梅朱園,鄔 琴,柴迎錦,顧曉曉,陶喬孝慈,鐘發(fā)剛,韓猛立,黃 新,周 霞,張星星
(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院,石河子832003;2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室,石河子832000)
隨著新疆畜牧業(yè)的發(fā)展,牛呼吸道感染疾病也逐漸成為影響牛群健康的重要疾病之一。除了環(huán)境等外界因素外,細(xì)菌性病原也是牛呼吸道感染疾病發(fā)生的主要原因,其中多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)則是引起犢牛肺炎分離率較高的病原[1]。
細(xì)菌分型在研究菌株之間關(guān)系,確定感染源和控制病原菌的流行以及制定有效的防控措施等方面具有重要意義。對臨床分離的巴氏桿菌采用不同方法進行分型也是制定有效防控措施的重要依據(jù)之一。依據(jù)莢膜抗原將Pm分為5種血清型的Carter分型方法[2],以及依據(jù)脂多糖抗原將Pm分為16種血清型的Heddleston分型方法[3]等均屬常規(guī)血清分型方法,對抗血清濃度、滴度和特異性等要求較高,不適合臨床快速開展大規(guī)模Pm流行病學(xué)調(diào)查。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,研究人員建立的多重PCR和多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)方法具有操作簡單、靈敏、快速等特點。Townsend等[4]基于Pm莢膜編碼區(qū)基因的特有序列建立了快速鑒定Pm莢膜血清型PCR技術(shù),與Carter分型結(jié)果相符。研究人員針對Pm脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)合成中的8個特異性基因位點,建立的多重PCR方法,可將各血清型劃分為不同的L型[6]。MLST是用于微生物分型、進化和流行病學(xué)監(jiān)測等研究的一種簡便可行的方法,它是對多個管家基因內(nèi)部片段進行PCR擴增測序,從而分析細(xì)菌種群之間的演化和變異關(guān)系[7-9]。目前國內(nèi)Pm的基因多樣性和流行病學(xué)調(diào)查不夠全面,引起犢牛肺炎的Pm分離株的相關(guān)報道很少。因此本研究在對8株P(guān)m分離株進行kmt基因型鑒定的基礎(chǔ)上,分別采用莢膜特異性基因檢測、MLST和脂多糖多重PCR 分型分析,確定分離株血清型和基因型,為Pm引起犢牛肺炎暴發(fā)的流行病學(xué)監(jiān)測和基因多樣性研究提供科學(xué)依據(jù)。
1.1 質(zhì)粒、菌種及試劑8株巴氏桿菌分離自新疆建設(shè)兵團第八師不同農(nóng)牧團場,由省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室保存,分別命名為122-1、P3、F1、F2、Y、142-1、AS、X2;2×EsTaqMaster Mix等試劑均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;PDM19-T、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物工程有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,DNA Marker DL 2000購自天根生物工程有限公司。
1.2 引物設(shè)計與合成參照文獻[10]莢膜血清型和脂多糖引物設(shè)計,Pm特異性基因kmt序列設(shè)計引物以及特定的MLST分型引物(相應(yīng)的擴增及測序引物序列參見Pasteurella multocidaMLST Databases網(wǎng)站),送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成(表1)。
1.3 菌株莢膜多重PCR分型以細(xì)菌基因組為模板,通過多重PCR方法對分離株血清型進行鑒定,對擴增產(chǎn)物測序并與數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)比對。反應(yīng)擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。PCR體系:DNA模板1 μL,5種引物上、下游引物分別加入0.4 μL,Mix 10 μL,ddH2O 5 μL,共20μL。擴增條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s,55℃退火40 s,72℃延伸1 min10s,30個循環(huán);72℃再延伸10 min,4℃保存。
1.4 菌株脂多糖多重PCR分型以細(xì)菌基因組為模板,篩選反應(yīng)條件對分離株進行 LPS-mPCR 擴增,并對產(chǎn)物進行測序用于LPS分型。反應(yīng)體系:DNA模板1 μL,5種引物上、下游引物分別加入0.5 μL,Mix 10 μL,ddH2O 6 μL,共25 μL。擴增條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s,55℃退火40 s,72℃延伸1 min20 s,30個循環(huán);72℃再延伸10min,4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。
1.5 MLST分型及遺傳演化分析對8株分離菌的7個管家基因gdhA、mdh、adk、deoD、pgi、g6pd和aroA進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。將測序的每個基因的序列與MLST數(shù)據(jù)庫比對,得到相應(yīng)的等位基因編號,按照指定順序形成ST型。用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析分子進化關(guān)系。
