趙梁

【摘要】 目的 分析利福平在耐藥結(jié)核分枝桿菌治療中的問題。方法130株結(jié)核分枝桿菌株， 其中20株結(jié)核分枝桿菌株對于乙胺丁醇、異煙肼、利福平和鏈霉素敏感， 2株H37Rv結(jié)核桿菌株，?64株對于劑量為250 μg/ml利福平表現(xiàn)出耐藥（R250）， 44株對于劑量為50 μg/ml利福平表現(xiàn)出耐藥（R50）， 均開展DNA序列分析。結(jié)果 在108株耐利福平結(jié)核分枝桿菌中， 發(fā)生rpoB基因突變92株（85.2%）， 250 μg/ml利福平表現(xiàn)出耐藥（R250）耐利福平結(jié)核分枝桿菌基因突變率78.1%明顯低于50 μg/ml利福平表現(xiàn)出耐藥（R50）耐利福平結(jié)核分枝桿菌的95.5%， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。R250耐利福平結(jié)核分枝桿菌基因位置主要以531密碼子為主， 突變率為58.0%（29/50）;基因位置在511密碼子突變率為16.0%（8/50）。R50耐利福平結(jié)核分枝桿菌基因突變位置主要以533密碼子為主， 突變率為23.9%（11/42）;其次基因位置在531、562密碼子， 突變率均為19.0%（8/42）。結(jié)論 絕大部分對于利福平耐藥的結(jié)核分枝桿菌均存在rpoB基因突變現(xiàn)象， 而對于利福平高耐藥結(jié)核分枝桿菌的rpoB基因之中， 主要突變特征為531位密碼子突變和多個密碼子聯(lián)合突變。其對于利福平低耐藥結(jié)核分枝桿菌的rpoB基因內(nèi)突變位置呈現(xiàn)出了散在性分布現(xiàn)象。

【關(guān)鍵詞】 利福平;耐藥結(jié)核分枝桿菌;rpoB基因;基因突變

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.32.108

當(dāng)前在治療結(jié)核疾病過程中， 結(jié)核分枝桿菌（MTB）高耐藥性問題已然成為了最近幾年結(jié)核疾病控制中的重要難題， 其也為結(jié)核病惡化的主要因素[1]。利福平為一類快速殺菌劑， 能夠明顯縮短結(jié)合疾病的治療療程， 其在短程化療中起到了相當(dāng)重要的作用。另有研究表明， 結(jié)核分枝桿菌對于利福平耐藥代表病患的治療時間加長。倘若在此同時， 聯(lián)合使用其他抗結(jié)核藥物耐藥， 代表患者的治療效果較差。所以說， 結(jié)核分枝桿菌對于利福平耐藥機(jī)制一直是當(dāng)前分枝桿菌研究的熱點(diǎn)話題。結(jié)合實際情況， 本文全面分析利福平在耐藥結(jié)核分枝桿菌治療中的問題， 現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2017年1月～2018年1月本院收治的肺結(jié)核患者痰液內(nèi)分離出130株結(jié)核分枝桿菌株作為研究對象， 其中有20株結(jié)核分枝桿菌株對于乙胺丁醇、異煙肼、利福平和鏈霉素敏感;2株H37Rv結(jié)核桿菌株;64株結(jié)核分枝桿菌株對于劑量為250 μg/ml利福平表現(xiàn)出耐藥（R250）;44株對于劑量為50 μg/ml利福平表現(xiàn)出耐藥（R50）。本實驗利用改良后的羅氏法進(jìn)行細(xì)菌分離、培養(yǎng)、鑒定以及藥敏實驗。同時依照肺結(jié)核診斷細(xì)菌學(xué)規(guī)程完成各項工作。當(dāng)細(xì)菌處于含量在50 μg/ml利福平的利福平培養(yǎng)基中能夠生長就可判定為耐藥， 其在250 μg/ml利福平的利福平培養(yǎng)基中能夠生長則可視為高耐藥。本實驗所利用的H37Rv結(jié)核桿菌株由省結(jié)核病控制中心參比實驗室所提供。

1. 2 方法 ①提取DNA：利用相關(guān)方式提取好DNA之后， 將其放置于-20℃環(huán)境下保存， 以備使用。②聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）：下游引物（rpoB2）為：5ACG TGA GCG TGC CGC GCT GGA3。上游引物（rpoB1）為：5AGG CGA TCA CAC CGC AGA CGT3。所擴(kuò)增的DNA片段長度均為184 bp。實驗所使用的PCR檢測系統(tǒng)由華美公司所提供。③DNA序列分析：實驗使用VGI公司生產(chǎn)的自動測序儀， 開展相關(guān)工作， 試劑盒為配套產(chǎn)品。使用濃度為6%的聚丙烯酰胺凝膠開展電泳工作， 并自動識別， 判定結(jié)果。

