basis for the comprehensive utilization and development of P. notoginseng.

Keywords ?Panax notoginseng; dencichine; HPLC; supersonic extraction

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.11.021

三七素是三七[Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen]中的一種非蛋白游離氨基酸，化學(xué)名稱(chēng)為β-N-草酰-L-α， β-二氨基丙酸（β-N-Oxalyl-L- α， β-diaminopropionic acid， β-ODAP）。三七素具有止血活性成分，通過(guò)增加體內(nèi)血小板數(shù)量止血，并縮短凝血和出血的時(shí)間，被廣泛用于外傷出血治療等，是云南白藥等多種傳統(tǒng)藥方的有效成分[1-2]。低劑量三七素可以止血，高劑量則引發(fā)神經(jīng)毒性，而人畜過(guò)度食用會(huì)導(dǎo)致不可逆癱瘓[3]。三七素存在于五加科人參屬植物中，如三七[P. notoginseng （Burk.） F. H. Chen]、人參（P. ginseng）、西洋參（P. quinquefolium）等[4-7]，還存在于山黧豆（Lathyrus sativus）中。三七素含量的檢測(cè)方法，包括氨基酸自動(dòng)分析儀[8-9]、柱前衍生化HPLC法[10-13]、HPLC-ELSD法[14]、直接高效液相色譜法[15-16]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法[17]、多孔石墨化碳柱分析法[18]、熒光衍生后薄層掃描[19]等。在上述方法中氨基酸自動(dòng)分析儀、HPLC-ELSD法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法中存在儀器昂貴、應(yīng)用不廣泛、分析過(guò)程復(fù)雜、特異性強(qiáng)等問(wèn)題，特別是用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法時(shí)會(huì)存在無(wú)關(guān)的峰，對(duì)三七素測(cè)定有一定的影響。熒光衍生后薄層掃描的衍生化產(chǎn)物不穩(wěn)定，掃描定量中引起誤差的因素較多，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。除了測(cè)定方法外，三七素的提取方法也至關(guān)重要，常用的提取方法有超聲提取、冷浸提取、回流提取和水煎煮法。但是三七素對(duì)溫度有一定的要求，溫度過(guò)高會(huì)使三七素變質(zhì)。現(xiàn)有的方法對(duì)三七素的提取和測(cè)定都存在著一定的不足之處，并且現(xiàn)在對(duì)三七素的研究相對(duì)少，而我國(guó)藥典中三七藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不包括三七素，但美國(guó)FDA已將三七素作為三七質(zhì)量控制指標(biāo)[20]，因此，研究三七及其產(chǎn)品中三七素的含量分布特點(diǎn)，對(duì)于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定有重要指導(dǎo)意義。本研究使用超聲提取三七素，且用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定。并且本研究中所使用提取方法和檢測(cè)方法，能夠快速簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠測(cè)定三七素含量，為三七中三七素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制提供參考及原料的選擇及開(kāi)發(fā)利用提供重要的理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試植物材料 ?不同年份的三七植株（經(jīng)楊生超教授鑒定）采自紅河州彌勒縣東山鎮(zhèn)，分為剪口（根狀莖）、主根、須根、莖、葉片、花蕾等部位。三七的野生近緣種姜狀三七（P. zingiberensis）采自普洱市鎮(zhèn)沅縣九甲鄉(xiāng)，野三七（P. vienamensis var. fuscidiscus）采自紅河州金平縣銅廠(chǎng)鄉(xiāng)，珠子參（P. japonicus var. major）采自大理州祥云縣九鼎山，均為4年生植株，采集時(shí)間為2017年8—10月。樣品均于55 ℃烘干，用于三七素含量測(cè)定。市售三七商品，包括20～90頭（單位“頭”是指每市斤三七中的三七個(gè)數(shù)）不同規(guī)格的三七主根，以及剪口（根狀莖）、筋條（側(cè)根）、須根和三七花，均購(gòu)買(mǎi)自文山三七國(guó)際綜合交易市場(chǎng)。

1.1.2 ?儀器與試劑 ?Agilent 1260系列高效液相色譜儀（G1311C四元泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣儀、G1315D光電二極管陣列檢測(cè)器），Agilent Chem Station工作站，美國(guó)Agilent 公司。

三七素標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于98%，生產(chǎn)批號(hào)wkq17022 207），維克奇生物科技有限公司;乙腈（HPLC級(jí)），F(xiàn)isher公司;四丁基氫氧化銨（純度大于98%），Sigma公司;水為超純水;其他試劑均為分析純。

