潘教文，李臻，王慶國，管延安，李小波, ，戴紹軍，丁國華，劉煒,3

NaCl處理谷子萌發(fā)期種子的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

潘教文1，李臻1，王慶國1，管延安2,3，李小波1, 4，戴紹軍5，丁國華4，劉煒1,3

（1山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心/山東省作物遺傳改良與生理生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100；2山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/山東省特色作物工程實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100；3山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250014；4哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150025；5上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200234）

【】谷子具有抗旱、耐貧瘠的特性，逐漸成為研究禾本科作物的模式作物。本研究以前期篩選并獲得的谷子耐鹽品種和敏感品種為材料，通過RNA-Seq測(cè)序篩選鑒定谷子的鹽脅迫響應(yīng)基因，揭示其響應(yīng)鹽害機(jī)制，為培育谷子抗鹽新種質(zhì)提供理論依據(jù)。對(duì)14個(gè)谷子品種進(jìn)行了萌發(fā)期抗鹽篩選。谷子不同品種的種子經(jīng)150 mmol·L-1NaCl處理萌發(fā)培養(yǎng)7 d后，分別統(tǒng)計(jì)各品種種子的萌發(fā)率、根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)，綜合各項(xiàng)指標(biāo)鑒定到豫谷2為耐鹽品種、安04為鹽敏感品種。以這兩個(gè)品種鹽脅迫前、后萌發(fā)期種子為材料，應(yīng)用RNA-Seq進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)定，分析鑒定鹽害下差異表達(dá)基因（differentially expression gene，DEG），并對(duì)DEG進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析。同時(shí)應(yīng)用qRT-PCR對(duì)隨機(jī)挑選的15個(gè)DEG表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證，并與RNA-Seq結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。耐鹽品種豫谷2、鹽敏感品種安04種子經(jīng)鹽脅迫處理后，分別鑒定出2 786個(gè)和4 413個(gè)DEG；其中，每個(gè)品種在NaCl處理前及處理后分別鑒定出1 470和3 826個(gè)DEG。GO和KEGG聚類分析顯示，NaCl處理下參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗氧化、有機(jī)酸的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)以及次生代謝等相關(guān)的DEG在谷子萌發(fā)期種子應(yīng)對(duì)鹽脅迫響應(yīng)過程中具有關(guān)鍵性的作用，DEG主要集中在脅迫響應(yīng)、離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原、次生代謝及有機(jī)酸、多胺、苯丙烷的合成等過程。qRT-PCR對(duì)15個(gè)DEG表達(dá)模式的檢測(cè)結(jié)果與RNA-seq結(jié)果相關(guān)系數(shù)為0.8817。其中編碼離子通道的基因（）、過氧化物酶基因（）、黃烷酮-3-羥化酶基因（）、MYB轉(zhuǎn)錄因子基因等在豫谷2中表達(dá)量較高，顯示其在谷子萌發(fā)期種子響應(yīng)鹽脅迫中可能發(fā)揮一定作用。谷子耐鹽品種及鹽敏感品種的種子對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)程度具有一定的差異性，且品種對(duì)鹽害的耐受能力主要與基因?qū)γ{迫的響應(yīng)程度相關(guān)，而與DEG的數(shù)量相關(guān)性不大。

