楊艷紅，余 瑛，胡永強(qiáng)，唐 夢

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054)

芽孢桿菌屬是一類在自然界分布廣泛的、非常安全的、具有抑菌和調(diào)節(jié)免疫功能的重要微生物[1]，作為益生菌的一種，其因具有抗逆性強(qiáng)、營養(yǎng)需求低、復(fù)活率高、繁殖能力強(qiáng)等特有的生物特性而備受關(guān)注。

研究表明：芽孢桿菌益生菌胞外不僅能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，抑制腸道病原菌生長，還能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶等消化酶促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，因而能有效調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡且不會(huì)導(dǎo)致病原菌的耐藥性[2,3]。本文分離到1株芽孢桿菌AF1，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌[4]。初步研究發(fā)現(xiàn)，該菌株不僅能產(chǎn)生高活性酸性淀粉酶[4]和蛋白酶，還能產(chǎn)生抑制大腸桿菌、金葡菌、耐藥大腸桿菌和耐藥金葡菌等的抑菌活性物質(zhì)[5]。通過研究AF1對pH、豬膽鹽、人工腸液以及人工胃液的耐受性，發(fā)現(xiàn)其在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)均可生長，并且對豬膽鹽、人工胃液和人工腸液表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐受能力[6]。本文旨研究AF1對雛雞的安全、生長性能以及其對雛雞腸道菌群的影響，為AF1應(yīng)用于畜牧業(yè)提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

AF1，本實(shí)驗(yàn)室分離。

優(yōu)菌肽(含有乳酸菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母等十多種益生菌，用于調(diào)節(jié)畜禽腸胃的活菌劑)，購自安徽申慧農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

AF1生長培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，蔗糖3%，蛋白胨2.5%，尿素0.33%，NaCl 1%， pH 7.0。

伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(ZMB)：購自杭州微生物試劑有限公司。

SS瓊脂培養(yǎng)基：購自杭州百思生物技術(shù)有限公司。

Takara Minibest Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver3.0(Code No.9763)購自Takara(日本)。

RAPD PCR(含銀染，含40個(gè)10bp隨機(jī)引物)試劑盒(BTN101003)購自北京百奧萊博。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

1月齡體重相近的健康脫瘟土雞苗120羽。

1.4 試驗(yàn)方法

選取120只健康脫瘟土雞苗，隨機(jī)分成3組，每組40只(公母各20只)。第1組為空白對照組，飼喂基礎(chǔ)日糧；第2組為AF1益生菌組，飼喂基礎(chǔ)日糧+AF1菌(含菌量：2.0×107cfu·g-1)；第3組為優(yōu)菌肽組，飼喂基礎(chǔ)日糧+優(yōu)菌肽(含菌量：2.0×107cfu·g-1)。每天飼喂3次，保證足夠的飼料，常規(guī)飼養(yǎng)40 d。采用玉米-基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平參考我國現(xiàn)行肉用仔雞配合飼料標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5616—2008。

1.5 安全性指標(biāo)測定

每天觀察記錄雛雞的精神、食欲、行為、腹瀉情況和死亡率。試驗(yàn)組停止喂加菌飼料3 d后，試驗(yàn)結(jié)束，從各組隨機(jī)選取3只進(jìn)行剖殺，檢查記錄臟器，尤其是消化道病變情況。

1.6 生產(chǎn)性能測定

試驗(yàn)期間每天按試驗(yàn)組分別記錄飼料剩、給料量。試驗(yàn)開始時(shí)稱取各組雛雞質(zhì)量，作為始重，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱取各組雞的空腹質(zhì)量，作為末重。最后計(jì)算平均日采食量(ADFI)、日增體質(zhì)量(ADG)和料肉比(F/G)。

