宋燕飛 - 陳祥貴 - 向俊丞 -王 瑋 陰鵬飛 - 楊 瀟

(1. 西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2. 宜賓西華大學(xué)研究院，四川 宜賓 644004；3. 西華大學(xué)食品非熱加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644004；4. 西華大學(xué)食品非熱加工工程技術(shù)研究中心，四川 宜賓 644004)

農(nóng)藥殘留一直是各國食品安全體系建設(shè)重點(diǎn)關(guān)注的內(nèi)容[1]。中國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥使用十分廣泛且管理困難，迫切需要發(fā)展適合基層監(jiān)測監(jiān)管的農(nóng)藥殘留快速檢測手段[2-3]。因此，采取及時(shí)、有效、快速的檢測方法對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全進(jìn)行監(jiān)管顯得尤為重要。

在現(xiàn)有的農(nóng)藥殘留檢測中，氣相色譜法[4]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[5-6]、高效液相色譜法[7-8]和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[9-10]作為傳統(tǒng)的手段，可以有效檢測出果蔬中的農(nóng)藥殘留量，但檢測成本高、耗時(shí)長、不利于快速檢測。而酶抑制法作為一種體外檢測農(nóng)藥殘留量的新型方法，具有操作簡便、快速、靈敏度高、無需昂貴的儀器等特點(diǎn)，特別適合基層現(xiàn)場檢測，是目前農(nóng)藥殘留快速檢測常用的方法[11]。

酶抑制法中，檢測用酶是影響酶抑制法靈敏性和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。國內(nèi)外報(bào)道[12-14]用于農(nóng)藥殘留檢測的酶傳感器所用酶絕大多數(shù)為乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)，且主要來自電鰻、家蠅和牛紅細(xì)胞，酶源非常單一。課題組[15]前期研究中通過同源建模和分子對接預(yù)測各種酯酶對不同農(nóng)藥的敏感性，該方法在預(yù)測絲氨酸水解酶對有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性方面表現(xiàn)出良好的性能，發(fā)現(xiàn)錦龜頭部酯酶和樹鼩肝部酯酶具有較高的應(yīng)用前景。試驗(yàn)擬以錦龜頭部酯酶和樹鼩肝部酯酶為研究對象，確定酶促反應(yīng)的最佳檢測條件，測定兩種酶對常見有機(jī)磷類農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的IC50和LOD值，為科學(xué)評價(jià)以錦龜酯酶、樹鼩酯酶為酶源在酶抑制法中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

錦龜頭部、樹鼩肝部粗酶：保存于-20 ℃，中國科學(xué)院昆明動物研究所；

敵敵畏、敵百蟲、氧化樂果、速滅磷、甲胺磷、對硫磷、樂果、磷銨、久效磷、毒死蜱、辛硫磷、克百威、速滅威、甲萘威、滅多威、涕滅威、丁硫克百威：國家農(nóng)藥質(zhì)檢中心；

碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)、5,5’-二硫代-2,2’-二硝基苯甲酸(DTNB)、吲哚乙酸酯(3-Acetoxyindole)：分析純，美國Fluka公司；

其他試劑：分析純，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀：SpectraMax i3x型，美國Molecular Devices公司；

電子天平：TB-214型，北京賽多利斯儀器有限公司；

超低溫冰箱：Ultra Freeze3410型，丹麥Heto公司。

1.3 錦龜乙酰膽堿酯酶與樹鼩酯酶的相對酶活測定

1.3.1 錦龜乙酰膽堿酯酶 根據(jù)Ellman法[16]測定并稍作修改。依次取50 μL磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.5)、50 μL 錦龜酶液、100 μL ATChI (1.5 mmol/L)加入96孔板，35 ℃下處理15 min，加入100 μL DTNB(1.5 mmol/L)顯色，通過在412 nm處連續(xù)測量5 min內(nèi)OD值的變化來檢測相對酶活。同時(shí)以酶抑制法常用酶源電鰻乙酰膽堿酯酶在最適條件下的相對酶活作為對照酶活[17]。按式(1)計(jì)算錦龜酯酶相對酶活。

(1)