谷子；鹽脅迫；萌發(fā)期種子；轉(zhuǎn)錄組；分子機(jī)制

0 引言

【研究意義】鹽漬是灌溉農(nóng)業(yè)面臨的嚴(yán)峻問題，嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的地理分布和產(chǎn)量。在世界范圍內(nèi)，大約有800×106萬hm2的土地受到鹽漬的影響，而且每年增長(zhǎng)率為1%—2%。鹽害可使植物產(chǎn)生滲透脅迫，進(jìn)一步導(dǎo)致離子毒害，影響種子萌發(fā)、植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成、光合作用，并產(chǎn)生次生傷害，造成物質(zhì)代謝紊亂及過氧化物的積累，嚴(yán)重影響了作物的產(chǎn)量及品質(zhì)[1-4]。谷子（L. Beauv.）又稱為粟，去皮后俗稱小米，是起源于中國的傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)作物，也是糧飼兼用作物。其具有抗旱、耐瘠薄、C4高光效、生育期短，適應(yīng)性廣等突出優(yōu)勢(shì)[5-6]。不僅在目前旱作生態(tài)農(nóng)業(yè)中有重要作用，在國民經(jīng)濟(jì)中也具有重要地位。因此，以谷子為材料，鑒定抗鹽基因及其功能，研究基因作用機(jī)制，對(duì)作物的遺傳改良和抗鹽品種的培育具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】為了有效地應(yīng)對(duì)鹽脅迫，植物在進(jìn)化過程中形成了一系列參與感知滲透脅迫和離子毒害的機(jī)制。其中K+離子通道（high-affinity K+channel，HKT）、非選擇性陽離子通道（nonselective cation channel，NSCC）等[7]及胞內(nèi)第二信使Ca2+在植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫過程中具有重要作用。部分鈣結(jié)合蛋白、激酶及轉(zhuǎn)錄因子等，也參與了脅迫信號(hào)的感知及傳遞[8]。已知谷子對(duì)鹽堿有一定的耐受性，研究表明在0.3%鹽堿以下的土壤，谷子可以較好地生長(zhǎng)發(fā)育[9]。近年來，隨著谷子基因組測(cè)序的完成，谷子被認(rèn)為是研究禾本科作物新的模式作物。在基因組水平上，各種不同的基因家族，以及干旱響應(yīng)基因、蛋白及非編碼RNA等都被鑒定出來[10-14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】谷子抗旱性研究開展的較早，部分研究成果已應(yīng)用到作物育種過程，并取得了較好的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。例如，通過對(duì)谷子耐旱品種豫谷1和敏感品種安04轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，結(jié)合干旱相關(guān)的QTL，鑒定到20個(gè)谷子耐旱的關(guān)鍵基因[13]。通過miRNA測(cè)序結(jié)合降解組學(xué)分析，12個(gè)已知的miRNA家族及其56個(gè)靶基因被鑒定到，同時(shí)，9個(gè)新的miRNAs及其26個(gè)靶基因也被鑒定到[12]。利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析也鑒定到一系列的參與谷子干旱響應(yīng)的蛋白[14]。谷子抗鹽研究起步較晚，其對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)及抗鹽機(jī)制仍有待深入挖掘?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)不同谷子品種在萌發(fā)期進(jìn)行耐鹽篩選，初步獲得鹽敏感品種安04和耐鹽品種豫谷2。本研究以NaCl處理前后這兩個(gè)品種為材料，利用RNA-seq進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)合數(shù)據(jù)分析及歸納，進(jìn)而揭示谷子的耐鹽機(jī)制。為解析谷子的抗鹽機(jī)制及培育谷子抗鹽品種提供理論依據(jù)和基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和處理方法

谷子品種濟(jì)谷11、濟(jì)谷12、濟(jì)谷14、濟(jì)谷15、濟(jì)8431、魯谷1號(hào)、魯谷2號(hào)、魯谷6號(hào)、魯谷8號(hào)、豫谷2、豫谷11、豫谷14均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所管延安老師課題組饋贈(zèng)，豫谷1和安04由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所刁現(xiàn)民老師課題組饋贈(zèng)。谷子的種子經(jīng)10%的次氯酸鈉消毒后，于含有兩層濾紙的9 cm的無菌培養(yǎng)皿中萌發(fā)，分別用滅菌的ddH2O和150 mmol·L-1的NaCl處理，每個(gè)培養(yǎng)皿放100粒種子，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。種子在光照培養(yǎng)箱（白天14 h 30℃/黑暗10 h 25℃）中培養(yǎng)7 d后，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率、根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)。之后將去掉胚根及胚芽的萌發(fā)期種子經(jīng)液氮速凍，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA文庫的構(gòu)建和測(cè)序

萌發(fā)期種子總RNA用試劑盒（Total RNA Isolation Kit (China)）提取。具體步驟參照說明書。用RNA Nano 6000 Assay Kit of Bioanalyzer 2100 system （Agilent Technologies, CA, USA）檢測(cè)RNA的完整性。分別取3 μg的RNA，用試劑盒（NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina （NEB, USA））構(gòu)建文庫。通過Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA尾的mRNA，隨后在NEB Fragmentation Buffer中用二價(jià)陽離子將得到的mRNA隨機(jī)打斷。以片段化的mRNA為模板，隨機(jī)寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA第一條鏈，隨后用RNaseH降解RNA鏈，并在DNA polymeraseⅠ體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，用AMPure XP beads篩選200 bp左右的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，每個(gè)樣品3次重復(fù)，最終獲得文庫。

構(gòu)建完成的文庫經(jīng)Qubit2.0 Fluorometer進(jìn)行初步定量，隨后使用Agilent 2100 bioanalyzer進(jìn)行檢測(cè)，并用qRT-PCR對(duì)文庫有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

