于兆偉，謝雅清，張珮璇，鮑 金，孫陳煉，靳翠麗,2，周曉見，2

(1.揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127； 2.揚(yáng)州大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225127)

海洋生物污損(biofouling)指的是在海水浸泡中的無特殊保護(hù)的船底、碼頭、浮標(biāo)和各類水下人工設(shè)施的表面上常常發(fā)生大量海洋生物聚集的現(xiàn)象[1]。生物污損在海洋運(yùn)輸、軍事安全、海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖、近岸海洋資源利用、海洋科學(xué)研究與海洋工程等方面危害嚴(yán)重，每年在全球范圍內(nèi)由海洋生物污損造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)200億美元[2]。生物污損不僅包括大型藻類和海洋無脊椎動物如藤壺(Amphibalanusamphitrite)、貽貝(Mytilusedulis)等造成的污損，還包括由細(xì)菌和硅藻形成的生物膜[3]。生物膜除了造成設(shè)備孔道堵塞、表面粗糙、金屬腐蝕等問題，還為后續(xù)的污損生物附著提供支撐，影響大型污損生物的附著和后續(xù)生長，最終導(dǎo)致復(fù)雜的污損生物群落的形成[4-5]。在水下可見光照射范圍內(nèi)，硅藻是生物膜的主體。與細(xì)菌相比，硅藻對水下表面的附著覆蓋面更廣泛，附著強(qiáng)度更大、更頑固[6-8]。

硅藻附著離不開硅藻向細(xì)胞外大量分泌的胞外多聚物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)，EPS最主要的成分是糖和蛋白質(zhì)。EPS直接影響生物膜的形成過程、垂直結(jié)構(gòu)以及穩(wěn)定性等多個方面[4]。按照與硅藻細(xì)胞結(jié)合的緊密程度，可將EPS分為兩大類：可溶性EPS(Soluble EPS，SL-EPS)和粘附性EPS(Bound EPS，B-EPS)兩部分[9-11]。不同類的EPS成分組成也不盡相同，生理功能也有差異，因此往往對這兩類EPS分別進(jìn)行分離提取。溶解在水中的SL-EPS一般均可以通過高速離心分離藻細(xì)胞后獲得，該分離提取方法在目前的研究中較為一致。而B-EPS 是和藻細(xì)胞緊密粘附的，不能通過簡單離心的方法獲得，目前使用的分離方式多種多樣，并沒有形成統(tǒng)一的分離方法。目前使用的分離提取B-EPS 的方法有物理方法和化學(xué)方法兩大類[12]。前者主要有超聲提取法、熱提取法、陽離子交換樹脂法、超聲-陽離子交換樹脂法等；后者主要有硫酸提取法、氫氧化鈉提取法、福爾馬林-NaOH提取法、EDTA法和戊二醛法等。本研究選取了其中幾種分離提取效率較高的方法，提取典型污損硅藻雙眉藻(Amphorasp.)的EPS，比較EPS主要成分的提取量和EPS總量，為硅藻EPS的相關(guān)研究提供合適的分離提取方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藻種與培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所研究的硅藻雙眉藻(Amphorasp.)由揚(yáng)州大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)研究所提供。

使用含硅的f/2培養(yǎng)液培養(yǎng)雙眉藻，按100 cm3培養(yǎng)液接種10 cm3藻液的比例接種，細(xì)胞初始密度為7.1×104cells/cm3。 FHI-2010HT型光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為23±2℃，光照強(qiáng)度5 000 lx，光暗比12 h∶12 h條件下，培養(yǎng)21 d得到密度為8.11×105cells/cm3的藻液。培養(yǎng)結(jié)束，將藻液徹底混勻后形成懸濁液。

1.2 EPS提取方法

1.2.1 離心處理提取SL-EPS 在無菌操作臺中，在離心管中加入10 cm3混勻后的藻液。將藻液在4 000 r/min離心10 min，收集上清液，即得到SL-EPS。每組處理設(shè)置3個平行。所有提取得到的樣品置于-20℃冰箱內(nèi)待測。

