古金元，劉照虎，馬梓承，李 焱，孟凡亮，王宏宇，肖一紅，劉思當(dāng)

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安271018；2. 山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安271018；3.山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心，泰安 271018）

偽狂犬病（Pseudorabies，PR）又稱(chēng)Aujeszky's disease（AD），是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的急性傳染病，豬是其天然貯存宿主[1]。當(dāng)前，豬偽狂犬病在全世界廣泛流行，尤其是養(yǎng)殖密度較大的國(guó)家。PR可以造成種豬繁殖障礙，新生仔豬神經(jīng)癥狀以及急性死亡，生長(zhǎng)豬以及育肥豬出現(xiàn)呼吸道癥狀等，是目前威脅養(yǎng)豬業(yè)最主要的傳染病之一，每年給全球養(yǎng)豬業(yè)造成無(wú)法估量的經(jīng)濟(jì)損失[2,3]。

胸苷激酶（thymidine kinase，TK）基因，是一種由病毒基因組編碼的介導(dǎo)核酸代謝的酶類(lèi)，主要決定著病毒的毒力強(qiáng)弱，是皰疹病毒中最早被發(fā)現(xiàn)的與毒力有關(guān)的基因，處于UL23區(qū)，基因全長(zhǎng)963 bp，共編碼321個(gè)氨基酸。TK基因的主要功能是催化脫氧胸腺嘧啶核苷磷酸化成dTMP，并繼續(xù)磷酸化成DNA的基本成分dTTP。Kit等[4]率先確認(rèn)了TK基因與PRV毒力有關(guān)。TK作為PRV重要的毒力基因之一，與病毒在機(jī)體神經(jīng)組織中的復(fù)制，長(zhǎng)期處于潛伏感染和激活處于潛伏感染狀態(tài)的病毒粒子等過(guò)程關(guān)系密切，而與病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖關(guān)系不大[5-7]。TK基因的缺失不但能造成PRV毒力明顯下降甚至丟失，而且還可以大大減弱PRV在神經(jīng)組織中的復(fù)制能力，由外周神經(jīng)向腦傳播的能力以及導(dǎo)致宿主腦炎死亡的能力。另外，TK基因缺失后的病毒在細(xì)胞上的增殖能力與野毒株沒(méi)有顯著的差異，但毒力及潛伏感染的能力卻極大地減弱[8]。

2011年以前，基因缺失疫苗的普遍應(yīng)用，結(jié)合gE-ELISA鑒別診斷方法的運(yùn)用, PR在我國(guó)得到了有效的控制。但自2011年下半年開(kāi)始，我國(guó)部分省市使用PRV傳統(tǒng)疫苗免疫的豬群相繼暴發(fā)疑似偽狂犬病疫情，發(fā)病率和病死率明顯上升，并陸續(xù)分離得到病毒[9-15]。研究表明，分離毒株抗原性與傳統(tǒng)毒株相比發(fā)生顯著變異，PRV傳統(tǒng)疫苗免疫后誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體，不能有效中和新分離病毒株，從而無(wú)法對(duì)豬形成完全的保護(hù)[14,16,17]。關(guān)于PRV變異毒株的分離報(bào)道越來(lái)越多，對(duì)其研究也日趨成為熱點(diǎn)。

為了解山東省部分地區(qū)免疫豬場(chǎng)PR流行情況，本研究對(duì)2018年1～5月份采集到的PR疑似病料進(jìn)行了病毒分離鑒定，并對(duì)PRV分離毒株TK基因進(jìn)行了序列測(cè)定及遺傳變異分析。

1 材料和方法

1.1 病料來(lái)源分別于2018年1～5月份在山東省濟(jì)寧市、聊城市、臨沂市、泰安市、德州市、淄博市等不同豬場(chǎng)，采集到10份PR疑似病料（腦組織、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、淋巴結(jié)、扁桃體），這些豬場(chǎng)均使用PRV疫苗進(jìn)行了常規(guī)免疫。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料pMD18-T Simple Vector、DL2000 DNA Marker、2×GC buffer、dNTP、rTaq酶、ddH2O購(gòu)自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；Easy Pure Viral RNA/DNA Extraction kit、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、胎牛血清（FBS）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司；膠回收試劑盒（DNA Gel Extraction Kit）購(gòu)自天根試劑公司；瓊脂糖（Agarose）購(gòu)自Sigma試劑公司；BHK-21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中登錄的PRV TK全基因序列，使用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，用于TK全基因擴(kuò)增和序列分析，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

1.4 病原檢測(cè)將凍存于液氮中的病料組織解凍，取適量加入滅菌PBS研磨成勻漿，反復(fù)凍融3次后，9000×g離心3 min，然后取上清使用北京全式金EasyPure Viral DNA/RNA Extraction kit（批號(hào)：K10314）提取病毒核酸。將提取的核酸為模板，用PRV TK引物進(jìn)行PCR，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，最后在紫外凝膠成像儀下根據(jù)條帶位置判斷病原的感染情況。

