朱曉瑋，王 艷，許秀梅，楊莉莉，尹秀鳳

（南京天邦生物科技有限公司，南京 211102）

牛病毒性腹瀉是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的，臨床上以牛黏膜發(fā)炎、糜爛、壞死以及腹瀉為特征的疾病[1]。BVDV屬于黃病毒科（Flaviviridae）、瘟病毒屬（Pestivirus），與豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、綿羊邊界病毒（Border disease virus，BDV）同屬，具有抗原相關性，在血清學上存在著交叉反應。中國BVDV流行已相當嚴重。由于BVDV感染T細胞可引起免疫抑制，如果不采取措施對牛病毒性腹瀉進行及時防控，一旦BVDV強毒株或超強毒株在豬群內流行，再加上危害嚴重的豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒，將會對我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成很大影響[2]。使用BVDV污染的豬瘟疫苗免疫豬可導致其感染BVDV，引起類似于非典型豬瘟的發(fā)生。因此，帶有BVDV抗原的血清和牛睪丸也不能用來培養(yǎng)CSFV。

豬瘟活疫苗BVDV污染在我國時有報道，若不能及時檢測出疫苗中BVDV污染情況，會造成重大經濟損失甚至會導致傳染病的流行。本研究參考GenBank中BVDV和豬瘟兔化弱毒病毒（Hog cholera lapinized virus，HCLV）序列設計1對引物，利用PCR對HCLV和BVDV進行鑒別診斷，并對豬瘟生產所用的原輔材料、半抗原及成品進行BVDV檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和細胞 BVDV C24V毒株（2007.12.20 F10）購自中國獸藥監(jiān)察所；HCLV C株為南京天邦生物科技有限公司生產用種毒；MDBK細胞購自中國獸藥監(jiān)察所；牛睪丸細胞為南京天邦生物科技有限公司自備。

1.1.2 試劑 BVDV檢測試劑盒購自中國獸藥監(jiān)察所；核酸提取試劑盒、RT-PCR反應試劑購自TaKaRa公司。

1.1.3 樣品 2012～2017年江蘇A血清（A）、B血清公司（B）及內蒙某血清公司（C）提供牛血清共4089份，牛睪丸152批；豬瘟各收次抗原1255份，本公司豬瘟成品苗114批。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測 PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，擴增片段長度為312 bp。按試劑盒操作說明和RT-PCR常規(guī)方法對樣品進行核酸提取、反轉錄、擴增及電泳檢測。

1.2.2 BVDV培養(yǎng)和鑒定 將BVDV C24V株接種至MDBK細胞單層，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h進行凍融收獲，作為BVDV陽性對照。將MDBK鋪96孔細胞板，長成單層后，接種RT-PCR檢測為BVDV陽性樣品和BVDV C24V株陽性對照，并設健康細胞陰性對照，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h，按《中國獸藥典》豬瘟活疫苗外源病毒檢測和BVDV檢測試劑盒操作方法對樣品進行鑒定。

2 結果與討論

2.1 BVDV繁殖結果用BVDV試劑盒對接毒細胞和健康細胞處理后，熒光顯微鏡下觀察。陽性毒株和陽性樣品接種的細胞，細胞質中可以觀察到特異性綠色熒光，而健康對照細胞和樣品中含滅活的BVDV陽性樣品接種的細胞，細胞質中無綠色熒光（圖1）。

圖1 BVDV細胞培養(yǎng)與鑒定結果Fig.1 Identification of BVDV by cell culture

2.2 樣品RT-PCR檢測結果PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，所檢BVDV 核酸陽性樣品和陽性對照在312 bp 附近出現特異性條帶，而所檢BVDV 核酸陰性樣品則無目的條帶（圖2）。2012～2017年BVDV RT-PCR檢測結果具體見表1和表2。

豬瘟活疫苗BVDV 污染在我國時有報道，若不能及時檢測出疫苗中BVDV污染情況，會造成重大經濟損失，甚至會導致傳染病的流行。范學政等[3]報道豬瘟疫苗中BVDV的感染率為21.74%。2011年，葉兆美等[4]對四川省市售的豬繁殖與呼吸綜合征疫苗和豬瘟疫苗進行了檢測，結果10份豬瘟疫苗和9份豬繁殖與呼吸綜合征疫苗中BVDV的污染率為10.53%。范仲鑫等[5]對湖南省內的48 個批次的豬瘟疫苗進行了BVDV檢測，陽性率為18.75%。張志等[6]對14個省的豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征弱毒招標苗進行檢測，有9份BVDV陽性。我國豬群中BVDV感染也相當嚴重。吳文輝等[7]在2007年和2008年對上海市奉賢地區(qū)疑似豬瘟樣品及不同批次的豬瘟弱毒苗進行BVDV檢測，發(fā)現兩者的陽性率分別為35.1%和64.1%。2009年和2010年又對該地區(qū)及鄰近區(qū)域的疑似豬瘟送檢生豬樣品進行檢測，發(fā)現BVDV陽性率分別高達80.39%和80.72%[8]。2004～2007年，戴益民等[9]報道江西省豬群中BVDV 感染率為10%～15.8%[10]。宋永峰等在2006年利用RT-PCR對浙江等6個省市的43份豬病料進行檢測，結果檢出BVDV 陽性率達16.3%。梁晟等[11]對2010～2012年廣西省部分地區(qū)豬病進行調查，結果表明BVDV的檢出率為26.92%。2012 年閩西地區(qū)部分豬場的BVDV 陽性率高達94.4%，其中種豬、育肥豬、保育豬和仔豬的陽性率分別為38.5%、17.3%、2.1%和27.4%[12]。本調查結果顯示，2012～2017年共檢測4089頭新生牛血清、152批新生牛牛睪丸、1255份豬瘟抗原、114批豬瘟疫苗，BVDV陽性數分別為115、34、78和2。