1.7 腸道病原菌測定

試驗(yàn)組停止喂加菌飼料3 d后，試驗(yàn)結(jié)束，從各組隨機(jī)選取3只雞進(jìn)行剖殺，用剪刀縱向剪開盲腸，用無菌生理鹽水沖去附在腸內(nèi)壁上的食糜，然后刮取適量盲腸內(nèi)壁物于定量無菌生理鹽水中進(jìn)行10倍梯度稀釋，最后把不同稀釋度樣品分別涂布于伊紅美藍(lán)瓊脂(ZMB)和SS瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，計(jì)算獲得每克樣品所含活菌數(shù)(結(jié)果以對數(shù)均值log10cfu/g內(nèi)容物表示)。

1.8 AF1對雛雞盲腸中微生物菌群的影響

盲腸取樣與菌增殖培養(yǎng)：AF1益生菌組停止飼喂加菌飼料3 d后，試驗(yàn)結(jié)束，從AF1益生菌組和空白對照組分別隨機(jī)選取3只雞進(jìn)行剖殺，用剪刀縱向剪開盲腸，用無菌生理鹽水沖去附在腸內(nèi)壁上的食糜，分別刮取適量盲腸內(nèi)壁物于AF1生長培養(yǎng)基中37 ℃，200 r/min培養(yǎng)20 h，然后12 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，收集菌體，作為每只雞的腸道菌群樣品，放置-80 ℃?zhèn)溆?。另接種純菌株AF1于生長培養(yǎng)基中37 ℃，200 r/min培養(yǎng)20 h，然后12 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，收集菌體放置-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

DNA提取：分別取上述收集的菌體，嚴(yán)格按照Takara Minibest Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver3.0(Code No.9763)操作說明進(jìn)行操作，獲得各樣品的總的DNA，放置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

AF1特異性引物篩選：從上述提取的DNA中隨機(jī)選取空白對照組1只雞的腸道菌群DNA以及純菌株AF1的DNA為模板，RAPD體系及反應(yīng)程序嚴(yán)格按照RAPD PCR(含銀染)試劑盒(BTN101003，北京百奧萊博)的說明，選取40條10 kb隨機(jī)引物(如表1)，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用5% PAGE凝膠電泳，然后分析電泳圖篩選出AF1菌株的特異性引物。

表1 RAPD 引物序列

特異性引物PCR擴(kuò)增：分別以上述所有樣品的DNA為模板，把上述篩選的AF1菌株的每個(gè)特異性引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用5% PAGE凝膠電泳，分析統(tǒng)計(jì)AF1益生菌組雞腸道菌的擴(kuò)增產(chǎn)物與AF1單菌株擴(kuò)增產(chǎn)物的相似度來確定AF1菌在雞腸道中的定植情況。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2007 進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用LSD法進(jìn)行組間多重比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 AF1對土雞的安全性能的影響

通過觀察記錄試驗(yàn)組與對照組飼養(yǎng)的雞的精神狀況、食欲、腹瀉情況、死亡情況以及解剖臟器病變情況來評估AF1菌株對雞的安全性能。由表2可知：AF1益生菌組的雞明顯比空白對照組和優(yōu)菌肽組的雞活躍，并且飼喂40 d后，AF1益生菌組沒有腹瀉雞和死亡的雞，存活率為100%，而空白組和優(yōu)菌肽組均出現(xiàn)腹瀉和死亡的雞。從平均日采食量可知：3組雞的食欲差異不顯著(P>0.05)。通過解剖臟器觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組和優(yōu)菌肽組各有1只雞的小腸出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)且盲腸偏小，而AF1益生菌組雞的脾臟和胸腺偏大，其他器官正常，說明飼喂AF1菌以后，雞的免疫力增強(qiáng)，生病率減少，存活率提高。

2.2 AF1對土雞生長性能的影響

平均日采食量、日增體質(zhì)量和料肉比等生長性能方面的指標(biāo)是飼料利用率、經(jīng)濟(jì)性和生物添加劑效果顯著與否的最直觀的表現(xiàn)。由表3 可知：對于平均日采食量，與空白對照組相比，AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組均沒有顯著差異(P>0.05)。對于平均日增體質(zhì)量，AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組顯著高于空白對照組(P<0.05)，而它們兩組之間差異不顯著(P>0.05)。對于料肉比，空白對照組顯著高于AF1益生菌組和優(yōu)肽組(P<0.05)，而AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組之間無顯著差異(P>0.05)。由此可見，AF1益生菌和購買的優(yōu)菌肽在飼喂土雞時(shí)可顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率，降低飼料成本。

