施利奇 - 張彥青 -ng 戚務(wù)勤 -n 王 輕 解軍波 -

(1. 天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617)

酸棗是中國華北地區(qū)的傳統(tǒng)野生藥用植物[1]，具有非常好的藥用以及營養(yǎng)價值[2],是制作天然保健飲品的優(yōu)質(zhì)原料[3]?，F(xiàn)代研究表明，酸棗果肉中營養(yǎng)物質(zhì)主要包括多糖、有機酸、多種維生素以及礦物質(zhì)等[4-5]，具有鎮(zhèn)靜催眠、抗氧化以及增強腸道屏障的作用[6-8]。目前，市場上酸棗飲料產(chǎn)品主要有酸棗汁[9]、酸棗果醋[10]、酸棗果酒[11]等，其中酸棗汁是最主要的品種。

酸棗果肉中通常含有大量的果膠和纖維物質(zhì)，傳統(tǒng)的棗汁生產(chǎn)主要采用熱水浸提或打漿法，可溶物提取效率低，提取時間長等缺點[12-13]。近年來，眾多研究學(xué)者[14-17]針對棗汁生產(chǎn)開發(fā)了多種提取方法，如超聲法、微波法、酶解法等，與傳統(tǒng)方法相比，這些方法可以使細(xì)胞內(nèi)溶物更好地溶出，提取率明顯提高。但迄今為止，采用超聲聯(lián)合酶解法提取酸棗汁，尤其是不同方法對酸棗可溶性物提取率及其抗氧化活性的影響研究還未見報道。

試驗擬采用超聲法、酶解法、超聲輔助酶解法3種方法提取酸棗汁，以酸棗可溶性物提取率為指標(biāo)，利用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化提取工藝，并考察不同工藝提取物的抗氧化活性，為深入開發(fā)酸棗資源、提高酸棗汁產(chǎn)品加工水平提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

酸棗果肉：干制品，產(chǎn)地天津薊縣；

果膠酶(最適pH 4.0，溫度50 ℃，酶活10萬U/g)：河南萬邦實業(yè)有限公司；

纖維素酶(最適pH 4.0，溫度50 ℃，酶活5萬U/g)：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；

檸檬酸：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；

DPPH、ABTS：美國Sigma公司；

其他試劑：分析純，天津市化學(xué)試劑供銷公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DH-101型，天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；

高速萬能粉碎機：FW100型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

電子天平：ME204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

pH計：FE20型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

恒溫水浴鍋：TDA-8002型，天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500B型，昆山市超聲儀器有限公司；

離心機：Heraeus Megafuge 8R型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

折射計：PAL-1型，ATAGO(愛拓)中國分公司；

多功能讀板機：SpectraMax-M5型，美國Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理 稱取干燥酸棗果肉2.0 g于50 mL離心管中，加入一定量的水，60 ℃浸泡1 h，酶解法和超聲輔助酶解法需要用檸檬酸和pH計調(diào)節(jié)pH為4左右。

1.2.2 超聲法提取工藝的優(yōu)化

(1) 超聲時間對提取率的影響：固定液料比7∶1 (mL/g)，超聲溫度50 ℃，超聲功率100 W。分別在超聲時間為10，20，30，40，50 min時提取酸棗果肉，考察超聲時間對酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(2) 超聲功率對提取率的影響：固定液料比7∶1 (mL/g)，超聲溫度50 ℃，超聲時30 min。分別在超聲功率為100，120，140，160，180 W時提取酸棗果肉，考察超聲功率對酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(3) 超聲溫度對提取率的影響：固定液料比7∶1 (mL/g)，超聲時間30 min，超聲功率100 W。分別在超聲溫度為40，50，60，70，80 ℃時提取酸棗果肉，考察超聲溫度對酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(4) 液料比對提取率的影響：固定超聲溫度50 ℃，超聲時間30 min，超聲功率100 W。分別在液料比為5∶1，7∶1，9∶1，11∶1，13∶1 (mL/g) 時提取酸棗果肉，考察液料比對酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(5) 響應(yīng)面試驗設(shè)計：在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇有顯著影響的4個因素，以酸棗果肉可溶性物提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，對酸棗果肉超聲法提取工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗優(yōu)化。