1.2 ?方法

1.2.1 ?供試樣品溶液制備 ?取樣品約0.5 g（過(guò)65目篩），各3份。精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入超純水10 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率180 W，頻率40 kHz）10 min，靜置放冷，再稱(chēng)定重量，超純水補(bǔ)足減失的重量，搖勻。3500 r/min離心3 min，取上清液適量，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)后，取續(xù)濾液作為供試溶液。取對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，甲醇定容到10 mL，搖勻，制得濃度為401 μg/mL的對(duì)照品溶液，4 ℃保存待用[19]。并選擇對(duì)水溶性物質(zhì)三七素提取量有意義的因素水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件因素與水平（表1）[20]。

1.2.2 ?HPLC測(cè)定條件 ?色譜柱為Hypersil GOLD（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.3%四丁基氫氧化銨（A）（磷酸緩沖液調(diào)pH至4.0）-乙腈（B），梯度洗脫[15]。流動(dòng)相比例變化為0～ 12 min，98%～98% （A）;2%～2% （B），12～18 min，98%～90% （A），2%～10% （B），流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積5 μL。

1.2.3 ?線(xiàn)性關(guān)系及方法學(xué)考察 ?（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與線(xiàn)性范圍和回歸方程。精密吸取對(duì)照品溶液（配制見(jiàn)方法1.2.1）0.1、1、5、10、15、20、25 μL分別進(jìn)樣分析。以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣含量（μg）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，在0.0401～8.001 μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，三七素含量測(cè)定回歸方程為Y=611.3700X+3.9238，r=0.9999。

（2）方法學(xué)考察。精密吸取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積10 μL，得出三七素響應(yīng)信號(hào)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.0%，表明儀器精密度良好。取采自3年生三七主根樣品，制得的供試品溶液5份，按上述HPLC色譜條件分別在0、2、4、6、12、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定，得出三七素響應(yīng)信號(hào)的RSD為0.4%，表明供試樣品溶液中的三七素48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取采自3年生三七主根樣品，按上述條件制得的供試品溶液5份，按上述HPLC色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，得出三七素響應(yīng)信號(hào)的RSD為0.2%，表明該方法重復(fù)性良好。取已測(cè)定含量的3年生三七主根粉末約0.5 g，6份，精密稱(chēng)定，分別精密加入三七素質(zhì)量的80%、100%和120%的對(duì)照品中，平行3份，再按上述方法制得供試溶液進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)定結(jié)果表明，三七素加樣回收率平均值為104.41%，RSD為1.2%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 軟件和SPSS 17.0軟件進(jìn)行整理和分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?三七素提取工藝優(yōu)化

由表2的極差分析結(jié)果可以看出，RB>RD> RC>RA，4個(gè)因素對(duì)三七中三七素提取率的影響大小依次為：甲醇體積分?jǐn)?shù)（B）>物料比（D）>提取時(shí)間（C）>提取次數(shù)（A）。4個(gè)因素中，物料比和甲醇體積分?jǐn)?shù)的影響較為顯著，其中甲醇體積分?jǐn)?shù)的提取作用最為顯著，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)驗(yàn)證范圍內(nèi)，根據(jù)直觀分析得到三七中三七素提取的最佳工藝條件為：甲醇體積分?jǐn)?shù)為0、料液比1∶20提取時(shí)間10 min、提取次數(shù)1次。

2.2 ?三七素在市售三七產(chǎn)品中的含量分布

取三七素對(duì)照品溶液、供試品溶液5 μL在上述色譜條件下注入液相色譜儀，結(jié)果如圖1所示，供試樣品中的三七素峰形與對(duì)照品中的峰形相對(duì)稱(chēng)。

市售三七產(chǎn)品中，三七花中三七素含量最高，達(dá)3.33%，須根中三七素含量最低，僅為1.22%。不同規(guī)格三七主根中三七素含量不同，其中20頭大小的三七主根三七素含量最高，為1.23%;90頭大小的三七主根中的三七素含量最低，為0.94%;但是，頭數(shù)與三七素的含量無(wú)明顯的相關(guān)性（表3）。

2.3 ?不同產(chǎn)地含量測(cè)定

三七種植存在嚴(yán)重的連作障礙，導(dǎo)致適合種植三七土地不斷減少，而紅河是種植三七的另一大的產(chǎn)地，稱(chēng)取三七（3年生）樣品，稱(chēng)取不同部位主根、須根、剪口、莖、葉子、花蕾，分別按1.2.1節(jié)下制備供試樣品溶液，在1.2.2節(jié)液相條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅河州產(chǎn)地的三七的主根、須根、花蕾的三七素含量比文山州的高0.26%～0.83%且差異顯著。其部位剪口、葉、莖的三七素含量差異不顯著。

