李東明，劉恒，朱蘭玉，方玲，吳華裕，潘尚領，林有坤，舒?zhèn)?/p>

(1廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，南寧530021；2廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院)

LMNA基因主要編碼LaminA/C蛋白與LaminB蛋白共同構(gòu)成細胞核膜內(nèi)層的網(wǎng)狀核纖層結(jié)構(gòu)，維持細胞核結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，參與對外界機械力的轉(zhuǎn)導，固定染色質(zhì)和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[1～3]。LaminA/C還存在細胞核質(zhì)中，對細胞增殖分化、染色質(zhì)重組和DNA復制具有調(diào)控功能。LMNA第527位氨基酸(LMNAR527)位于蛋白結(jié)構(gòu)域的表面，參與鹽橋的形成，精氨酸是堿性氨基酸，半胱氨酸是中性氨基酸。因此，R527C的取代會破壞蛋白質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)，對核纖層結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[4]。LMNAR527是引起核纖層蛋白病的熱點突變區(qū)域。LMNA基因突變導致十幾種退行性疾病的發(fā)生，包括Emery-Dreyfus肌營養(yǎng)不良、外周神經(jīng)病變、脂肪營養(yǎng)不良和兒童早老癥等[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，LMNAR527C基因突變會導致兒童早老癥，但在LMNAR527C基因突變導致的早老癥患者細胞中，并未發(fā)現(xiàn)有prelamin A的堆積和早老蛋白progerin的積累[7]。目前，LMNAR527C基因突變在衰老中的作用仍不清楚， LMNA基因突變與疾病的發(fā)生發(fā)展呈現(xiàn)復雜和多樣性，LMNA基因型與疾病表型的關系并不明確[8]。2016年9月～2019年3月，本研究通過構(gòu)建LMNAR527C突變基因小鼠模型，觀察了LMNAR527C基因突變純合型小鼠的表型特征及細胞衰老標志物的變化，以探討LMNAR527C基因突變對衰老的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞、試劑、儀器 品系為 C57BL/6的LMNA雜合突變小鼠來源于上海南方模式生物科技有限公司。293T細胞，LMNA 基因敲除的293T細胞由本實驗室保存；pEGFP-N1質(zhì)粒購自北京全式金公司；LaminA抗體購于英國Abcam公司；γH2Ax抗體購于英國Abcam；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(FBS，Gibco)；青霉素-鏈霉素(Hyclone公司)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；PDVF膜購于Millipore(Kenilworth公司)；EMD Millipore LμminataTMWestern HRP 化學反應發(fā)光液(WBLUR0500公司)；DAPI(Beyotime公司)；1%蛋白酶抑制劑(Thermoscientific公司)；RIPA(Thermoscientific公司)；細胞衰老相關β-半乳糖苷酶染色試劑盒(Beyotime公司)；Adobe Photoshop軟件(Adobe公司)，Image J 軟件(MD公司)

1.2 LMNAR527C基因突變純合型小鼠的獲得及表型觀察 LMNA雜合型小鼠南方模式動物中心構(gòu)建完成，構(gòu)建同源重組載體，利用胚胎細胞打靶技術(shù)通過顯微注射法轉(zhuǎn)入小鼠胚胎細胞中，將注射后的小鼠囊胚移植到假孕母鼠子宮內(nèi)，陽性F0通過與野生型小鼠交配獲得LMNA基因雜合子突變小鼠。LMNA雜合型小鼠引進后在SPF動物房飼養(yǎng)和雜交繁殖，公母鼠合籠后生出的小鼠F1代剪尾提DNA進行PCR測序，雌雄鼠合籠后出生的F1 代小鼠有三種基因型：野生型(基因型LMNAWT/WT)，雜合型(基因型LMNAWT/R527C)，純合型(基因型LMNAR527C/R527C)，將F1 代的純合型小鼠繼續(xù)公母鼠合籠，生出的F2 代全為純合型小鼠。選取LMNA野生型、LMNA雜合型、LMNAR527C型三種基因型小鼠各20只，雌雄各半，測量第4周到12周小鼠的體質(zhì)量和體長。小鼠雙耳連線的中點到尾體交接處代表體長，將放在籠子上面，當小鼠在抓緊籠子時，拉住它的尾巴使其自然伸直，然后進行測量。隨機選擇9籠小鼠，每籠一雌一雄，對其產(chǎn)的第二胎幼仔進行統(tǒng)計。同時選取三種基因型單一性別小鼠各20只，記錄生存周期。