1.2.3 酶解法提取工藝的優(yōu)化

(1) 酶配比對提取率的影響：固定酶解溫度50 ℃，加酶量2.1%，酶解時間1.5 h。分別在酶配比方式為水(A)、果膠酶(B)、纖維素酶(C)、果膠酶∶纖維素酶=1∶1(D)、果膠酶∶纖維素酶=1∶2(E)、果膠酶∶纖維素酶=2∶1(F)時提取酸棗果肉，考察不同酶配比對酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(2) 液料比對提取率的影響：固定酶解溫度50 ℃，酶解時間1 h，加酶量1.5%。分別在液料比為5∶1，7∶1，9∶1，11∶1，13∶1 (mL/g) 時提取酸棗果肉，考察液料比對酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(3) 酶解溫度對提取率的影響：固定液料比7∶1 (mL/g)，酶解時間1 h，加酶量1.5%。分別在酶解溫度為40，45，50，55，60 ℃時提取酸棗果肉，考察酶解溫度對酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(4) 酶解時間對提取率的影響：固定液料比7∶1 (mL/g)，酶解溫度50 ℃，加酶量1.5%。分別在酶解時間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h時提取酸棗果肉，考察酶解時間對酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(5) 加酶量對提取率的影響：固定液料比7∶1 (mL/g)，酶解溫度50 ℃，酶解時間1 h。分別在加酶量為0.9%，1.5%，2.1%，2.7%，3.3% 時提取酸棗果肉，考察加酶量對酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(6) 響應(yīng)面試驗設(shè)計：在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇有顯著影響的4個因素，以酸棗果肉可溶性物提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，對酸棗果肉酶解法提取工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗優(yōu)化。

1.2.4 超聲輔助酶解法提取工藝的優(yōu)化

(1) 液料比對提取率的影響：固定酶解溫度和超聲溫度均為50 ℃、加酶量1.5%、酶解時間1 h、超聲時間30 min、超聲功率120 W。分別在液料比為7∶1，9∶1，11∶1，13∶1，15∶1 (mL/g) 時提取酸棗果肉，考察液料比對酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(2) 加酶量對提取率的影響：固定酶解溫度和超聲溫度均為50 ℃，液料比9∶1 (mL/g)，酶解時間1 h，超聲時間30 min，超聲功率120 W。分別在加酶量為0.9%，1.5%，2.1%，2.7%，3.3%時提取酸棗果肉，考察液料比對酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(3) 酶解時間對提取率的影響：固定酶解溫度和超聲溫度均為50 ℃，液料比9∶1 (mL/g)，加酶量1.5%，超聲時間30 min，超聲功率120 W。分別在酶解時間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h時提取酸棗果肉，考察酶解時間對酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(4) 超聲時間對提取率的影響：固定酶解溫度和超聲溫度均為50 ℃，液料比9∶1 (mL/g)，加酶量1.5%，酶解時間1 h，超聲功率120 W。分別在超聲時間為10，20，30，40，50 min時提取酸棗果肉，考察超聲時間對酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(5) 超聲功率對提取率的影響：固定酶解溫度和超聲溫度均為50 ℃，液料比9∶1 (mL/g)，加酶量1.5%，酶解時間1 h，超聲時間30 min。分別在超聲功率為100，120，140，160，180 W時提取酸棗果肉，考察超聲功率對酸棗果肉可溶性物提取率的影響。

(6) 響應(yīng)面試驗設(shè)計：在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇有顯著影響的4個因素，以酸棗果肉可溶性物提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，對酸棗果肉提取工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗優(yōu)化。

1.2.5 可溶性物提取率的測定 酸棗果肉提取后，離心(8 000 r/min，8 min)，得澄清酸棗汁，利用PAL-1型折光儀測定可溶性固性物含量，并按式(1)計算可溶性物質(zhì)提取率。

(1)

式中：

c——可溶性物質(zhì)提取率，%；

s——棗汁中的可溶性固性物含量，%；

m——酸棗汁質(zhì)量，g；

M——酸棗果肉質(zhì)量，g。

1.2.6 總酚含量的測定 采用福林酚法[18]，以沒食子酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(曲線方程為y=0.002x+0.076，R2=0.999 0)，按式(2)計算總酚含量。

(2)

式中：

R1——酸棗汁中總酚含量，mg/g；

C——待測液總酚質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——澄清酸棗汁體積，mL；

當(dāng)然，以上未列出的山西杰出學(xué)者尚多，僅清代就有孫嘉淦及徐潤第、徐繼畬父子等人。 而從三晉學(xué)術(shù)史或中國學(xué)術(shù)史的角度來看，以上所列學(xué)術(shù)團(tuán)體及重要學(xué)人，皆對當(dāng)時及后世的學(xué)術(shù)產(chǎn)生過一定的影響，其中皆有本省學(xué)者與外地名宦、寓賢交流互動的痕跡。

Y——可溶性固形物含量，%。

1.2.7 總糖含量的測定 采用苯酚硫酸法[19]，以葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(曲線方程為y=0.003 2x+0.151 9，R2=0.995 7)，按式(3)計算總糖含量。

(3)