式中：

c——相對酶活，%；

m1——錦龜OD值變化；

m2——電鰻OD值變化。

1.3.2 樹鼩酯酶 根據(jù)酶片法[18]測定并稍作修改。分別取100 μL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 8.0)、50 μL樹鼩肝臟酶液加入96孔板，25 ℃下孵育15 min，加入50 μL 吲哚乙酸酯(8 mmol/L)，通過5 min內(nèi)連續(xù)測量610 nm處熒光強(qiáng)度的變化來檢測相對酶活。同時(shí)以酶抑制法常用酶源豬肝酯酶在最適條件下的相對酶活作為對照酶活[17]。按式(2)計(jì)算樹鼩酯酶的相對酶活。

(2)

式中：

c——相對酶活，%；

m1——樹鼩酯酶的熒光值變化；

m2——豬肝酯酶的熒光值變化。

1.4 酯酶抑制率的檢測

在酶促反應(yīng)體系中，分別加入不同濃度的酶抑制劑，同時(shí)以未加抑制劑組為對照組。分別按1.3的方法測定相對酶活，并按式(3)計(jì)算抑制率。

(3)

式中：

c——抑制劑，%；

m1——無抑制時(shí)反應(yīng)體系OD值；

m2——有抑制時(shí)反應(yīng)體系OD值。

1.5 錦龜酯酶與樹鼩酯酶酶促反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.5.1 pH、溫度和反應(yīng)時(shí)間對酶促反應(yīng)的影響 在溫度35 ℃，反應(yīng)時(shí)間15 min下，考察pH(6.5，7.0，7.5，8.0，8.5)對相對酶活的影響；在pH 7.5，反應(yīng)時(shí)間15 min下，考察溫度(20，25，30，35，40 ℃)對相對酶活的影響；在溫度35 ℃，pH 7.5下，考察反應(yīng)時(shí)間(5，10，15，20，25 min)對相對酶活的影響。

1.5.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取最適pH值、溫度、時(shí)間設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化酶促反應(yīng)條件。

1.6 農(nóng)藥敏感性(IC50)研究

按1.4方法測量錦龜酯酶和樹鼩酯酶抑制率，根據(jù)不同農(nóng)藥濃度(2×10-3，2×10-4，2×10-5，2×10-6，2×10-7，2×10-8mol/L)的酶抑制率C，以抑制劑濃度負(fù)對數(shù)(-lgC)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制折線圖，通過抑制率曲線方程，當(dāng)y=0.5時(shí)，抑制率為50%，計(jì)算得到IC50。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8、SPSS 16.0和Excel等分析軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間對酶活力的影響

由圖1可知，錦龜酯酶最佳反應(yīng)條件為pH 7.5、溫度35 ℃、反應(yīng)時(shí)間15 min；樹鼩酯酶最佳反應(yīng)條件為pH 8.0、溫度25 ℃、反應(yīng)時(shí)間15 min。

2.2 最優(yōu)反應(yīng)條件確定

2.2.1 錦龜酯酶 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇適宜參數(shù)水平，建立三因素三水平正交試驗(yàn)因素水平表見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

圖1 反應(yīng)條件對酶活的影響

由表2、3可知，各因素對錦龜酯酶酶活影響次序?yàn)閜H >溫度>反應(yīng)時(shí)間，且三者對酶活的影響均極顯著，其中pH對酶活測定影響最大；最佳反應(yīng)條件為A2B2C2，即pH 7.5、溫度35 ℃、反應(yīng)時(shí)間15 min。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=9)測得，該條件下相對酶活為(108.440±0.176)%。

表1 錦龜酯酶酶促反應(yīng)條件正交試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)水平表

表2 錦龜酯酶酶促反應(yīng)條件正交試驗(yàn)及結(jié)果

表3 方差分析表?

2.2.2 樹鼩酯酶 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇適宜參數(shù)水平，建立三因素三水平正交試驗(yàn)因素水平表，見表4，正交試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析見表6。

由表4、5可知，各因素對樹鼩酯酶影響大小為溫度>pH>反應(yīng)時(shí)間，pH、溫度對樹鼩酯酶影響差異極顯著；樹鼩酯酶最佳反應(yīng)條件為A2B2C2，即pH 8.0、溫度25 ℃、時(shí)間15 min。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=9)測得,該條件下相對酶活為(113.569±0.351)%。

表4 樹鼩酯酶酶促反應(yīng)條件正交試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)水平表

表5 樹鼩酯酶酶促反應(yīng)條件正交試驗(yàn)及結(jié)果

表6樹鼩酯酶酶促反應(yīng)條件方差分析表?

