任夏萌，李欣怡，丁群英

（西安文理學院生物與環(huán)境工程學院，陜西西安710000）

鐵線蓮是一類藤本植物，屬于毛茛科（Ranunculaceae）鐵線蓮屬（Clematis L.），其耐寒耐旱，并具有較高的觀賞價值和藥用價值[1]。鐵線蓮屬植物廣泛分布于除南極洲外的6 個大洲。據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界約有355 種鐵線蓮屬植物，我國因國土面積較大而占比較大，約有147 種，大多數(shù)種類分布于中部和西南部[2]。在陜西秦嶺、巴山、喬山以及陜北等林區(qū)，皆發(fā)現(xiàn)過鐵線蓮屬植物，平均海拔為400～3 500 m。鐵線蓮屬植物只有少數(shù)是直立灌木或草本植物，大多都是多年生木質或草質藤本植物[3]，其品種繁多，花型和花色皆豐富多彩，且開花期長，被譽為“攀援植物皇后”。在日本和西方國家的很多公園和家庭花園里，都能見到鐵線蓮屬植物[4]。此外，該屬植物在民間常被中醫(yī)用作藥物來利尿通淋、祛風止痛，具有明顯的藥用價值[5]。由于鐵線蓮屬植物存在較大的市場效益，因此，越來越多的人開始研究鐵線蓮屬植物。

遺傳標記（Genetic Marker）是指可追蹤染色體、染色體某一些節(jié)段、某個基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。生物體任何可遺傳的基因突變導致的表型差異都可以作為遺傳標記[6]。遺傳標記有5 種類型，包括形態(tài)學標記（Morphological Marker）、細胞學標記（Cytological Marker）、生物化學標記（Biochemical Marker）、免疫學標記（Immune Genetic Markers）以及分子標記（Molecular Marker）[7]。根據(jù)現(xiàn)有資料，發(fā)現(xiàn)遺傳標記可用來分析鐵線蓮屬植物的親緣種屬的相關性以及遺傳變異多樣性等問題[8]。

和文志等[9]對鐵線蓮屬植物的遺傳標記研究現(xiàn)狀進行了總結，結果發(fā)現(xiàn)，除了生物化學標記，其余類型的標記在鐵線蓮屬植物中均有相關研究，其中，分子標記因其不受外界影響、容易操作等優(yōu)點，得到了廣泛的應用。目前，對于其分子標記的研究，大部分都基于PCR 技術，如SSR 標記、RAPD 標記、RFLP 標記、AFLP 標記、ISSR 標記等。劉慶超等[10]對我國鐵線蓮屬植物分子生物學方面的研究進行了系統(tǒng)介紹，指出我國目前已有的相關研究。普春霞等[11]利用RAPD 技術對12 種云南鐵線蓮屬植物進行了RAPD 分析；孫正海等[12]對滑葉藤進行了ISSRPCR 體系的建立及其優(yōu)化；張倩[13]對大葉鐵線蓮的化學成分進行了研究；劉慧杰等[14]對毛茛科分子系統(tǒng)發(fā)育進行了研究；和文志等[15]對基于ISSR 標記的鐵線蓮園藝品種進行了遺傳多樣性分析和指紋圖譜構建。鐵線蓮ISSR 技術研究起步較晚，國內外有關鐵線蓮ISSR-PCR 體系優(yōu)化的報道較少，這在極大程度上制約了鐵線蓮遺傳分析、種質資源鑒定等研究的深入[16]，因此，建立適合鐵線蓮的ISSRPCR 擴增體系至關重要。

ISSR（Inter-simple Sequence Repeat）分子標記技術是由加拿大蒙特利爾大學的ZIETKIEWICZ 等[17]于1994 年提出的，是一種基于SSR（Simple Sequence Repeat）發(fā)展起來的新型分子標記，其具有操作簡單、快速、高效等優(yōu)點，同時無需知道任何靶序列的SSR 背景信息，大大降低了操作難度和試驗成本。由于其眾多優(yōu)點，因此越來越多被用于種質資源鑒定、親緣關系分析以及分子育種等研究。

本研究以秦嶺野生大葉鐵線蓮為試驗材料，在單因素試驗的基礎上進行L9（34）正交試驗，優(yōu)化模板DNA、Taq 酶、Mg2+和dNTPs 等影響因素，從而優(yōu)化大葉鐵線蓮ISSR-PCR 反應體系，旨在為鐵線蓮遺傳多樣性研究、親緣關系研究以及遺傳資源保護等工作提供數(shù)據(jù)基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為秦嶺大葉鐵線蓮，種植于西安文理學院生命與環(huán)境工程學院試驗田。采取其幼嫩葉片，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 的提取及檢測 根據(jù)植物基因組DNA提取試劑盒說明書，提取大葉鐵線蓮基因組DNA。隨后以ddH2O 為空白對照，用NanoDrop 2000C 超微量分光光度計檢測所提取的DNA 純度（DNA 純度＝OD260/OD280），并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA 是否可用于后續(xù)反應[18]。