對離心得到的藻細(xì)胞沉淀分別用4種方法進(jìn)行處理，以提取B-EPS。并且在各B-EPS處理過程中，均使B-EPS提取液的體積等于原始藻液體積。

1.2.2 30℃水浴處理提取B-EPS 向藻細(xì)胞沉淀加入10 cm3純水，充分混勻，30℃下水浴1 h。冷卻至室溫再在4 000 r/min離心15 min，收集上清液，即得到B-EPS[12]。

1.2.3 70℃水浴處理提取B-EPS 向藻細(xì)胞沉淀加入10 cm3磷酸鹽緩沖液(0.1 mmol/cm3，pH=7.5)。室溫下靜置20 min，70℃水浴1 h。冷卻至室溫，再在4 000 r/min離心15 min，收集上清液，即得到B-EPS[13]。

1.2.4 福爾馬林-NaOH處理提取B-EPS 向藻細(xì)胞沉淀加入0.05%的NaCl溶液10 cm3，充分搖勻后靜置5 min，再加入37%的福爾馬林0.06 cm3，室溫下用恒溫磁力攪拌器攪拌(轉(zhuǎn)速900 r/min)1 h，再加入1 mmol/cm3NaOH溶液4 cm3，繼續(xù)攪拌(轉(zhuǎn)速900 r/min)3 h。在4 000 r/min離心15 min，收集上清液，即得到B-EPS[14]。

1.2.5 陽離子交換樹脂處理提取B-EPS 向藻細(xì)胞沉淀加入10 cm3含有2 nmol/cm3Na3PO4、4 mmol/cm3NaH2PO4、9 nmol/cm3NaCl、1 nmol/cm3KCl的緩沖溶液(pH為7.0)，靜置20 min。按照樹脂：藻沉淀為70∶1(質(zhì)量比)加入陽離子交換樹脂。在恒溫磁力攪拌器上攪拌16 h(轉(zhuǎn)速900 r/min)，抽濾(濾膜孔徑為0.45 μm)去除陽離子交換樹脂和藻細(xì)胞，收集濾液即得到B-EPS[14]。

1.3 EPS中各成分含量測定方法

采用考馬斯亮藍(lán)染色法測量樣品中的蛋白質(zhì)含量[15]，硫酸-苯酚法測量總糖含量[16]，硫酸鋇比濁法測量硫酸基含量[17]，硫酸-咔唑法測量糖醛酸含量[18]。DNA含量使用NANODROP 2000超微量紫外分光光度計(jì)檢測獲得。將測得的蛋白質(zhì)、總糖、硫酸基、糖醛酸和DNA的總和作為提取得到的EPS總量。

各成分和EPS濃度均按照原始藻液體積進(jìn)行濃度換算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)每組處理均設(shè)置3個平行，所獲得的數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 22.0軟件分析。對于方差分析顯著性的因素，利用Dunnett’s T3進(jìn)行多重比較，各分析指標(biāo)差異顯著性以p=0.05或0.01為標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 水溶性SL-EPS的組成成分

如表1所示，提取獲得的水溶性SL-EPS溶液中，不僅含有0.208 mg/cm3蛋白質(zhì)、0.115 mg/cm3總糖，而且含有的硫酸基也非常豐富，達(dá)到0.266 mg/cm3。此外還含有糖醛酸和少量DNA，含量分別為0.046 mg/cm3和0.009 mg/cm3。從占比上看， SL-EPS中硫酸基含量豐富，達(dá)到了41.3%；其次是蛋白質(zhì)，占比為32.3%；總糖占比為17.9%；糖醛酸占比為7.1%；還含有極少量的DNA。

表1 雙眉藻SL-EPS中各成分的含量Tab.1 Contents of each components in SL-EPS from Amphora sp. cells