1. 3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

20株（R0）對于異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素敏感的結(jié)核分枝桿菌以及2株H37Rv結(jié)核桿菌株沒有檢測出rpoB基因易感區(qū)存在突變現(xiàn)象。在108株耐利福平結(jié)核分枝桿菌中， 發(fā)生rpoB基因突變92株（85.2%）。其中R250耐利福平結(jié)核分枝桿菌基因突變50株（78.1%）;R50耐利福平結(jié)核分枝桿菌基因突變42株（95.5%）， R250耐利福平結(jié)核分枝桿菌基因突變率明顯低于R50耐利福平結(jié)核分枝桿菌， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。R250耐利福平結(jié)核分枝桿菌基因位置主要以531密碼子為主， 突變率為58.0%（29/50）;基因位置在511密碼子突變率為16.0%（8/50）。R50耐利福平結(jié)核分枝桿菌基因突變位置主要以533密碼子為主， 突變率為23.9%（11/42）;其次基因位置在531、562密碼子， 突變率均為19.0%（8/42）。R250耐利福平結(jié)核分枝桿菌菌株基因突變內(nèi)共計10株出現(xiàn)多密碼子聯(lián)合突變， 在此其中涉及到511位亮氨酸共計8株（80.0%）。

3 討論

從rpoB基因突變和利福平最低抑菌濃度關(guān)系方面來看， 當(dāng)前臨床開展結(jié)核分枝桿菌藥敏實驗中[1]， 一般使用絕對濃度法予以進(jìn)行。全面分析分枝桿菌是否出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。世界衛(wèi)生組織規(guī)定細(xì)菌在含量于40～50 μg/ml利福平培養(yǎng)基中能夠生長， 可以判定為耐藥。從我國來講， 臨床中判定利福平耐藥。情況一般采用兩個濃度， 詳細(xì)為50 μg/ml以及250 μg/ml。

其分別代表了低度耐藥以及高度耐藥。最低抑菌濃度（MIC）主要指的是：細(xì)菌在內(nèi)含藥物的培養(yǎng)基中無法生長最低藥物濃度水平， 其為判定細(xì)菌耐藥水平的精準(zhǔn)化指標(biāo)[2]。本實驗對于結(jié)核分枝桿菌菌株rpoB基因突變區(qū)開展DNA序列分析， 結(jié)果證實：20株對于異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素敏感的結(jié)核分枝桿菌以及2株H37Rv結(jié)核桿菌株中沒有檢測出rpoB基因突變區(qū)域改變。108株對于耐利福平低耐藥和耐利福平高耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株內(nèi)共計92株存在rpoB基因核心區(qū)域點(diǎn)突變現(xiàn)象， 其和我國相關(guān)報道類似?；蛲蛔兊念l次和耐藥程度不存在關(guān)聯(lián)性[3， 4]。531位氨基酸突變?yōu)橹袊Y(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥有關(guān)的最常見突變類型。其也為高耐藥結(jié)核分枝桿菌rpoB基因主要突變位點(diǎn)。本實驗中50株R250耐利福平結(jié)核分枝桿菌基因位置主要以531密碼子為主;42株R50耐利福平結(jié)核分枝桿菌基因突變位置主要以533密碼子為多， 其次為531、562密碼子， 僅有8株內(nèi)含531位密碼子突變。由此能夠發(fā)現(xiàn)， 531位氨基酸突變位是利福平高耐藥結(jié)核分枝桿菌主要突變特征。

結(jié)核分枝桿菌出現(xiàn)耐藥性的主要方式為染色體突變所見的耐藥性[5-7]。因為把基因核苷酸出現(xiàn)突變， 進(jìn)而形成了不正確的氨基酸序列。這在一定程度上對藥物以及靶位酶親和性造成影響， 進(jìn)而形成了結(jié)核分枝桿菌對于藥物敏感性耐受或下降。細(xì)菌對利福平藥物產(chǎn)生耐藥主要形式為點(diǎn)突變， 而對于利福平高耐藥結(jié)核分枝桿菌株之中， 其更容易發(fā)生多個密碼子聯(lián)合突變[8， 9]。

綜上所述， 絕大部分對于利福平耐藥的結(jié)核分枝桿菌均存在rpoB基因突變現(xiàn)象， 而對于利福平高耐藥結(jié)核分枝桿菌的rpoB基因之中， 主要突變特征為531位密碼子突變和多個密碼子聯(lián)合突變。其對于利福平低耐藥結(jié)核分枝桿菌的rpoB基因內(nèi)突變位置呈現(xiàn)出了散在性分布現(xiàn)象。

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[收稿日期：2019-04-01]