圖2 RT-PCR擴增產物電泳檢測Fig.2 Result of RT-PCR detection

表1 2012～2017年 BVDV RT-PCR檢測情況Table 1 Detection of BVDV during 2012-2017 by RT-PCR

表2 豬瘟疫苗生產用新生牛血清BVDV檢測情況Table 2 Detection of BVDV in newborn bovine serum for the production of CSFV vaccine

目前豬瘟細胞苗生產中對BVDV病原的檢測方法主要有細胞培養(yǎng)、免疫熒光染色及抑制試驗等，但這些方法在實際中很難將CSFV和BVDV進行區(qū)分，而且耗時長，每次檢測樣本少，不利于生物制品原材料的快速檢測。PCR敏感快速，每次檢測的樣本多，可用于BVDV牛血清的篩選。豬瘟原代細胞苗在生產過程中要用到牛血清、牛睪丸等牛源產品，原材料中若帶有低滴度的BVDV，將會對豬瘟疫苗造成污染，進而對使用該疫苗的豬造成危害，對養(yǎng)殖業(yè)造成經濟損失。

本研究中所用引物經過反復驗證，對BVDV特異且敏感，無論活毒還是死毒都可檢出。盡管死毒對疫苗的使用效果影響不大，但是本公司為了嚴格控制豬瘟疫苗質量，只要RT-PCR檢出陽性，一律廢棄。RT-PCR檢測可用于豬瘟細胞苗全過程BVDV控制，或其他生產過程中用到牛血清的豬用活疫苗，如豬偽狂犬病活疫苗、豬藍耳病弱毒活疫苗等。本研究中盡管對細胞培養(yǎng)用牛血清及牛睪丸進行了檢測篩選，但在后面的半抗原和成品檢測中仍有一定的陽性檢出。有的是血清中失去活力的BVDV造成，如某批細胞的二收BVDV檢測陽性，三收和四收BVDV檢測結果卻為陰性；有的是血清或牛睪丸中的活毒造成，如2016年的12份陽性樣品，分別為07批、15批和19批3批細胞的1～4收次收獲液。如果牛睪丸細胞中存在BVDV活毒，該批細胞則無法繁殖豬瘟病毒，用熒光定量PCR檢測不到豬瘟病毒?！吨袊幍洹啡浚?010版）附錄也對新生牛血清檢測提出了相同的技術要求[13]。雖然各國對于牛血清的生產均有嚴格的技術規(guī)范，但由于檢測技術存在局限性，市場上的牛血清還是存在BVDV污染的現象。本研究所測牛血清樣品均為血清公司提供的經過檢測的專門用于豬瘟病毒培養(yǎng)的血清。江蘇兩個血清公司提供的新生牛血清BVDV陽性率仍然為2.1%～4.97%，牛睪丸BVDV陽性率為30%左右，這也同時證明BVDV在江蘇省牛群中感染十分嚴重。因此，本公司2016年后從內蒙某公司采購豬瘟專用新生牛血清和牛睪丸，保證了產品質量。另外，大品牌的血清也要堅持檢測，本研究檢測2批進口胎牛血清，結果1批BVDV陽性；檢測3批進口小牛血清，其中2批BVDV陽性（表略）。張強等[14]采用RT-PCR檢測進口胎牛血清，9份中有7份陽性。王競晗等[15]從進口胎牛血清中成功分離到致細胞病變的BVDV FBS2014株。這些數據均說明進口胎牛血清BVDV陽性率相當高。

總之，為保證生物制品安全，所有原輔材料和最終產品都必需檢測潛在污染物。疫苗生產企業(yè)必須嚴格按照GMP規(guī)范組織生產，對疫苗生產全過程進行質量控制，重點加強對原輔材料質量控制，制定嚴格的內控質量標準，認真開展原輔材料入廠檢測工作[16]。