構(gòu)建成功的文庫經(jīng)Illumina測(cè)序，產(chǎn)生150 bp配對(duì)末端讀數(shù)。經(jīng)對(duì)原始數(shù)據(jù)過濾，獲得高質(zhì)量及可靠的數(shù)據(jù)。從基因組網(wǎng)站下載參考基因組和基因模型注釋文件，使用Hisat2 v2.0.5構(gòu)建參考基因組的索引，并使用Hisat2 v2.0.5將配對(duì)末端過濾后的數(shù)據(jù)（clean reads）與參考基因組比對(duì)。根據(jù)基因的長(zhǎng)度和比對(duì)到該基因的次數(shù)來估算每個(gè)基因的FPKM值。

利用DESeq2 R package（1.16.1）進(jìn)行比較組合之間的差異表達(dá)分析（每組3次生物學(xué)重復(fù)）。使用Benjamini&Hochberg方法調(diào)整＜0.05，結(jié)合閾值（|Log2fold change|≥1）篩選每個(gè)比對(duì)組合的DEG。

通過clusterProfiler R軟件實(shí)現(xiàn)DEG的GO富集分析，其中修正了基因的長(zhǎng)度偏差，考慮具有小于0.05校正值的GO通過DEG顯著富集。也利用clusterProfiler RKEGG軟件分析KEGG通路中DEG的系統(tǒng)富集情況。具體參考已報(bào)道的信息及相關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因的富集分析[13-17]。

1.3 qRT-PCR分析

隨機(jī)選取15個(gè)DEG，對(duì)它們?cè)贜aCl脅迫下豫谷2和安04中的表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證。以作為內(nèi)參，基因特異引物見電子附表1。利用構(gòu)建文庫的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用FastStart Universal SYBR Green (Roche) Master為熒光染料，進(jìn)行qRT-PCR分析，反應(yīng)體系為20 μl，SYBR Green Master 10 μl上游引物1 μl，下游引物1 μl，ddH2o反應(yīng)條件為95℃ 10 min；95℃ 10 s，56℃ 20 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)處理參考Zhang等[18]方法，利用Pearson’s correlation coefficient（PCC）計(jì)算2組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 NaCl處理豫谷2和安04萌發(fā)期種子的轉(zhuǎn)錄組分析

以150 mmol·L-1NaCl對(duì)14個(gè)谷子品種的耐鹽性進(jìn)行篩選。表型觀察結(jié)合根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)和萌發(fā)率分析，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫處理7 d后，安04種子的相對(duì)萌發(fā)率、根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)分別約為對(duì)照的20%、30%和31%，而豫谷2種子的相對(duì)萌發(fā)率、根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)是對(duì)照的60%、70%和51%（圖1）。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，初步鑒定豫谷2為耐鹽品種，安04為鹽敏感品種（圖2-A）。

利用RNA-seq技術(shù)，對(duì)豫谷2及安04進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。將鹽處理前后豫谷2樣品分別命名為YG2CKS和YG2NTS，將鹽處理前后安04的樣品分別命名為An04CKS和An04NTS。結(jié)果顯示，豫谷2鹽處理前后（YG2NTS vs YG2CKS）共鑒定到DEG為2 786個(gè)，其中上調(diào)基因有1 410個(gè)，下調(diào)基因有1 376個(gè)（電子附表2）。安04鹽處理前后（An04NTS vs An04CKS）共鑒定到DEG為4 413個(gè)，其中上調(diào)基因2 241個(gè)，下調(diào)基因2 172個(gè)（電子附表3）。未經(jīng)鹽處理的2個(gè)品種間（YG2CKS vs An04CKS）有DEG為1 470個(gè)，其中上調(diào)基因540個(gè)，下調(diào)基因930個(gè)（電子附表4）。鹽處理后2個(gè)品種間（YG2NTS vs An04NTS）共有DEG為3 826個(gè)，其中上調(diào)基因1 521個(gè)，下調(diào)基因2 305個(gè)（圖2-B）（電子附表5）。韋恩圖分析顯示，鹽脅迫處理后豫谷2和安04中共同的DEG為1 278個(gè)（圖2-C），鹽脅迫處理前后豫谷2和安04 2個(gè)品種間存在882個(gè)共有DEG（圖2-C）。

2.2 部分DEG表達(dá)模式的qRT-PCR分析

qRT-PCR結(jié)果顯示，15個(gè)隨機(jī)挑取的DEG在NaCl處理后的安04和豫谷2中的表達(dá)模式，除存在差異，其他基因變化趨勢(shì)基本與RNA-seq結(jié)果一致，結(jié)果間相關(guān)系數(shù)為0.8817，具有很好的相關(guān)性。表明RNA-Seq結(jié)果準(zhǔn)確、可信。