2.2 不同處理方法對提取B-EPS中蛋白質(zhì)含量的影響

對雙眉藻的B-EPS進(jìn)行4種不同的處理，提取得到B-EPS中的蛋白質(zhì)含量如圖1所示(圖中大寫字母代表顯著性p≤0.01，小寫字母代表顯著性p≤0.05[19])。其中70℃水浴處理效率最高，提取到的蛋白質(zhì)含量達(dá)到了0.044 mg/cm3；陽離子交換樹脂處理其次，提取到的蛋白質(zhì)含量為0.035 mg/cm3；福爾馬林-NaOH處理提取到的蛋白質(zhì)較少，含量為0.023 mg/cm3； 30℃水浴處理提取效率最低，遠(yuǎn)低于其它3組，蛋白質(zhì)含量僅為0.008 mg/cm3，不足70℃水浴處理的1/5。不同處理提取到的蛋白質(zhì)的含量存在極顯著差異。

圖1 不同處理方法提取的雙眉藻B-EPS中蛋白質(zhì)含量Fig.1 Protein contents in B-EPS extracted from Amphora sp. cells by different treatments 圖中大寫字母代表顯著性p≤0.01，小寫字母代表顯著性p≤0.05；下同。

2.3 不同處理方法對提取B-EPS中總糖含量的影響

從圖2可以看到，福爾馬林-NaOH處理提取到的總糖含量最高，為0.170 mg/cm3，顯著高于其它方法；70℃水浴處理和陽離子交換樹脂處理區(qū)別不大，提取總糖的含量都低于福爾馬林-NaOH處理。提取總糖效率最低的為30℃水浴處理，含量為0.019 mg/cm3，是福爾馬林-NaOH處理提取量的1/10左右，也顯著低于70℃水浴處理和陽離子交換樹脂處理。

圖2 不同處理方法提取的雙眉藻B-EPS中總糖含量Fig.2 Total sugar contents in B-EPS extracted from Amphora sp. cells by different treatments

2.4 不同處理方法對提取B-EPS中硫酸基含量的影響

不同處理方法對硫酸基的提取量也有一些影響(圖3)，陽離子交換樹脂處理的提取效率比其它方法略低，獲得的硫酸基濃度為0.228 mg/cm3。30℃水浴處理提取到的硫酸基的含量最高，為0.386 mg/cm3，是陽離子交換樹脂處理的1.7倍。70℃水浴、福爾馬林-NaOH處理的硫酸基含量與30℃水浴處理差別不大。

圖3 不同處理方法提取的雙眉藻B-EPS中硫酸基含量Fig.3 Sulfate contents in B-EPS extracted from Amphora sp. cells by different treatments

2.5 不同處理方法對提取B-EPS中糖醛酸的影響

從圖4中可以發(fā)現(xiàn)，4種方法中最適合提取糖醛酸的是福爾馬林-NaOH處理，得到的糖醛酸的含量為0.138 mg/cm3，顯著高于其它3組。30℃水浴處理提取的糖醛酸最少，為0.009 mg/cm3，只是福爾馬林-NaOH處理的1/15。70℃水浴與陽離子交換樹脂處理提取效率也不高，提取的糖醛酸濃度相似，分別為0.018 mg/cm3和0.021 mg/cm3。

圖4 不同處理方法提取的雙眉藻B-EPS中糖醛酸含量Fig.4 Uronic acid contents in B-EPS extracted from Amphora sp. cells by different treatments

2.6 不同處理方法對提取B-EPS中DNA含量的影響

從圖5可以看出，使用陽離子交換樹脂提取得到的DNA含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出其它3組，達(dá)到了0.132 mg/cm3，而30℃水浴處理提取到的DNA含量最低，只有0.001 mg/cm3，是陽離子交換樹脂處理的1/132。70℃水浴處理與福爾馬林-NaOH處理得到的DNA含量也不高，分別為0.004 mg/cm3和0.003 mg/cm3。

圖5 不同處理方法提取的雙眉藻B-EPS中DNA含量Fig.5 DNA contents in B-EPS extracted from Amphora sp. cells by different treatments