表2 AF1對土雞的健康狀況影響

指標(biāo)空白對照組AF1益生菌組 優(yōu)菌肽組精神狀態(tài)++++食欲(平均日采食量)(ADFI,g·d-1)51.55±0.56a50.12±0.39a50.07±0.42a腹瀉數(shù)4無3死亡數(shù)3無2存活率/%92.510095解剖臟器觀察 1只小腸有紅色斑點(diǎn),盲腸偏小,其他器官正常2只脾臟和胸腺較大,其他器官正常 1只小腸有紅色斑點(diǎn),盲腸偏小,其他器官正常

注：“+”表示“一般”；“ ++”表示“較好”；數(shù)字右上側(cè)不同字母為差異顯著(P<0.05)；相同字母為差異不顯著(P>0.05)。

表3 AF1對土雞的生長性能的影響

注：數(shù)字右上側(cè)不同字母為差異顯著(P<0.05)，相同字母為差異不顯著(P>0.05)。

2.3 AF1對土雞腸道病原菌的影響

由表4可知：飼喂40 d后，AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組的大腸桿菌數(shù)明顯比空白對照組少，并且差異極顯著(P<0.01)。同時(shí)，在AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組的盲腸內(nèi)未檢出沙門氏菌，而空白對照組卻明顯檢出沙門氏菌?？梢?，AF1益生菌和優(yōu)菌肽都可以抑制腸道大腸桿菌和沙門氏菌的生長，尤其是對沙門氏菌效果更明顯，從而可以減少雞的腸道疾病發(fā)生。

表4 AF1對土雞腸道病原菌的影響

注：數(shù)字右上側(cè)不同大寫字母為差異極顯著(P<0.01)，相同大寫字母為差異不顯著(P>0.05)

2.4 AF1特異性引物篩選及PCR擴(kuò)增

從40個(gè)10 bp隨機(jī)引物中篩選出空白對照組雞腸道菌群擴(kuò)增條帶與純菌株AF1條帶相同率小于50%或者沒有相同條帶的引物6個(gè)即A3、A5、B1、B6、B7和B10，又從中挑選出3個(gè)重復(fù)性好、條帶清晰的引物為AF1的特異性引物即A3、A5和B6。然后用這3個(gè)引物，分別用所有AF1益生菌組腸道菌群、空白對照組腸道菌群和純菌株AF1的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1～3。

1-純菌株AF1；2,3,4-AF1益生菌組雞1,2,3；5,6,7-空白對照組雞1,2,3

1-純菌株AF1；2,3,4-AF1益生菌組雞1,2,3；5,6,7-空白對照組雞1,2,3

1-純菌株AF1；2,3,4-AF1益生菌組雞1,2,3；5,6,7-空白對照組雞1,2,3

按照PAGE凝膠電泳圖同一位置上DNA條帶的有無進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶(包括弱帶)記為“1”，無帶記為“0”，計(jì)算各組實(shí)驗(yàn)中每只雞腸道菌群的各個(gè)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶與純菌株AF1擴(kuò)增產(chǎn)物相同的條帶的百分比P，即P=(NXY/NX)×100%，NXY是純菌株AF1和雞腸道菌群的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中分子量大小相同的DNA條帶數(shù)，NX是純菌株AF1 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA條帶總數(shù)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)：對于引物A3(如圖1和表5)，純菌株AF1總共獲得20條擴(kuò)增條帶，AF1益生菌組3只雞分別有13、15和14個(gè)條帶與純菌株AF1相同，平均有70±5.0%的條帶與純菌株AF1相同，并且它們之間的相似度平均達(dá)到了90%以上，而空白組3只雞之間的條帶完全相同，它們的條帶僅有6個(gè)條帶與純菌株AF1相同，平均只有30.0±0.0%的條帶與純菌株AF1相同。對于引物A5(如圖2和表6)，純菌株AF1總共獲得25條擴(kuò)增條帶，AF1益生菌組3只雞分別有15、16和16個(gè)條帶與純菌株AF1相同，平均有63±2.3%的條帶與純菌株AF1相同，而空白組3只雞中除了第3只雞有少許條帶外，其余2只雞沒有擴(kuò)增出任何條帶。對于引物B6(如圖3和表7)，純菌株AF1總共獲得14條擴(kuò)增條帶，AF1益生菌組3只雞分別有7、11和10個(gè)條帶與純菌株AF1相同，平均有75.0±5.1%的條帶與純菌株AF1相同，而空白組3只雞都沒有擴(kuò)增出任何條帶。