式中：

R2——酸棗汁中總糖含量，mg/g；

C——待測液總糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——澄清酸棗汁體積，mL；

Y——可溶性固形物含量，%。

1.2.8 體外氧化活性測定 取3種方法所制備澄清酸棗汁，測定可溶性固形物含量，將酸棗汁稀釋至濃度為6 mg/mL，進(jìn)行體外抗氧化試驗。分別測定其ABTS清除活性[20]、DPPH清除活性[21]以及羥自由基清除活性[22]。清除能力以每克可溶性固形物的VC微摩爾當(dāng)量表示(μmol VC/g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復(fù)3次，采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，利用Prism軟件、SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行繪圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲法提取工藝優(yōu)化

如圖1所示，最佳超聲時間為40 min，最佳超聲功率為140 W，最佳超聲溫度為70 ℃，最佳液料比為11∶1(mL/g)。因此，確定超聲法響應(yīng)面優(yōu)化試驗的因素及水平取值見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

采用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，建立提取工藝的二次多項回歸方程：

Y=66.41-0.025A+0.47B+0.37C+1.61D-0.53AB+0.37AC-0.43AD-1.18BC+0.12BD-2.50CD-1.46A2-1.10B2-1.07C2-2.34D2。

(4)

由表3可知，B、C、D均對酸棗水溶性物質(zhì)提取率具有顯著影響，各因素的影響大小為D>B>C>A。該模型具有極顯著性(P<0.01)，失擬項P值不顯著(P>0.05)，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.969 1，表明該模型擬合程度好，試驗誤差較小，該模型可用于預(yù)測試驗結(jié)果。最佳條件為超聲時間36 min，超聲功率155 W，超聲溫度60 ℃，液料比13∶1 (mL/g)，按此條件進(jìn)行驗證實驗，酸棗可溶性物質(zhì)提取率為67.37%，與預(yù)測值(67.63%)相比，誤差較小，能較好反映出各因素與酸棗可溶性物質(zhì)提取率之間關(guān)系。

表1 超聲法Box-Behnken試驗因素和水平表

圖1 超聲法各單因素對酸棗可溶性物質(zhì)提取率的影響

Figure 1 Effect of single factor on the extraction rate of sour jujube juice by ultrasonic method

表2 超聲法響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

2.2 酶解法提取工藝優(yōu)化

如圖2所示，最佳酶配比為果膠酶與纖維素酶1∶2，最佳液料比為9∶1 (mg/mL)，最佳加酶量為2.1%，最佳酶解時間為1.5 h，最佳酶解溫度為50 ℃。果膠酶和纖維素酶可以使酸棗細(xì)胞壁中的果膠和纖維素水解[23-24]組織結(jié)構(gòu)松散，溶解出更多的可溶性物，從而提高提取率[25]。而且試驗發(fā)現(xiàn)，膠酶∶纖維素酶為1∶2時酸棗可溶性物質(zhì)提取率顯著高于其他試驗組。因此，酶解法和超聲輔助酶解法均選擇果膠酶∶纖維素酶為1∶2。確定酶解法響應(yīng)面優(yōu)化試驗的因素及水平取值見表4，試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，建立提取工藝的二次多項回歸方程：

Y=69.91+1.48A+0.94B-0.17C+0.24D+0.010AB+0.100AC-0.63AD+0.67BC-0.31BD-0.37CD-3.00A2-0.85B2-1.58C2-0.52D2。

(5)

表3 超聲法方差分析結(jié)果?

? *表示有顯著差異(P<0.05)；**表示有非常顯著差異(P<0.01)；***表示有極顯著差異(P<0.001)。

*. 顯著差異(P<0.05) **. 非常顯著差異(P<0.01) ***. 極顯著差異(P<0.001)

表4 酶解法Box-Behnken試驗因素和水平表

由表6可知，A、B對酸棗可溶性物質(zhì)提取率具有顯著影響，各因素的影響大小為A>B>D>C。該模型具有極顯著性(P<0.01)，失擬項P值不顯著(P>0.05)，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.968 3，表明該模型擬合程度好，試驗誤差較小，該模型可用于預(yù)測試驗結(jié)果。最佳條件為液料比11∶1 (mL/g)，酶解溫度47 ℃，酶解時間1.6 h，加酶量2.5%，按此條件進(jìn)行驗證實驗，酸棗可溶性物質(zhì)提取率為69.47%，與預(yù)測值(69.38%)相比，誤差較小，能較好反映出各因素與酸棗可溶性物質(zhì)提取率之間關(guān)系。

2.3 超聲輔助酶解法提取工藝優(yōu)化

如圖3所示，最佳液料比為13∶1 (mL/g)，最佳酶解時間為1 h，最佳超聲時間為30 min，最佳超聲功率為140 W，最佳加酶量為2.1%。由于加酶量對提取率的影響變化較小，固定加酶量為2.1%。因此，確定超聲法響應(yīng)面優(yōu)化試驗的因素及水平取值見表7，試驗設(shè)計及結(jié)果見表8。

采用Design-Expert 8.0.6 軟件對表8中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，建立提取工藝的二次多項回歸方程：

表5 酶解法響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

表6 酶解法方差分析結(jié)果?