2.7 不同處理方法對提取B-EPS總量的影響

從4種方法提取到的B-EPS總量來看(圖6)，福爾馬林-NaOH處理得到B-EPS總量最多，達(dá)到0.647 mg/cm3，優(yōu)于陽離子交換樹脂法，30℃和70℃水浴的處理方法得到的B-EPS總量區(qū)別不大。

圖6 不同處理方法提取的雙眉藻B-EPS的總量Fig.6 Total amount of B-EPS extracted from Amphora sp. cells by different treatments

2.8 討論

硅藻雙眉藻(Amphorasp.)的EPS可分為水溶性SL-EPS和粘附性B-EPS兩部分。SL-EPS中硫酸基含量最豐富，其次是蛋白質(zhì)、總糖以及糖醛酸，還含有少量的DNA。粘附性B-EPS中同樣含有上述各成分，總體上看各成分含量按從高到低的順序依次為：硫酸基、總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸以及少量DNA。不同的提取方法對于B-EPS中各成分的提取效率總體上差異顯著。各成分提取效率普遍受提取方法的影響，其中DNA含量變化幅度最大，如陽離子交換樹脂處理使DNA含量劇增達(dá)數(shù)百倍，提示此方法可能造成了嚴(yán)重的細(xì)胞破裂，使細(xì)胞核的DNA滲漏到胞外造成DNA含量嚴(yán)重偏高。不論SL-EPS和各方法提取的B-EPS中均出現(xiàn)一定量的DNA，說明EPS提取物中存在少量DNA屬于正?，F(xiàn)象，但過高DNA含量則說明胞內(nèi)物質(zhì)的滲漏溶出[12-14]。蛋白質(zhì)、總糖和糖醛酸含量由于提取方法的不同，會有5～10倍的差別，硫酸基含量也出現(xiàn)了翻倍的情況。

采用物理方法分離B-EPS的測試中，熱處理和陽離子交換樹脂這兩種方法用的比較多。其中，熱處理方法通過提升體系的溫度，提高了B-EPS各成分在水中的溶解度，并通過后續(xù)的高速離心處理，進(jìn)一步增加B-EPS在水中的溶解度，從而達(dá)到分離B-EPS的目的[20]。因此，B-EPS的提取效率與溫度密切相關(guān)。當(dāng)溫度較低時，B-EPS的分離效率十分有限，因此30℃處理提取的B-EPS各成分普遍低于其他方法提取的對應(yīng)成分，以蛋白質(zhì)為例，30℃水浴提取到蛋白質(zhì)濃度為0.008 mg/cm3，不足最高組0.044 mg/cm3的1/5；30℃水浴提取到的總糖濃度為0.019 mg/cm3，只占最高組0.170 mg/cm3的1/10左右；而在溫度過高時，有可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸以及酶的變性，會對B-EPS成分的進(jìn)一步分析造成不利影響，是需要注意的問題[21]。另外，由于長時間的熱處理還可能帶來胞內(nèi)物質(zhì)的溶出，目前熱處理的方法大多采用較短時間(如1 h)的加熱溶解[12-13]。實(shí)際上，B-EPS的提取效率應(yīng)可能是處理溫度和處理時間共同作用的效果，但關(guān)于處理時間方面的研究尚未有深入的報(bào)道。