1.3 LMNAR527C基因純合突變小鼠尾組織及腹部皮膚組織中γH2Ax蛋白檢測 ①采用Western blotting法。剪取純合型、雜合型、野生型小鼠尾巴，根據(jù)RIPA試劑說明書操作提取尾巴組織總蛋白，上樣25 μg總蛋白的裂解液于10% 的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，300 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜90 min使蛋白轉(zhuǎn)移至PDVF膜上。5% 脫脂牛奶覆蓋膜，搖床輕柔晃動1h封閉膜，加入適量抗體4 ℃搖床過夜，然后用含1% 吐溫20(Tween 20)的PBS清洗膜，加入辣根過氧化物酶-共軛二抗覆蓋住膜，搖床輕柔晃動1 h。EMD Millipore LμminataTMWestern HRP 化學反應發(fā)光液進行顯色反應。使用Adobe Photoshop軟件對蛋白條帶掃描，計算各蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值比值表示目的蛋白表達量。② 采用免疫組化法。取野生型、純合型小鼠腹部皮膚組織，皮膚標本冷凍切片，切片水化，然后放于微波爐煮沸后，放入0.01 mol/L pH 6.0的枸櫞酸鈉緩沖液中水浴20 min，進行抗原修復。根據(jù)SP試劑盒(9001，ZSGB-Bio)操作步驟進行試驗，最后二氨基聯(lián)苯胺底物試劑盒顯色，蘇木精復染，顯微鏡下觀察拍照。采用Image J 軟件分析統(tǒng)計圖片總細胞和陽性細胞數(shù)，結(jié)果以陽性細胞占總細胞百分比表示γH2Ax蛋白的表達。

1.4 LMNA敲除的293T 細胞LMNAR527C突變基因轉(zhuǎn)染及其γH2Ax蛋白、LaminA蛋白檢測 根據(jù)TRIzol試劑說明書操作提取野生型和LMNA基因突變型小鼠尾組織的總RNA ，使用oligo(dT)和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)PrimeSTAR?Max DNA Polymerase試劑說明書操作，使用LMNA基因特異引物(正向引物：5′GGTGAATTCAAATGGAGACCCCGTCACACG3′，反向引物：5′CTTGGTACCAACATGATACTGCAGTTCTGGG3′)，PCR擴增小鼠LMNA和LMNAR527C突變基因。利用分子克隆技術(shù)獲得小鼠pEGFP-N1-LMNA和pEGFP-N1-LMNA R527C重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染293T LMNA敲除細胞，轉(zhuǎn)染2 μg pEGFP-N1-LMNA R527C質(zhì)粒的細胞作為實驗組，轉(zhuǎn)染2 μg pEGFP-N1-LMNA質(zhì)粒的細胞作為對照組，轉(zhuǎn)染2 μg pEGFP-N1空質(zhì)粒的細胞作為空白組；采用Western blotting法檢測到實驗組及對照組中LaminA表達，提示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。各組細胞處理48 h后，收集細胞采用Western blotting法檢測γH2Ax蛋白。將293T細胞作為正常組，選取實驗組細胞采用細胞免疫熒光法檢測LaminA蛋白，熒光倒置顯微鏡觀察拍照，分析與正常組相比，實驗組LaminA蛋白的分布和定位。

1.5 LMNAR527C基因純合突變小鼠肺成纖維細胞β-半乳糖苷酶活性檢測 無菌操作取2～3周的純合型及野生型小鼠，處死后取肺葉置于PBS液中，PBS清洗2遍，剪碎肺葉組織，提取肺成纖維細胞。在六孔板中接種2×105/孔的小鼠肺成纖維細胞，根據(jù)細胞衰老相關β-半乳糖苷酶染色試劑盒(碧云天)說明書操作對細胞進行染色。顯微鏡下拍照，采用Image J 軟件分析，結(jié)果以β-半乳糖苷酶活性染色陽性細胞占總細胞百分比表示。