圖1 經(jīng)150 mmol·L-1 NaCl處理14個(gè)谷子品種種子的相對(duì)萌發(fā)率（A）、相對(duì)根長(zhǎng)（B）和相對(duì)芽長(zhǎng)（C）分析

A：150 mmol·L-1 NaCl處理7 d后豫谷2和安04幼苗的表型；B：不同比較組合的DEG統(tǒng)計(jì)；C：不同比較組合DEG韋恩圖

R值代表RNA-seq和qRT-PCR結(jié)果的相關(guān)系數(shù) R value indicates the correlation coefficient between data of RNA-seq and qRT-PCR

2.3 DEG功能富集分析

通過對(duì)不同比較組鑒定到的DEG進(jìn)行GO和KEGG代謝途徑富集分析。GO富集分析主要分為生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)亞類。DEG主要富集在代謝、細(xì)胞學(xué)過程、生物調(diào)節(jié)和刺激響應(yīng)等生物學(xué)過程；DEG主要富集在細(xì)胞、細(xì)胞膜和細(xì)胞器等細(xì)胞組分中；DEG主要具有催化、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)的功能（圖4）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫后豫谷2（YG2NTS vs YG2CKS）上調(diào)的DEG主要富集在幾丁質(zhì)代謝（GO：0006030）、細(xì)胞壁大分子代謝（GO：0044036）、氧化還原（GO：0055114）、多胺代謝（GO：0006595）等過程（電子附表6）。而鹽脅迫后安04上調(diào)的DEG主要富集在脂肪酸代謝（GO：0006631）、氧化還原（GO：0055114）、有機(jī)酸代謝（GO：0006082）等過程（電子附表7）。鹽處理后豫谷2下調(diào)的DEG主要富集在跨膜運(yùn)輸（GO：0055085）、生物學(xué)過程（GO：0008150）、和激素響應(yīng)（GO：0009725）等過程（電子附表6），而安04下調(diào)的DEG主要富集在蛋白磷酸化（GO：0006468）、初級(jí)代謝（GO：0044238)和跨膜運(yùn)輸（GO：0055085）等（電子附表7）。鑒于2個(gè)品種間的比較能較直接的反應(yīng)不同品種之間的差異，故對(duì)未處理的豫谷2和安04的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較（YG2CKS vs An04CKS），結(jié)果顯示，相對(duì)于安04，豫谷2中的基因主要參與各種物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程，如氨基酸跨膜運(yùn)輸（GO：0003333）、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（GO：0098656）、有機(jī)酸跨膜運(yùn)輸（GO：1903825）、和戊糖代謝（GO：0019321）等過程。而安04中的DEG主要富集在細(xì)胞碳水化合物生物合成（GO：0034637）（電子附表8）。而鹽處理后不同品種間DEG可體現(xiàn)品種對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的差異，對(duì)比顯示（YG2NTS vs An04NTS），鹽脅迫下豫谷2中上調(diào)的DEG主要富集在幾丁質(zhì)代謝（GO：0006030）、脅迫響應(yīng)（GO：0080134）、離子轉(zhuǎn)運(yùn)（GO：0006811）和有機(jī)酸生物合成（GO：0016053）（電子附表9）。

KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫后，豫谷2和安04上調(diào)DEG主要富集在精氨酸及脯氨酸代謝、次生代謝物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉及糖代謝等途徑，顯示以上途徑可能參與鹽脅迫響應(yīng)（圖5、電子附表10和電子附表11）。而下調(diào)的DEG主要富集在類苯基丙烷合成、甘油磷脂代謝、氨基酸合成等代謝途徑（電子附表10和電子附表11）。品種間的比較顯示，鹽脅迫處理前（YG2CKS vs An04CKS），即豫谷2中主要富集次生代謝物合成途徑，顯示該品種本身次生代謝物的合成及含量應(yīng)高于安04；而鹽處理后，各品種上調(diào)的DEG顯示不同品種對(duì)鹽脅迫響應(yīng)情況的不同，其中豫谷2中參與次生代謝、谷胱甘肽代謝及類苯基丙烷合成等途徑的DEG明顯多于安04，顯示這些途徑可能參與鹽害響應(yīng)，并對(duì)豫谷2抗鹽性的形成具有一定作用（電子附表12和電子附表13）。