EPS能與許多金屬離子(例如Ca2+、Mg2+等)螯合形成單價、雙價、多價陽離子與EPS陰離子相結(jié)合的復(fù)合物。多價陽離子通過靜電交聯(lián)作用，維持EPS中總糖和蛋白質(zhì)之間鏈接的穩(wěn)定性，而陽離子交換樹脂在溶液中可解離出氫離子(H+)，與溶液中的金屬離子或其他陽離子基團(tuán)發(fā)生相互交換作用，具有去除二價陽離子的功能，使得加入陽離子交換樹脂的體系中EPS的基質(zhì)變得不穩(wěn)定，導(dǎo)致EPS更容易從細(xì)胞膜上剝離[22]。另外，通過調(diào)節(jié)磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速使水流產(chǎn)生紊流運(yùn)動，流體質(zhì)點(diǎn)的不規(guī)則運(yùn)動產(chǎn)生剪切力。這些因素都有助于EPS從藻細(xì)胞表面的剝離[22-23]。本研究中陽離子交換樹脂的使用量為70 g/1 g(樹脂重量/藻沉淀重量)，恒溫磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為900 r/min，提取時間為16h。此方法提取到的EPS總量居于第2位，其中蛋白質(zhì)0.035 mg/cm3，按濃度由高到低排第2位；提取到總糖濃度為0.115 mg/cm3，按濃度由高到低排第2位，但是對于硫酸基和糖醛酸的提取效果不佳，提取到硫酸基0.229 mg/cm3，濃度是4種方法中最低的；提取到糖醛酸濃度為0.021 mg/cm3，遠(yuǎn)低于濃度最高組的0.138 mg/cm3，而且細(xì)胞破碎的情況比較嚴(yán)重，DNA含量劇增。同時，DNA含量的劇增也提示在此B-EPS提取條件下，其它胞內(nèi)物質(zhì)也存在滲漏至B-EPS提取物中的可能，干擾后續(xù)EPS相關(guān)研究結(jié)果。實(shí)際上，陽離子交換樹脂的提取效果受多種因素的影響，提取效率以及細(xì)胞的破裂程度受樹脂的提取時間以及使用量的影響，還受水流剪切力(攪拌器轉(zhuǎn)速、溶液深度、轉(zhuǎn)子及容器大小等)的影響。樹脂用量低，提取效率不高，使用量過高則可能會對細(xì)胞造成嚴(yán)重影響；提取時間過長有可能造成嚴(yán)重的細(xì)胞破碎；水流剪切力越大，EPS從細(xì)胞剝離越徹底但是細(xì)胞破碎也越嚴(yán)重[24-25]。因此陽離子交換樹脂法提取B-EPS時的條件應(yīng)包括樹脂使用量、提取時間、提取攪拌情況等，仍需要更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索、確定。

化學(xué)方法中采用的是福爾馬林-NaOH處理，福爾馬林通過和蛋白質(zhì)中的胺基、羥基等基團(tuán)及細(xì)胞膜中的核酸相互作用來固定細(xì)胞，從而達(dá)到抑制細(xì)胞消解的作用，以減少對分離B-EPS產(chǎn)生的干擾。EPS含有的羥基、羧基等多種有機(jī)官能團(tuán)在溶液中呈負(fù)電荷性，添加適量的NaOH，提高了B-EPS內(nèi)酸性基團(tuán)的解離，增強(qiáng)了本身帶負(fù)電的EPS之間的排斥，并增加了B-EPS在水中的溶解度，從而提高B-EPS的分離效率[26]。本研究中，福爾馬林-NaOH處理取得了良好的提取效果，提取到的EPS總量最高，其中提取到的總糖和糖醛酸濃度最高；硫酸基排在第2位；但提取蛋白質(zhì)的效率不是最高；從DNA的含量上看，福爾馬林-NaOH處理方法并沒有造成嚴(yán)重的細(xì)胞破裂。

3 結(jié)論

EPS提取方法的不同對于EPS各成分的提取效率會造成嚴(yán)重影響[14]。對文獻(xiàn)中提取效果較好的4種B-EPS提取方法進(jìn)行比較。綜合4種方法提取硅藻B-EPS的效果來看，陽離子交換樹脂容易導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞破壞；低溫水浴處理的EPS提取方法效率太低；較高的溫度水浴處理可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸和酶等物質(zhì)的變性，不利于EPS成分的后續(xù)分析；福爾馬林-NaOH的處理方法提取效果良好，且不會造成嚴(yán)重的細(xì)胞破裂。比較這4種文獻(xiàn)報(bào)道的EPS提取方法，為研究硅藻EPS時提供參考。就典型污損硅藻Amphorasp.而言，福爾馬林-NaOH處理的方法是一種相對均衡和高效的硅藻細(xì)胞B-EPS的提取方法。