1.2.2 引物的篩選 試驗所選引物為西安某生物公司的合成產(chǎn)品，同時參照加拿大哥倫比亞大學（UBC）所公布的引物。用合適量程的移液槍分別吸取12.5 μL 的2×Es Taq Master Mix PCR 反應液、2 μL DNA 模板、2 μL 引物（表1），加入到PCR 管中，并進一步用ddH2O 補足25 μL，共13 組反應。PCR 反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，退火（溫度取決于引物Tm 值）1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR反應結束后，吸取10 μL 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，于5 V/cm 的電場中電泳40 min 后，再在紫外透射儀下觀察結果，并記錄。

表1 引物名稱、序列及Tm 值

1.2.3 ISSR-PCR 反應單因素試驗 試驗選用引物11，選取4 個影響因素：Taq 酶濃度、模板DNA 濃度、dNTPs 濃度、Mg2+濃度，各設定5 個濃度梯度，以單因素優(yōu)化法進行4 組試驗（表2），PCR 擴增后產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，隨后使用紫外透射儀觀察擴增效果，選出最優(yōu)條件。PCR 反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，47 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。

表2 大葉鐵線蓮ISSR-PCR 單因素試驗水平

1.2.4 ISSR-PCR 反應正交試驗 根據(jù)單因素試驗結果，對PCR 反應體系中的模板DNA 濃度、dNTPs濃度、Taq 酶濃度，Mg2+濃度各設定3 個梯度，設計四因素三水平的正交試驗（表3），PCR 擴增后產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用臺式紫外透射儀觀察擴增效果。PCR 反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，47 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。

表3 大葉鐵線蓮ISSR-PCR 正交試驗

2 結果與分析

2.1 DNA 的制備

選擇生長狀態(tài)良好、幼嫩的葉片為材料，在提取時能夠獲得合適的基因組DNA，得到的大葉鐵線蓮基因組DNA 電泳圖譜如圖1 所示。從瓊脂糖凝膠電泳的結果來看，條帶清晰，背景明亮，所提取的基因組DNA 質量較好，無RNA 和蛋白質污染，基本滿足ISSR-PCR 反應條件。通過NanoDrop 2000C 超微量分光光度計的檢測，提取的基因組DNA 濃度為20 ng/μL，OD260/OD280值為1.65，達到了ISSR-PCR 反應的基本條件。

2.2 引物的篩選

引物共有13 條，其擴增后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2 所示，發(fā)現(xiàn)11 號引物條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，條帶數(shù)量足夠，可以用于后續(xù)反應。

2.3 ISSR-PCR 反應體系優(yōu)化

2.3.1 基因組DNA 濃度對ISSR-PCR 反應體系的影響 模板濃度過低時，條帶易于變得模糊；模板濃度過高時，條帶背景亮度較大。擴增后瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖3 所示，5 種基因組DNA 加入量分別為20，40，60，80，100 ng。由圖3 可知，當基因組DNA 加入量大時背景亮度增大，但差距不明顯，從經(jīng)濟角度考慮選擇40 ng 為最優(yōu)條件。

2.3.2 Taq 酶濃度對ISSR-PCR 反應體系的影響Taq DNA 聚合酶用量過少則會引起擴增量不足，過多會導致非特異性產(chǎn)物增加。擴增后瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖4 所示，在5 個濃度梯度中，2 U 濃度時背景清晰，所以選擇2 U 為最優(yōu)條件。

2.3.3 dNTPs 濃度對ISSR-PCR 反應體系的影響dNTPs 是擴增反應的原料，參與新鏈DNA 的合成，它只有在一個最優(yōu)值時反應才有最大效率，否則會抑制產(chǎn)物的形成。擴增后瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖5 所示，共有0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mmol/L 等5 組濃度梯度。由圖5 可知，dNTPs 加入量大時背景亮度增大，但差距不明顯，從經(jīng)濟角度考慮選擇0.2 mmol/L 為最優(yōu)條件。

2.3.4 Mg2+濃度對ISSR-PCR 反應體系的影響Mg2+作為Taq DNA 聚合酶的催化劑，顯著影響著酶的活性，進而直接影響PCR 結果，過高的Mg2+濃度會降低反應的特異性，而過低的Mg2+濃度會影響PCR產(chǎn)量，甚至導致PCR 擴增失敗。擴增后瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖6 所示，共有1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mmol/L等5 組濃度梯度，當濃度為3.0 mmol/L 時擴增效果最好，所以選擇3.0 mmol/L 為最優(yōu)條件。