表5 引物A3擴(kuò)增條帶比較

表6 引物A5擴(kuò)增條帶比較

表7 引物B6擴(kuò)增條帶比較

綜上，從3條特異性引物的PCR擴(kuò)增電泳圖譜都可以看出，AF1益生菌組的3只雞的條帶相似度都達(dá)到了90%以上，空白對照組的3只雞的帶譜也幾乎完全相同，并且2組之間的條帶存在極顯著差異。由此推斷，AF1飼喂以后，對雞的腸道菌群有極顯著的影響，并且飼喂AF1后的3只雞，用不同的特異性引物擴(kuò)增后，其條帶與純菌株AF1的擴(kuò)增條帶有60%以上相同，提示經(jīng)飼喂AF1菌以后，AF1菌株可能在雞的盲腸內(nèi)定植，需進(jìn)一步做實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

3 討論

解淀粉芽孢桿菌是芽孢桿菌屬中與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì)菌，在自然界中分布廣泛，易分離培養(yǎng)，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境；其代謝產(chǎn)物較為豐富，具有廣譜抗菌活性和較強(qiáng)的抗逆能力[7-8]。目前，對解淀粉芽孢桿菌研究主要集中在生防領(lǐng)域，用于植物病原真菌和細(xì)菌的防治[9-10]。

解淀粉芽孢桿菌除了可以產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等多種胞酶外，還可以產(chǎn)生大量穩(wěn)定性較強(qiáng)的低分子抗生素、抗菌多肽、抗菌脂肽和抗菌蛋白類抑菌物質(zhì)[8]。因此，把解淀粉芽孢桿菌用于動(dòng)物飼養(yǎng)，可以有多重功效，不僅可以利用多種酶系促進(jìn)飼料的消化和吸收，還可以利用抗菌物質(zhì)抑制腸道病原菌生長，同時(shí)利用其好氧性消化掉腸道氧氣，為腸道的大部分厭氧益生菌提供有益的厭氧環(huán)境，促進(jìn)腸道菌群的平衡和腸道健康。近年來，國內(nèi)外對其益生性能進(jìn)行了大量研究，在魚、母豬、肉雞的飼養(yǎng)中取得了不錯(cuò)的效果[8,11-14]。但是，解淀粉芽孢桿菌同樣由于其來源的不同，飼喂效果差異很大，有些甚至沒有任何效果[7,15]，再加上目前解淀粉芽孢桿菌作為益生菌飼喂動(dòng)物的研究還處于初始階段，進(jìn)一步篩選和研究新的解淀粉芽孢桿菌作為動(dòng)物益生菌是非常有必要的。