2.4 部分關(guān)鍵DEG分析

對(duì)2個(gè)谷子品種鹽處理前（YG2CKS vs An04CKS）后（YG2NTS vs An04NTS）DEG分析發(fā)現(xiàn)，其主要富集在脅迫相關(guān)的GO注釋和KEGG途徑，可能對(duì)谷子抗鹽響應(yīng)及豫谷2品種抗鹽性的形成具有重要作用。

鹽脅迫處理后有3個(gè)編碼鈣結(jié)合蛋白基因（calcium- binding protein，，Seita.3G039700、Seita.8G176000和Seita.4G251700）及3個(gè)編碼蛋白激酶（CBL-interacting protein kinase，，Seita.3G380200、Seita.9G411700和Seita.8G171900）基因在豫谷2中表達(dá)量升高（電子附表14）。編碼信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的類受體蛋白激酶（receptor-like serine/threonine-protein kinase，）基因和促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinase，）基因也在豫谷2中具有較高的表達(dá)量。顯示豫谷2對(duì)脅迫信號(hào)響應(yīng)更為迅速。同時(shí)，編碼離子通道的基因如（potassium transporter、Seita.7G082300和Seita. 5G439500）和（cation transporter，Seita.5G192900和Seita.5G024400）在豫谷2中也表現(xiàn)出明顯的鹽誘導(dǎo)表達(dá)模式（電子附表14）。

鹽脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧ROS的積累，過量ROS的清除對(duì)于植物脅迫抗性非常重要。比對(duì)發(fā)現(xiàn)，編碼活性氧清除酶類和抗氧化蛋白相關(guān)的基因如、和硫氧還蛋白基因的表達(dá)在豫谷2中高于安04。同時(shí)，抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（AsA-GSH）的組分，如和的表達(dá)在鹽脅迫后的豫谷2中也有著較高的表達(dá)量（電子附表14），顯示豫谷2具有強(qiáng)于安04的ROS清除能力。

鹽脅迫抑制植物的生長(zhǎng)主要通過抑制部分代謝過程及合成一系列具有保護(hù)作用的蛋白質(zhì)和次生代謝物[1]。其中編碼多胺合成途徑的催化蛋白基因如：精胺合酶（spermine synthase）、多胺氧化酶（polyamine oxidase）、S-腺苷蛋氨酸脫羧酶（S-adenosylmethionine decarboxylase）以及氨基酸合成酶基因如：谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，）和脯氨酸合成酶（delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthase，）在鹽脅迫后的2個(gè)品種中的表達(dá)都明顯上調(diào)。參與蘋果酸代謝的蘋果酸合酶（malate synthase，Seita.7G144600）在安04中表達(dá)上調(diào)，而蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，Seita.3G137700和Seita.6G251800）在豫谷2中表達(dá)上調(diào)（電子附表13），對(duì)蘋果酸的積累具有促進(jìn)作用。類黃酮是植物體內(nèi)普遍存在的次生代謝物，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)過程中起著重要的作用[19]。有5個(gè)參與類黃酮代謝的基因在鹽脅迫后豫谷2中的表達(dá)明顯高于安04，特別是麥黃酮合酶（tricin synthase）和黃烷酮加氧酶（flavanone 3-dioxygenase）基因，在未經(jīng)鹽處理的豫谷2中表達(dá)就明顯高于安04（電子附表13）。有12個(gè)編碼P450的DEGs在YG2NTS vs An04NTS中表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)有5個(gè)P450基因在2個(gè)品種中的表達(dá)都受到鹽脅迫誘導(dǎo)。3-酮酰輔酶A合成酶（3-ketoacyl-CoA synthase，KCS）是長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，有9個(gè)編碼的基因在安04中表達(dá)明顯上調(diào)，且鹽脅迫前后這些基因的表達(dá)均明顯高于豫谷2。β-葡萄糖苷酶可以水解纖維素并釋放游離的葡萄糖和相應(yīng)配基，為胚芽生長(zhǎng)提供碳源。21個(gè)編碼β-葡萄糖苷酶在安04中表達(dá)明顯上調(diào)，其中有5個(gè)基因（Seita.1G033600、Seita.9G528700、Seita.4G134400、Seita.9G279900和Seita.1G335300）在鹽脅迫處理前后的安04中的表達(dá)都高于豫谷2（電子附表14），顯示安04具有較高的基礎(chǔ)代謝水平。