Table 6 Variance analysis of enzymatic reaction conditions of esterase from Tupaiabelangeri

2.3 特異性抑制分析

由圖2(a)可知，當(dāng)鹽酸多奈哌齊、毒扁豆堿濃度分別為10-3，10-4mol/L 時(shí)，錦龜提取酶抑制率基本達(dá)到100%；當(dāng)濃度分別為10-5，10-6mol/L 時(shí)，抑制率下降，但抑制率>70%；當(dāng)雙(4-硝基苯基)磷酸酯濃度為10-3mol/L 時(shí)，抑制率為56.32%，但在10-4，10-5，10-6mol/L 時(shí)，抑制率均<20%；錦龜提取酶對3種酶抑制劑的敏感性順序?yàn)辂}酸多奈哌齊>毒扁豆堿>雙(4-硝基苯基)磷酸酯，表明錦龜頭部提取的粗酶中可能主要為AChE酶。

由圖2(b)可知，當(dāng)抑制劑濃度為10-3，10-4mol/L 時(shí)，雙(4-硝基苯基)磷酸酯、毒扁豆堿對樹鼩提取酶抑制率均≥94%，當(dāng)抑制濃度為10-5，10-6mol/L時(shí)，抑制率下降，但抑制率>70%；樹鼩酶對3種酶抑制劑的敏感性順序?yàn)殡p(4-硝基苯基)磷酸酯>毒扁豆堿>鹽酸多奈哌齊，表明樹鼩肝部提取的粗酶中可能主要為酯酶。

2.4 對不同濃度有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性

由圖3可知，隨著農(nóng)藥濃度的降低，5種有機(jī)磷農(nóng)藥對錦龜酯酶、樹鼩酯酶的抑制率逐漸降低。當(dāng)農(nóng)藥終濃度由10-4mol/L下降到10-9mol/L時(shí)，錦龜酯酶抑制率下降最明顯的是速滅磷和辛硫磷，下降了68%；樹鼩酯酶抑制率中，敵敵畏、敵百蟲、速滅磷、磷胺、辛硫磷分別下降了52%，61%，57%，59%，74%。

圖3 有機(jī)磷農(nóng)藥對酶的抑制效果

由圖4可知，5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥對錦龜酯酶、樹鼩酯酶抑制率都較高。當(dāng)農(nóng)藥終濃度由10-4mol/L 下降到10-9mol/L時(shí)，5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥對錦龜酯酶抑制率隨農(nóng)藥濃度降低逐漸降低，下降率最高的為克百威，下降了74%；而樹鼩酯酶中下降率最高的為速滅威，下降了73%。

圖4 氨基甲酸酯類農(nóng)藥對酶的抑制效果

表7 酶對有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的IC50

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，錦龜酯酶酶活的最佳反應(yīng)條件為孵育溫度35 ℃、孵育時(shí)間15 min、緩沖液pH 7.5；樹鼩酯酶酶活的最佳反應(yīng)條件為孵育溫度25 ℃、孵育時(shí)間15 min、緩沖液pH 8.0。抑制劑敏感性試驗(yàn)表明錦龜粗酯酶中主要為乙酰膽堿酯酶，而樹鼩肝部提取的粗酶中主要酯酶為酯酶。而錦龜酯酶和樹鼩酯酶對常見有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性均較高，且用于酶抑制法的LOD值均小于GB 2763—2019所要求的農(nóng)藥最大殘留量限量。目前乙酰膽堿酯酶主要從家蠅、電鰻中提取，來源較少，難以滿足檢測過程中的需求，試驗(yàn)所選用兩種酶源，對多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥敏感性較好，可作為酶抑制法快速檢測農(nóng)藥殘留的候選酶源。試驗(yàn)中僅將粗酶作為試驗(yàn)用酶，為進(jìn)一步揭示錦龜酯酶和樹鼩酯酶對農(nóng)藥的敏感性，下一步可先將錦龜酯酶和樹鼩酯酶純化，再分析其對農(nóng)藥的敏感性。