本文用于研究的解淀粉芽孢桿菌AF1不僅能產(chǎn)生高活性酸性淀粉酶[4]和蛋白酶，還能產(chǎn)生抑制大腸桿菌、金葡菌、耐藥大腸桿菌和耐藥金葡菌等的抑菌活性物質(zhì)[5]。并且AF1對酸堿、豬膽鹽、人工胃液和人工腸液表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐受能力[6]。本文研究表明：解淀粉芽孢桿菌AF1飼喂1月齡脫瘟土雞苗后，相對于空白組和優(yōu)菌肽組，AF1益生菌組無一只腹瀉雞，存活率為100%。AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組平均日增重顯著高于空白對照組(P<0.05)，而料重比顯著低于空白對照組(P<0.05)。AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組的盲腸內(nèi)大腸桿菌數(shù)明顯比空白對照組少(P<0.01)，且未檢出沙門氏菌。采用RAPD技術(shù)篩選AF1菌株的特異性引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，AF1益生菌組停止飼喂加菌飼料 3 d后，3只雞腸道菌群的DNA條帶相似度達(dá)到90%以上，與純菌株AF1的條帶有60%以上相同，空白對照組3只雞的帶譜也幾乎完全相同，但與純菌株AF1的條帶存在極顯著差異。由此可見，單菌株解淀粉芽孢桿菌AF1不僅能定植于雞腸道內(nèi)影響腸道菌群，抑制病原菌生長，減少疾病發(fā)生，提高雞存活率，還能顯著提高雞飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)雞的生長。近年來，隨著進(jìn)一步深入研究，其作為食品防腐劑、飼料添加劑和抗生素替代益生菌的應(yīng)用開發(fā)也不斷受到重視[11,16-20]。作為益生菌直接添加到動(dòng)物飼料中，除了無毒無害以外，必須還要具有以下功能：能定植動(dòng)物腸道，平衡腸道菌群，促進(jìn)腸道健康，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高飼料消化率和吸收率，從而促進(jìn)動(dòng)物生長，降低飼喂成本[11]。最常見的益生菌主要包括乳酸菌屬、酵母菌屬和產(chǎn)孢子的芽孢桿菌屬等[21]。但是由于來源和種屬不同，各種益生菌的應(yīng)用研究效果存在很大的差異，目前大部分益生菌產(chǎn)品都是以多種菌混合的復(fù)合制劑。而根據(jù)上述研究，單菌株解淀粉芽孢桿菌AF1作為益生菌飼喂雞，不僅可以定植雞的腸道，而且其飼喂效果達(dá)到市場購買的復(fù)合益生菌產(chǎn)品優(yōu)菌肽，甚至某些指標(biāo)更優(yōu)于優(yōu)菌肽。

可見，單菌株解淀粉芽孢桿菌AF1具有多功能的益生效果，作為動(dòng)物益生菌的開發(fā)，它不僅可以解決目前市場復(fù)合益生菌制劑在加工、運(yùn)輸及保存過程中容易失活以及在動(dòng)物腸道中不能有效定植等問題[22-23]，并且作為單菌株制劑進(jìn)行生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝方法更簡單、生產(chǎn)成本更低。

4 結(jié)論

1) 解淀粉芽孢桿菌AF1飼喂1月齡脫瘟土雞苗40 d，雞的存活率達(dá)到100%，比飼喂優(yōu)菌肽組的雞更好。

2) 通過對比AF1益生菌組、優(yōu)菌肽組和空白對照組3組雞的平均日采食量、日增體質(zhì)量和料肉比，雖然3組雞的平均日采食量之間差異不明顯，但是AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組平均的日增體質(zhì)量都顯著高于空白對照組(P<0.05)，而料肉比顯著低于空白對照組(P<0.05)，可見解淀粉芽孢桿菌AF1和優(yōu)菌肽一樣能顯著提高雞飼料轉(zhuǎn)化率，降低飼料成本。

3) 刮取雞盲腸內(nèi)壁物檢測病原菌，AF1益生菌組和優(yōu)菌肽組的盲腸內(nèi)大腸桿菌數(shù)明顯比空白對照組少(P<0.01)，且未檢出沙門氏菌，證明解淀粉芽孢桿菌AF1和優(yōu)菌肽一樣能抑制病原菌生長，減少疾病發(fā)生。

4) 采用RAPD技術(shù)篩選AF1菌株的特異性引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，AF1益生菌組3只雞腸道菌群的DNA條帶相似度達(dá)到90%以上，與純菌株AF1的條帶有60%以上相同，空白對照組3只雞的帶譜也幾乎完全相同，且2組之間的條帶存在極顯著差異，表明AF1菌在飼喂土雞時(shí)很有可能定植在雞腸道內(nèi)影響腸道菌群，發(fā)揮益生作用。