2.3.5 ISSR-PCR 反應正交試驗 基于單因素試驗基礎，設計四因素三水平的正交試驗（表3），試驗結果如圖7 所示。根據(jù)所擴增條帶的強弱、清晰度、重復性等進行1～9 分計分，最佳組合記為9 分，最差組合記為1 分。9 個處理的評分結果依次為1，6，1，8，5，2，6，9，3，按照參考文獻[19]進行計算，獲得的最佳反應體系為處理8。

由表4 可知，處理8 的模板DNA 含量為40 ng，Mg2+濃度為3.0 mmol/L，dNTPs 濃度為0.2 mmol/L，Taq DNA 聚合濃度為2 U。

表4 ISSR-PCR 最佳反應體系

3 結論與討論

DNA 樣品的質量與濃度對后續(xù)ISSR-PCR 反應的結果有著直接的影響，DNA 樣品的質量與濃度對后續(xù)ISSR-PCR 反應的結果有著直接的影響。高質量的基因組DNA 有助于更好更快地優(yōu)化ISSR-PCR 反應體系，因此，在提取時應選擇生長良好及幼嫩的大葉鐵線蓮葉片為提取材料，采摘后應迅速放入-20 ℃冰箱中保存（防止基因組DNA 降解，同時為后續(xù)提取工作做好準備）。其次，采用康為世紀公司的植物基因組DNA 提取試劑盒（Plant Genomic DNA Kit）提取基因組DNA，其優(yōu)點有：采用先進的硅膠膜技術和簡單的離心程序，無需乙醇沉淀，適合于簡單快速地分離得到高純度DNA。需要注意的是，在提取時需加入少量β- 巰基乙醇，防止DNA 褐化，且操作過程應在通風櫥進行。本研究表明，提取過程結束后，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測，提取的基因組DNA 在質量和濃度上均符合要求，提取的基因組DNA 中RNA 和蛋白質較少，測得OD260/OD280值為1.65，表明DNA 樣品無蛋白質和RNA 污染，符合后續(xù)PCR 反應要求。

在ISSR-PCR 反應中，引物的作用是起始DNA復制，因為Taq DNA 聚合酶沒有起始復制的功能只有延伸的功能，所以需要一段引物來與DNA 模板結合起始復制。當引物濃度太低時，不易與模板DNA 結合，不產(chǎn)生擴增產(chǎn)物或者擴增產(chǎn)物較少；當濃度太高時，很容易引起非特異性擴增或堿基錯配，并且引物之間還可能形成二聚體或多聚體[20]。本試驗共有13 條引物可供選擇，將13 條引物分別進行PCR 反應（25 μL 體系中加入12.5 μL 的2×Es Taq Master Mix PCR 反應預混液，2 μL 引物，2 μL DNA 模板，再用ddH2O 補足25 μL），PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，然后根據(jù)電泳圖譜選擇一條引物用于后續(xù)反應，其中11 號引物產(chǎn)生的條帶清晰，背景明亮，最終選擇了11 號引物用于后續(xù)的ISSRPCR 反應體系優(yōu)化。

在PCR 反應體系中，參與反應的物質有Taq DNA 聚合酶、模板DNA、4 種dNTPs、引物和Mg2+。本試驗選擇了Mg2+、模板DNA、dNTPs、Taq DNA 聚合酶4 種物質的濃度進行優(yōu)化。模板DNA 作為直接參加反應的物質對PCR 的影響就是底物對于反應的影響，模板濃度過低時，會導致產(chǎn)物穩(wěn)定性下降，且條帶易于變得模糊；模板濃度過高時，可能會有雜質混入反應體系，容易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，所以選擇適中的濃度進行ISSR 分析。

dNTPs 的主要功能是在PCR 的延伸步驟中，以堿基互補原則，在Taq 聚合酶的作用下連接待擴增的模板，從而達到復制模板的目的。dNTPs 作為反應的底物，參與新鏈DNA 的合成，只有在一個最優(yōu)值時，反應才有最大效率，否則會抑制產(chǎn)物形成。

在一定濃度下，Taq 聚合酶濃度越高反應速率越快，相同時間產(chǎn)生的產(chǎn)物也就越多，但是當濃度達到一定值時，酶濃度不再影響反應速率。所以從經(jīng)濟角度考慮，在相同擴增效果下選擇較低的Taq聚合酶濃度。

本試驗通過單因素優(yōu)化法和正交試驗對Mg2+，模板DNA、dNTPs、Taq DNA 聚合酶4 種物質的濃度進行篩選，最終確定適合于大葉鐵線蓮ISSR-PCR反應的體系為：在25 μL 反應體系中，最佳體系為1.0 μL 模板DNA、2.0 μL Mg2+、2.0 μL dNTPs、1.0 μL引 物 以 及0.2 μL Taq DNA 聚 合 酶 和18.8 μL ddH2O。PCR 反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，47 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。使用該體系進行ISSR-PCR 反應，擴增后均可出現(xiàn)清晰條帶，結果為今后的研究提供了保障。