圖4 DEG的GO分析

圖5 鹽脅迫處理后豫谷2和安04上調(diào)DEG KEGG富集分析前20個(gè)代謝途徑的散點(diǎn)圖

病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related family proteins，PR）是一類高度保守的蛋白家族，主要參與植物抗病反應(yīng)，在非生物脅迫響應(yīng)過程中也起著重要的作用[20]。8個(gè)PR基因在鹽脅迫處理前后的豫谷2中表達(dá)都高于安04，5個(gè)編碼內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（endochitinase A，）基因在鹽脅迫后2個(gè)品種中的表達(dá)都明顯上調(diào)，且在鹽脅迫后豫谷2中的表達(dá)明顯高于安04。同時(shí)8個(gè)胚胎晚期發(fā)育蛋白基因（late embryogenesis abundant protein，）、6個(gè)非特異脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（non-specific lipid transfer protein，）和2個(gè)滲調(diào)蛋白（osmotin）的表達(dá)在2個(gè)品種中都明顯上調(diào)（電子附表14）。

赤霉素（gibberellin，GA）是植物體內(nèi)重要的激素，在打破種子休眠，種子萌發(fā)及各個(gè)生命階段都發(fā)揮重要的作用。植物可通過赤霉素減少的方式使生長(zhǎng)減緩從而適應(yīng)外界環(huán)境[21]。GA2氧化酶（gibberellin 2-beta-dioxygenase，GA2ox）是GA降解過程的關(guān)鍵酶，2個(gè)編碼GA2ox的基因（Seita.4G015700和Seita.5G147400）分別在安04和豫谷2中上調(diào)表達(dá)。GA20氧化酶（gibberellin 20 oxidase，GA20ox）是GA合成途徑最后一步的關(guān)鍵酶，鹽處理下2個(gè)品種中編碼GA20ox 的基因（Seita.5G404900）的表達(dá)均上調(diào)，但在豫谷2中上調(diào)幅度明顯低于安04（電子附表14）。參與細(xì)胞分裂素的合成的基因（adenylate isopentenyltransferase 3，Seita.J000400）鹽脅迫后在安04中的表達(dá)明顯下調(diào)，但在豫谷2中下調(diào)并不明顯。4個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的表達(dá)在脅迫后豫谷2中的表達(dá)高于脅迫后安04中的表達(dá)（電子附表14）。顯示在鹽脅迫后耐鹽品種還能合成一定水平的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素來維持谷子的生長(zhǎng)發(fā)育。

鹽脅迫下，一系列差異響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子在豫谷2和安04中被鑒定出來。5個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子在NaCl脅迫后表達(dá)上調(diào)，而這些基因的表達(dá)卻在安04中被抑制。其他脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，如3個(gè)bHLH、5個(gè)NAC和12個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在NaCl處理后的豫谷2中的表達(dá)明顯高于脅迫后的安04（電子附表14）。顯示NaCl脅迫下脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在耐鹽品種豫谷2中的響應(yīng)與敏感品種安04相比更為強(qiáng)烈。

3 討論

鹽漬作為主要的非生物脅迫嚴(yán)重威脅了作物產(chǎn)量和糧食安全，利用現(xiàn)代的各種分子生物學(xué)技術(shù)闡明作物的耐鹽機(jī)制，對(duì)篩選抗鹽品種，培育耐鹽新種質(zhì)具有重要意義。對(duì)多種作物耐鹽性的研究已有一定報(bào)道。研究表明，植物在不同的發(fā)育期對(duì)鹽脅迫的抗性及敏感程度不同。種子萌發(fā)期被認(rèn)為是植物生活周期中最重要和最脆弱的階段，在棉花、水稻、甜菜和番茄中研究表明，種子的萌發(fā)期和幼苗期是植物的鹽敏感期，也是進(jìn)行植物耐鹽性篩選的關(guān)鍵期[22-23]。鑒于圍繞谷子鹽害響應(yīng)的研究較少，本研究對(duì)14個(gè)谷子品種萌發(fā)期種子耐鹽性進(jìn)行了篩選，鑒定到耐鹽品種豫谷2和鹽敏感品種安04，并對(duì)這兩個(gè)品種在萌發(fā)期的種子進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。本研究對(duì)于谷子耐鹽品種的篩選提供了鑒定依據(jù)，也為下一步揭示谷子的耐鹽機(jī)制提供了重要線索，為指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