2 結(jié)果

2.1 不同LMNA基因型小鼠表型比較 三種基因型小鼠體質(zhì)量、體長比較，P均>0.05，詳見表1、2。野生型小鼠籠號1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12繁殖幼仔個數(shù)分別為6、5、7、6、5、7、5、4、6、6、5、7個，雜合型小鼠籠號1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12繁殖幼仔個數(shù)分別為5、6、7、5、7、4、5、8、5、5、6、7個，純合型小鼠籠號1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12繁殖幼仔個數(shù)分別為6、4、5、6、7、5、6、7、5、6、4、5個；三種基因型小鼠繁殖幼仔個數(shù)比較，P>0.05。三種基因型小鼠生存率比較，P>0.05(見圖1)。

表1 不同周齡、不同LMNA基因型小鼠體質(zhì)量

表2 不同周齡、不同LMNA基因型小鼠體長

圖1 雜合型、純合型和野生型小鼠生存率比較

2.2 LMNAR527C基因突變小鼠尾組織、皮膚組織及細胞中衰老相關蛋白的表達 ①不同基因型小鼠尾組織、腹部皮膚組織中γH2Ax蛋白水平比較： 設野生型小鼠尾組織γH2Ax蛋白相對表達量為1，純合突變型、雜合突變型小鼠尾組織γH2Ax蛋白相對表達量分別為2.40±0.043 2、1.72±0.035 3 ，純合突變型、雜合突變型小鼠高于野生型(P均<0.05)；野生型小鼠γH2Ax陽性細胞百分比為17%±1.68%，純合突變型小鼠γH2Ax陽性細胞百分比為38%±2.25% ，二者比較，P<0. 05。②各組LMNA敲除的293T 細胞中γH2Ax蛋白水平及 LaminA蛋白分布、定位：以空白組細胞中γH2Ax蛋白相對表達量為1，實驗組、對照組細胞γH2Ax蛋白相對表達量分別為2.72±0.233、2.9±0.035，對照組及實驗組高于空白組，P均<0. 05。實驗組細胞Lamin A蛋白發(fā)生聚集不連續(xù)，容易在核膜聚集，且部分蛋白從核纖層轉(zhuǎn)移至核內(nèi)(圖2)。③純合型、野生型小鼠肺成纖維細胞中β-半乳糖苷酶活性：純合型、野生型小鼠肺成纖維細胞中衰老相關β-半乳糖苷酶活性染色細胞陽性率分別為11.0%±1.96%、2.5%±0.78%，二者比較，P<0.05。

圖2 LaminA蛋白的分布及定位(400×)

3 討論

目前已經(jīng)建立了較多早老癥相關的小鼠模型，以研究LMNA基因突變導致早老癥產(chǎn)生的致病機制[9]。但LMNAR527C突變的小鼠模型未見報道，本研究通過購買LMNAR527C雜合型小鼠進行雜交的方式獲得LMNAR527C純合型小鼠。實驗中發(fā)現(xiàn)，在動物整體水平上，與LMNA野生型小鼠相比，LMNAR527C突變基因型小鼠在體型，體質(zhì)量，繁殖能力和生存期上差異無統(tǒng)計學意義，說明LMNAR527C純合型小鼠沒有出現(xiàn)兒童早老病的相關臨床表型，這可能是因為不同物種間存在差別，LMNAR527C突變基因在衰老中的作用還有待進一步研究。