2.4 ?三七素在三七植株和近緣種中的分布

研究發(fā)現(xiàn)，三七素在三七植株的所有部位均有分布，其中三七素在花蕾中的含量最高，其次是根部和剪口，三七幼苗以及莖和葉片也有較高含量的三七素，因此，價(jià)格低廉的三七莖葉也可以作為提取三七素的原料之一。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)，三七植株主要部位，如花蕾、主根、須根、葉片中三七素的含量均隨著年齡的增長(zhǎng)而提高，并且存在顯著差異（表5）。

比較三七主根與姜狀三七、野三七主根和珠子參根狀莖的三七素含量，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)近緣種中三七素的含量均顯著低于三七，特別是珠子參中三七素含量最低，僅為0.29%（表6）。說(shuō)明三七是三七素的最佳來(lái)源植物。

3 ?討論

本文預(yù)試驗(yàn)中考察了分析柱Agilent ZOR?BAX SB-C18、Agilent Extend-C18、Nova-pak C18、Hypersil GOLD對(duì)三七樣品溶液中三七素的分離度、保留時(shí)間以及峰形，發(fā)現(xiàn)Hypersil GOLD（250 mm4.6 mm，5 μm）可以提高三七素分離度，峰形良好。與文獻(xiàn)報(bào)道相比[20]，我們同時(shí)考察乙腈水、甲醇水、離子對(duì)試劑四丁基氫氧化銨流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)銨離子能夠?qū)е氯咚卦贖ypersil GOLD柱上的保留時(shí)間延長(zhǎng)，有效地改善了峰形，提高了分離度，最終選擇了乙腈0.3%四丁基氫氧化銨;采用了反相離子交換原理，會(huì)對(duì)待測(cè)弱酸的負(fù)離子（羥基端），從而達(dá)到增加保留、提供分離度，該分析方法能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)三七素進(jìn)行定性定量檢測(cè)、并且方法學(xué)驗(yàn)證良好。

與文獻(xiàn)[9]相比我們進(jìn)行了L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件，最終確定的超純水超聲波條件提取三七素含量最高，其中超聲次數(shù)增多，三七素含量降低，可能由于三七素受熱不穩(wěn)定發(fā)生了脫羧反應(yīng)而減少。甲醇體積分?jǐn)?shù)增加，提取的三七素含量降低，這可能由于三七素相對(duì)分子質(zhì)量小、極性大、水溶性好的特性。1∶20、1∶30、1∶50這3個(gè)物料比中，1∶20提取率最高，增加溶劑導(dǎo)致三七素提取量降低，可能由于三七水溶性好，在一定的溶劑量下就可以趨向平衡[21]。

前人測(cè)定藥材市場(chǎng)上人參屬植株商品中三七素含量[7]，測(cè)定主要集中在人參、高麗參、西洋參，而本文測(cè)定了與前者不同的同屬植株主根中三七素含量，也發(fā)現(xiàn)三七中三七素含量最高[9]。本研究測(cè)定的三七素含量結(jié)果發(fā)現(xiàn)花蕾中三七素含量最高，分析可能是三七花蕾為三七素積累的主要部位，因此，筆者推斷可以通過(guò)比較不同部位基因表達(dá)差異，能進(jìn)一步為發(fā)現(xiàn)與三七素合成途徑相關(guān)基因提供參考基礎(chǔ)，也能夠揭示不同部位三七素含量差異。本文還研究了不同產(chǎn)地三七中三七素的含量，發(fā)現(xiàn)紅河州產(chǎn)地的主根、須根、花蕾中的三七素含量比文山州產(chǎn)地的高，與前人的研究有點(diǎn)差異[9]，但都有一定的參考價(jià)值，能為今后選擇適宜的三七種植地提供一定的參考。并且本文采用色譜法系統(tǒng)測(cè)定具有快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，全面考察了三七不同規(guī)格、生長(zhǎng)年限、產(chǎn)地、部位以及同屬植株三七素含量的影響，為三七中三七素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制提供參考。目前三七素還沒(méi)有開(kāi)發(fā)利用，對(duì)三七研究主要集中在三七的藥用部位主根，本研究結(jié)果顯示三七花蕾、葉中三七素含量較高，尤其是花蕾部位中含量達(dá)2.98%～3.33%。在2012—2013年，三七莖葉的年產(chǎn)量達(dá)800萬(wàn)kg，但其利用率卻只有5%[22]。針對(duì)此三七花蕾、葉中三七素含量高，做到物盡其用，提高三七的綜合利用率，為合理開(kāi)發(fā)利用三七藥用資源具有重要意義。

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