2.1 菌株莢膜血清型的鑒定8株菌中AS、122-1、X2、142-1、F1、F2、Y共7株檢測到了A型特有的1044 bp條帶,P3擴增出現(xiàn)B血清型特有條帶(760 bp)(圖1)。
表1 多殺性巴氏桿菌kmt基因鑒定、莢膜血清分型、LPS基因型分型所用引物Table 1 Primers for identification of Pm, capsular serotyping and LPS genotyping
圖1 分離Pm的莢膜血清型鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of capsular serotype of isolated Pm
2.2 菌株LPS基因型的鑒定 通過LPS-m PCR對8株菌脂多糖基因型分型,8株菌中共7株(AS、122-1、X2、F1、F2、142-1和Y)擴增出大約474 bp的條帶,屬于脂多糖L3型,1株(P3)擴增條帶約810 bp,屬于脂多糖L2型(圖2)。
2.3 MLST分型及遺傳演化分析 8株P(guān)m有7株序列類型為ST1,1株菌序列類型為ST44。利用MEGA 7.0軟件對本研究中2個ST型與MLST數(shù)據(jù)庫中的部分ST型進行分析,結(jié)果表明,ST1與ST44親緣關(guān)系較近,在同一分支上,與數(shù)據(jù)庫中其他ST型親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。
Pm能導(dǎo)致牛出血性敗血癥,犢牛多表現(xiàn)為高熱、肺炎等疾病,可造成養(yǎng)牛業(yè)巨大的經(jīng)濟損失。根據(jù)莢膜抗原Pm可分為A、B、D、E及F五個血清型,不同血清型引起不同動物發(fā)病,并且各血清型間缺乏交叉免疫保護作用[11-13],因此對Pm的莢膜血清型分型以及對不同來源菌進行遺傳演化分析尤為重要。本研究采用多重PCR對Pm莢膜血清型和LPS基因型進行分型,可快速確定這8株菌的莢膜型和LPS基因型,加入多對引物時避免漏加或重復(fù)。采用MLST的方法,對這8株菌的管家基因進行PCR擴增,確定ST型,分析細(xì)菌的進化關(guān)系,結(jié)果準(zhǔn)確,操作簡便[10]。
圖2 分離Pm的脂多糖基因型鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of LPS genotype of isolated Pm
圖3 MLST系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果Fig.3 MLST Phylogenetic tree of isolated Pm
表2 Pm莢膜血清型、LPS分型以及ST分型結(jié)果Table 2 Capsular serotypes, LPS types and ST genotyping of Pm in this study
Ewers等[14]將從不同宿主分離的289株P(guān)m進行莢膜分型,結(jié)果表明大部分禽源和牛源Pm為血清A型。2009~2012年,日本學(xué)者報道的378株牛源Pm以莢膜A型為主[15]。在中國,以往流行的牛巴氏桿菌病主要為莢膜B型Pm引起的牛出血性敗血癥(敗血型和肺炎型),對養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重危害。近年來,由于針對莢膜B型Pm滅活疫苗具有良好的免疫效力,該病在中國已得到了有效的控制[16]。2008年,馬文戈等[17]首次報道牛源莢膜血清A型Pm感染導(dǎo)致牛群發(fā)病,呈現(xiàn)高發(fā)病率和高死亡率,其臨床癥狀、病理變化和流行特點與國外報道的牛巴氏桿菌肺炎相似。隨后,國內(nèi)研究人員也相繼報道了牛源A型Pm[18-20]。本研究分離的8株P(guān)m中7株為莢膜血清A型,1株B型,這與近年來國內(nèi)外報道的牛源Pm優(yōu)勢莢膜型相一致,說明莢膜A型Pm是目前牛巴氏桿菌病病原的優(yōu)勢血清型。
研究表明,莢膜A型Pm并不能侵入牛的血液系統(tǒng)形成敗血癥,病理變化僅局限于肺臟,這與牛出血性敗血癥有本質(zhì)區(qū)別[21,22],所以莢膜A型Pm引起的牛巴氏桿菌病被定義為牛纖維素性化膿性肺炎(簡稱牛莢膜A型巴氏桿菌肺炎)[23]。目前,臨床上使用的Pm商業(yè)疫苗的菌株多為B型Pm,僅用于預(yù)防牛出血性敗血癥。由于Pm不同血清型間的交叉保護較差[20],因此,研制牛莢膜A型巴氏桿菌肺炎疫苗迫在眉睫。
研究人員對不同宿主來源的58株P(guān)m進行脂多糖分型,結(jié)果顯示主要LPS基因型為L3、L4和L6[6]。王豪男[24]對來自于我國14省的115株豬源Pm的LPS基因型進行分析,發(fā)現(xiàn)分為L3和L6兩種,莢膜型D型的菌株,其LPS基因型均為L6型。本研究中8株P(guān)m的LPS型為L2和L3兩種,其中莢膜血清型A型菌株LPS基因型均為L3(表2)。
調(diào)查結(jié)果顯示,2011~2012年在江蘇省分離的40株禽源Pm經(jīng)MLST分析均為ST129型[9]。2015~2016年我國不同省分離的23株豬源Pm分為3個ST型,即ST3、STl0和STll[24]。本研究對8株P(guān)m的7個管家基因進行測序比對,獲得2個ST型,分別為ST1和ST44,有7株以ST1為主。8株菌分別來自5個不同的牛場,其中P3來自136團,其莢膜血清型、LPS基因型和ST型與其他7株菌不同(表2),說明導(dǎo)致犢牛肺炎的主要流行菌株血清型為A:3、ST1型,且Pm莢膜血清A型、LPS基因3型和ST1型之間可能存在一定的關(guān)聯(lián)性。從MLST系統(tǒng)進化分析結(jié)果,ST1型和ST44的親緣關(guān)系較近(圖3)。由于本調(diào)查中菌株數(shù)量較少,因此對于MLST結(jié)果需要更多菌株進行驗證。