Sullivan 和Kubben相繼在LMNA敲除的小鼠中發(fā)現(xiàn)，小鼠出生后出現(xiàn)嚴重的生長遲緩、肌營養(yǎng)不良和核異常，Lamin A 蛋白缺失使小鼠的組織分化和器官生成能力下降，出生后的小鼠存活期僅為3周[10]。此外，LMNA基因敲除小鼠的PPAPγ和CEBP/α蛋白水平升高，調(diào)控其下游基因Wnt-10b、β-catenin蛋白水平下降，從而影響脂肪、肌肉和骨骼的組織分化[11]。研究報道，LMNAM371K突變基因?qū)е滦∈蟪錾屎蛪勖鼫p少，小鼠出現(xiàn)嗜酸性粒細胞增多、心肌纖維碎裂、核固縮和水腫的疾病表型。Bergo等[12]在小鼠敲除了參與prelaminA蛋白水解過程的Zmptse24金屬蛋白酶，Zmptse24敲除的小鼠具有類似兒童早老癥的臨床表型，發(fā)育遲緩，因心功能障礙、脫發(fā)和核異常而過早死亡。盡管這些小鼠建模的方式不同，但可發(fā)現(xiàn)LMNA基因突變造成的疾病機制普遍存在兩個特點，模型小鼠的細胞核結(jié)構(gòu)不完整，突變的LMNA基因造成基因表達異常[13]。根據(jù)文獻[14]報道，細胞核膜的完整跟基因組的穩(wěn)定性相關。LMNAR527C突變基因?qū)е潞死w層組裝發(fā)生異常，失去修復細胞核畸形能力。本研究結(jié)果顯示，LMNAR527C基因突變編碼的LaminA蛋白容易在核膜形成點狀聚集，部分蛋白定位從核纖層轉(zhuǎn)移至核內(nèi)。LaminA蛋白分布的改變，可能影響了細胞核膜的結(jié)構(gòu)，導致細胞基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常，基因組不穩(wěn)定[15]。

雖然本研究中的LMNAR527C突變基因小鼠未出現(xiàn)相關疾病臨床表型，但我們在對小鼠尾組織和皮膚組織進行γH2Ax蛋白的檢測結(jié)果顯示，LMNAR527C突變基因小鼠皮膚組織γH2Ax蛋白水平增加；同時，在原代培養(yǎng)小鼠的肺成纖維細胞衰老相關β-半乳糖苷酶染色實驗發(fā)現(xiàn)，LMNAR527C突變基因小鼠成纖維衰老細胞數(shù)量百分比增加，實驗結(jié)果證明LMNAR527C突變基因?qū)е履Ｐ托∈蠼M織和原代培養(yǎng)的肺成纖維細胞DNA損傷增加，基因組不穩(wěn)定，衰老加速。細胞衰老與個體整體衰老不一致，我們推測，可能是由于體外細胞實驗與小鼠整體實驗存在環(huán)境差異，小鼠出現(xiàn)衰老表型可能需要其他條件，例如紫外照射、免疫系統(tǒng)缺陷的刺激，也有可能小鼠存在另外相關的信號通路修復了DNA損傷，或者LMNAR527C突變基因?qū)е戮幋a的Lamin A蛋白結(jié)構(gòu)功能改變影響其他信號通路的關鍵蛋白從而改善了LMNAR527C突變基因的不良影響。LMNAR527C突變基因?qū)λダ系挠绊戇€有待進一步研究。

本研究通過分子克隆技術(shù)，把小鼠LMNAR527C突變基因重組到質(zhì)粒pEGFP-N1中，通過Lipo2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒到239T LMNA敲除細胞，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染LMNAR527C基因突變的細胞γH2Ax蛋白水平增加，但與轉(zhuǎn)染LMNA正?；虻募毎啾炔⑽从忻黠@差異，γH2Ax蛋白水平增加可能是由于轉(zhuǎn)染外源基因造成，并非基因突變導致。免疫熒光實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染野生型LMNA能修復LMNA敲除導致的細胞核畸形[16]。在典型兒童早老癥臨床樣本研究中發(fā)現(xiàn)，患者成纖維細胞核形態(tài)異常、γH2Ax蛋白水平增加、異染色質(zhì)蛋白水平減少以及組蛋白表觀遺傳修飾發(fā)生改變[17]。LMNAR527C突變基因在LMNA基因敲除細胞中表達的實驗結(jié)果說明，LMNAR527C突變基因?qū)е录毎暮私Y(jié)構(gòu)和功能異常與典型兒童早老癥相似。

綜上所述，LMNAR527C基因突變小鼠表型無明顯改變。LMNAR527C突變基因編碼的Lamin A蛋白在細胞內(nèi)聚集不連續(xù)，定位從核膜到核內(nèi)，導致細胞DNA損傷增加，衰老細胞增加，但可能存在其他原因清除了LMNAR527C基因突變造成的不良影響，因此LMNAR527C突變基因模型小鼠整體并未出現(xiàn)相關疾病臨床表型。LMNAR527C基因突變小鼠模型為人們了解Lamin A蛋白在不同物種間的生物學功能以及在組織發(fā)育過程中的作用提供了寶貴材料。