3.1 不同品種間差異表達(dá)基因影響并決定品種的特性

作物或品種自身特性在影響其對(duì)外界的響應(yīng)中具有決定作用。已知鹽芥（）作為擬南芥的一個(gè)近緣屬，屬于鹽生植物，極端耐鹽[24]。在正常生長(zhǎng)條件下，鹽芥與擬南芥間就存在較多的差異基因，雖然在鹽處理后鹽芥與擬南芥中都會(huì)有不同的脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)發(fā)生改變并參與鹽害響應(yīng)，但脅迫響應(yīng)基因的數(shù)量較少[24-25]，綜上顯示不同材料之間基因的差異在決定材料間不同特性中發(fā)揮決定性作用。本研究中，對(duì)鹽處理前后豫谷2及安04中的DEG的GO和KEGG分析，顯示正常生長(zhǎng)的豫谷2中參與各種物質(zhì)（如氨基酸，離子，有機(jī)酸等）跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和次生代謝的基因的表達(dá)高于安04。經(jīng)鹽脅迫處理后（YG2NTS vs An04NTS），豫谷2中上調(diào)表達(dá)的基因也主要富集在脅迫響應(yīng)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、次生代謝、谷胱甘肽代謝、苯丙烷合成等途徑，說明豫谷2中具有一定數(shù)量的脅迫誘導(dǎo)基因，且其在鹽害下的表達(dá)高于安04，表現(xiàn)為脅迫下豫谷2中相應(yīng)物質(zhì)的積累更為明顯，其在豫谷2抗鹽特性中具有一定的作用。鑒于品種間DEG數(shù)量較多，多于脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)的基因數(shù)量，結(jié)合品種特性的不同，故品種自身的基因在影響并決定品種特性中具有重要作用。

3.2 有機(jī)酸參與谷子耐鹽性的形成

部分脅迫誘導(dǎo)基因在谷子抗脅迫品質(zhì)的形成中發(fā)揮作用。有機(jī)酸在植物初級(jí)代謝中起著重要的作用，如三羧酸循環(huán)，主要包括蘋果酸，檸檬酸和延胡索酸等。這些物質(zhì)在能量產(chǎn)生、氨基酸的合成、pH的調(diào)節(jié)、響應(yīng)生物和非生物脅迫過程中起著關(guān)鍵作用[26]。本研究顯示，未經(jīng)處理的品種間，抗鹽品種豫谷2 中特有的基因主要富集在有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)的生物過程，經(jīng)鹽處理后（YG2NTS vs An04NTS），豫谷2中上調(diào)的基因同樣富集在有機(jī)酸的生物合成途徑中，蘋果酸合酶和蘋果酸脫氫酶都受到鹽脅迫的誘導(dǎo)。顯示有機(jī)酸的迅速合成和轉(zhuǎn)運(yùn)將有助于豫谷2鹽脅迫抗性的提高。

3.3 PR基因的高表達(dá)調(diào)控谷子的耐鹽性

PR蛋白主要參與植物的抗病反應(yīng)，過表達(dá)PR蛋白基因能增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗性，其在適應(yīng)非生物脅迫中也有多重作用[20]。煙草中過表達(dá)PR1蛋白能提高其對(duì)重金屬的耐性[20]。水稻中過表達(dá)不但可增強(qiáng)植物對(duì)稻瘟病的抗性，而且還可增強(qiáng)其對(duì)鹽漬和干旱脅迫的抗性[20]。幾丁質(zhì)酶作為PR蛋白，在煙草中過表達(dá)哈茨木霉（）誘導(dǎo)的幾丁質(zhì)酶能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因材料對(duì)生物脅迫和非生物脅迫（鹽漬和重金屬）的耐性[27]。冬黑麥冷脅迫誘導(dǎo)的和編碼具有抗凍活性的幾丁質(zhì)酶，其在大腸桿菌中表達(dá)可提高受體菌株的抗凍性[28]。本研究中，顯示8個(gè)PR蛋白和5個(gè)幾丁質(zhì)酶基因在豫谷2中高表達(dá)，綜合基因特性，推測(cè)以上DEG可參與谷子抗鹽特性的形成。

3.4 其他

谷子抗鹽性的形成還需要多種物質(zhì)及過程的協(xié)同作用。其中細(xì)胞色素P450屬于單加氧酶超家族，具有廣泛的催化活性，可參與各種生物合成及降解途徑[29-30]。而植物激素如赤霉素激素，其含量的減少可使植物生長(zhǎng)減緩從而適應(yīng)外界環(huán)境[21]。本研究中，鑒定到多個(gè)P450基因的表達(dá)變化，部分赤霉素降解途徑及合成途徑中關(guān)鍵酶也發(fā)生了變化。同時(shí)部分介導(dǎo)植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)也都發(fā)生了改變[31]，最終影響了鹽害下谷子不同品種的抗鹽能力。

3.5 谷子萌發(fā)期種子對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)