? *表示有顯著差異(P<0.05)；**表示有非常顯著差異(P<0.01)；***表示有極顯著差異(P<0.001)。

表7超聲輔助酶解法Box-Behnken試驗因素和水平表

Table 7 Box-Behnken test factors and level tables by ultrasound-assisted enzymatic extraction method

編號A 液料比(mL/g)B 酶解時間/hC 超聲時間/minD 超聲功率/W-111︰10.520120013︰11.030140115︰11.540160

Y=74.62+0.37A+0.76B+0.016C+0.39D+0.092AB-0.36AC+0.049AD-0.64BC-0.39BD+0.099CD-1.20A2-0.62B2-1.39C2-0.26D2。

(6)

由表9可知，A、B、D均對酸棗可溶性物質(zhì)提取率影響顯著，各因素的影響大小為B>D>A>C。該模型具有極顯著性(P<0.01)，失擬項P值不顯著(P>0.05)，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.965 8，表明該模型擬合程度好，試驗誤差較小，該模型可用于預(yù)測試驗結(jié)果。最佳條件為液料比13∶1 (mL/g)，加酶量2.1%，酶解時間1.2 h，超聲時間29 min，超聲功率146 W，按此條件進(jìn)行驗證實驗，酸棗可溶性物質(zhì)提取率為74.82%，與預(yù)測值(74.49%)相比，誤差較小，能較好反映出各因素與酸棗可溶性物質(zhì)提取率之間關(guān)系。

目前已報道酸棗汁提取方法主要為酶解法。毛麗衡[3]和杜琨[26]均采用果膠酶對酸棗進(jìn)行提取，提取率分別為66.10%和67.23%。試驗中3種方法的提取率(67.74%，69.38%，74.49%)均高于已報道酸棗提取率，與超聲法和酶解法相比，超聲輔助酶解法提取率明顯提高，表明超聲輔助酶解法是一種更加高效、方便的提取方法。

表8超聲輔助酶解法響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

Table 8 Response surface design and results by ultrasound-assisted enzymatic extraction method

序號ABCD提取率/%1-1-10071.8721-10072.233-110073.014110073.73500-1-172.436001-172.66700-1172.898001173.529-100-172.4710100-173.2711-100172.9312100173.92130-1-1071.341401-1073.93150-11072.5516011072.5717-10-1071.501810-1072.9919-101071.9620101072.02210-10-171.9022010-174.61230-10173.8224010174.9825000074.6526000074.8027000074.42

圖3 超聲輔助酶解法各單因素對酸棗可溶性物質(zhì)提取率的影響

表9 超聲輔助酶解法方差分析結(jié)果?

? *表示有顯著差異(P<0.05)；**表示有非常顯著差異(P<0.01)；***表示有極顯著差異(P<0.001)。

2.4 不同方法提取物總酚、總糖含量的比較

如表10所示，不同提取方法對酸棗汁中的總酚含量無顯著影響，而對總糖含量影響顯著；與超聲法和酶解法相比，超聲輔助酶解法可以顯著提高酸棗汁中總糖含量。

2.5 酸棗汁抗氧化活性

如圖4所示，3種方法提取的酸棗汁表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。與超聲法相比，酶解法可以顯著提高酸棗汁清除羥自由基和DPPH自由基的能力，超聲輔助酶解法顯著提高酸棗汁清除ABTS自由基、羥自由基以及DPPH自由基的能力；超聲輔助酶法酸棗汁DPPH自由基清除能力強于酶法(P<0.05)。由以上可知，超聲輔助酶解法提取的酸棗汁抗氧化能力要優(yōu)于其他兩種方法，不同抗氧化能力可能與酸棗汁中總糖含量的差異有關(guān)。

表10 酸棗汁中總酚和總糖含量測定?

? 同列字母不同代表差異顯著(P<0.05)。

字母不同代表差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

通過單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化超聲法、酶解法及超聲輔助酶解法提取酸棗汁的工藝條件。結(jié)果表明，3種方法的酸棗水溶物提取率均優(yōu)于已報道文獻(xiàn)[3,26]的，其中超聲輔助酶解法的提取效果最佳。酸棗汁具有明顯的抗氧化能力，與其總酚、總糖含量密不可分，并且不同方法提取的酸棗汁抗氧化能力具有顯著差異，可能與總糖含量的差異有關(guān)。與超聲法和酶解法相比，超聲輔助酶解法不僅可以有效提高酸棗可溶物提取率和總糖含量，還可以顯著提高其抗氧化能力，因此超聲輔助酶解提取可以作為一種高效的酸棗汁提取方法。后續(xù)將進(jìn)行體內(nèi)試驗以進(jìn)一步驗證不同方法提取酸棗汁的抗氧化能力。