表1 PRV TK基因引物序列Table 1 Primer sequence of PRV TK gene

1.5 病毒分離及PRV TK基因序列分析將經(jīng)過(guò)PCR鑒定為PRV TK陽(yáng)性的病料勻漿液上清經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾后，接種于密度約70%的單層BHK-21細(xì)胞，盲傳3代后收毒，將細(xì)胞及上清按上述方法提取核酸后，進(jìn)行PCR鑒定。將鑒定為陽(yáng)性的核酸利用PRV TK引物，進(jìn)行TK基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，連接pMD 18-T載體后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行增菌培養(yǎng)，最后將鑒定為T(mén)K基因陽(yáng)性的菌液送到上海生工生物公司測(cè)序。利用DNAStar 7.1軟件對(duì)本研究中分離到的毒株和GenBank中錄入的PRV參考毒株的TK基因進(jìn)行核苷酸序列及推導(dǎo)氨基酸序列的比對(duì)分析，以便得出分離毒株的序列特征。同時(shí)構(gòu)建TK基因遺傳進(jìn)化樹(shù)，比較分離株與參考株親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。本研究所用到的GenBank收錄的13株參考毒株見(jiàn)表2。

表2 本研究序列分析所用參考毒株Table 2 PRV reference strains used for comparison in this study

2 結(jié)果與討論

2.1 PR疑似病料病原檢測(cè)結(jié)果對(duì)10份來(lái)自山東省不同地區(qū)的PR疑似病料用PRV TK引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果全部為陽(yáng)性。

2.2 病毒的分離鑒定10份PRV TK陽(yáng)性病料勻漿液上清經(jīng)0.22μm濾器過(guò)濾后，接種于長(zhǎng)滿單層的BHK-21細(xì)胞，其中7份可見(jiàn)典型的PRV細(xì)胞病變，以細(xì)胞圓縮、聚集和脫落為主要特征。盲傳3代后收毒，經(jīng)PCR鑒定全部為PRV陽(yáng)性。將7株P(guān)RV分別命名為SDDZ、SDHZ、SDJN、SDLC、SDLY、SDTA、SDZB。

2.3 TK基因的擴(kuò)增及同源性分析TK基因擴(kuò)增結(jié)果表明，7株P(guān)RV分離株TK基因全長(zhǎng)均為963 bp。同源性分析結(jié)果顯示，分離株之間TK基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為99.1%～99.8%和98.7%～99.4%，與參考毒株TK基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為97.8%～99.9%和97.2%～99.7%，并且7株分離株與國(guó)內(nèi)報(bào)道的PRV變異株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均略高于歐美毒株。分離株與參考毒株TK基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列的同源性結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 PRV TK基因核苷酸及氨基酸序列分析使用DNAStar軟件的MegAlign功能，對(duì)7株P(guān)RV分離株TK基因與國(guó)內(nèi)變異株及歐美參考株Kaplan（JF797218）、Becker（JF797218）等進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)分離株及國(guó)內(nèi)變異株與歐美參考株相比，有一個(gè)共同的規(guī)律，即在堿基第644-645位由AC突變?yōu)镚T(圖1A)，導(dǎo)致其氨基酸第215位由蘇氨酸（T）突變?yōu)槔i氨酸（V）(圖1B)，結(jié)果表明7株分離株均應(yīng)屬于PRV變異毒株。

表3 分離株與各參考毒株TK基因核苷酸(nt)及推導(dǎo)氨基酸(aa)序列的相似度Table 3 Nucleotide and amino acid similarities of TK gene between isolates and reference strains

圖1 PRV TK基因核苷酸（A）及氨基酸(B)分析比較Fig.1 Analysis and comparison of nucleotide （A）and amino acid (B) of TK gene

2.5 PRV TK基因的遺傳進(jìn)化分析將獲得的7株P(guān)RV毒株的TK基因與GenBank已發(fā)表的13株參考毒株的TK基因進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，利用MEGA6的Maximum-Likelihood方法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

本研究分離到的7株毒株（標(biāo)識(shí)）TK基因分別與國(guó)內(nèi)之前報(bào)道的JS-2012、HeN2012、TJ2012以及ZMD2012等變異株（標(biāo)識(shí)）位于兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支上，親緣關(guān)系較近，而都與NIA3、Becker等歐美毒株以及疫苗株Hungary 2011（Bartha-K61株）（標(biāo)識(shí)）的遺傳距離較遠(yuǎn)。因此，我們推測(cè)目前山東省流行的PRV以變異毒株為主。當(dāng)前國(guó)內(nèi)關(guān)于PRV新流行毒株變異主要有3種觀點(diǎn)：毒力增強(qiáng)說(shuō)、抗原變異說(shuō)以及毒力增強(qiáng)兼抗原變異說(shuō)[18,19]。本研究中7株P(guān)RV變異株均分離自使用PRV傳統(tǒng)疫苗常規(guī)免疫的豬場(chǎng)，表明目前廣泛應(yīng)用的疫苗株對(duì)PRV變異株的攻擊已不能提供完全保護(hù)，這與之前國(guó)內(nèi)很多研究報(bào)道的結(jié)論相一致：2011年之后PR的流行歸結(jié)于PRV變異毒株的流行，而疫苗株無(wú)法提供有效保護(hù)[20-24]，但也有研究結(jié)果與之相悖[25]。

圖2 分離株與參考株TK基因遺傳進(jìn)化樹(shù)分析Fig.2 Phylogenetic tree of the nucleotide sequences of PRV isolates based on the TK gene