本研究通過對(duì)鹽脅迫下谷子抗性的篩選，獲得了一個(gè)耐鹽品種豫谷2和敏感品種安04，初步明確了谷子萌發(fā)期種子對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的作用途徑及機(jī)制。鹽脅迫誘導(dǎo)谷子胞內(nèi)鈣離子濃度的提高，進(jìn)而其作為第二信使啟動(dòng)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控下游基因表達(dá)，通過合成、積累一系列的保護(hù)性蛋白，如LEA蛋白、PR蛋白、活性氧清除酶類等從而提高谷子的脅迫抗性。同時(shí)脅迫下部分初級(jí)代謝物（如有機(jī)酸，各種氨基酸等）和次生代謝物（如類黃酮，不飽和脂肪酸，多胺等）的積累還可保護(hù)細(xì)胞免受滲透脅迫及離子毒害，進(jìn)而提高植物抗性（圖6）。耐鹽品種豫谷2與敏感品種安04相比，能迅速的感知鹽脅迫信號(hào)并向下游傳遞，通過對(duì)不同轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行表達(dá)調(diào)控影響下游脅迫響應(yīng)基因如、、和活性氧清除酶等基因的表達(dá)；有機(jī)酸、類黃酮類等代謝物的迅速合成及積累都有助于增強(qiáng)豫谷2的耐鹽性。該方面工作為下一步篩選谷子抗鹽品種、改良和培育谷子抗鹽新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

豫谷2在萌發(fā)期的耐鹽性明顯高于安04。豫谷2中離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化、次生代謝、有機(jī)酸的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)基因的表達(dá)明顯高于安04，這些基因的差異表達(dá)導(dǎo)致了2個(gè)品種的耐鹽性差異。

圖6 谷子萌發(fā)期種子鹽脅迫響應(yīng)的模式圖

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Transcriptomics Analysis of NaCl Response in Foxtail Millet (L.)seeds at germination stage

PAN JiaoWen1, LI Zhen1, WANG QingGuo1, Guan YanAn2, 3, LI XiaoBo1,4, DAI ShaoJun5, DING GuoHua4, LIU Wei1, 3

(1Biotechnology Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Ecology and Physiology, Jinan 250100;2Crop Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong engineering laboratory for featured crops, Jinan 250100;3College of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014;4School of Life Sciences and Technology, Harbin Normal University, Harbin 150025;5College of Life and Environmental Sciences, Shanghai Normal University/Development Center of Plant Germplasm Resources, Shanghai 200234)

Foxtail millet (L.) remarkably adapts to adverse ecologies, including drought, barren regions and high soil salinity. These characteristics promote it as a very promising model crop for exploring basic biology processes of plants. Unveil of mechanisms of foxtail millet under salinity is of immense significance.In this research, 14 millet varieties at germination stage were used for resistance screening under 150 mmol·L-1NaCl. The germination rate, root and bud length of each variety were measured after been treated for 7 d, and the salt tolerance variety Yugu 2 and salt susceptible variety An 04 were obtained. These two varieties before and after salt treatment were used for transcriptomes analysis by RNA-seq sequencing. The functional and pathway enrichments of differentially expressed genes (DEGs) were also performed by GO and KEGG analysis. Fifteen DEGs were randomly selected for further qRT-PCR analysis to verify the RNA-seq data.Totally 2 786 and 4 413DEGs were identified in Yugu 2 and An 04, and there were 1 470 and 3 826 DEGs within each cultivar before and after salt treatment, respectively. GO and KEGG enrichment analysis suggested that DEGs were mainly clustered into signaling, antioxidant system, organic acid biosynthesis and transport, and secondary metabolism, and the DEGs participated in response to stress, iontransmembrane transport, redox homeostasis, secondary metabolism, organic acid, polyamine and phenylpropanoid biosynthetic process. The qRT-PCR results showed high correlation coefficient of 0.8817 with the data of RNA-seq. Especially the genes such as cation transporter (), peroxidase (), flavanone 3-dioxygenase () and MYB transcription factors, which displayed higher vary degrees in Yugu2 under salinity may play key roles in salt response process of foxtail millet.There was difference in the response degree of salt tolerance variety and salt sensitive variety of millet under salinity. Moreover, the resistance trait formation and function to salt was mainly depends on the response degree instead of the number of DEGs under stress.

foxtail millet (L.); salt stress; seeds of germination stage; transcriptomics; molecular mechanisms

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.22.003

2019-07-19；

2019-09-30

山東省自然科學(xué)基金青年基金（ZR2019QC003）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-06）、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大科技成果培育計(jì)劃（2015CGPY10）、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（CXGC2018E13）、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才計(jì)劃（2016-2018）

潘教文，E-mail：jwpan01@126.com。通信作者劉煒，E-mail：wheiliu@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）