馮鍇 任昕昕 吳靜靜 于慶洋 黃靖涵 王俊宏

摘要：目的 ?采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選石菖蒲治療注意缺陷多動(dòng)障礙（ADHD）的作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。方法 ?通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）、TCM Database@Taiwan數(shù)據(jù)庫檢索石菖蒲化學(xué)成分并篩選作用靶點(diǎn)，從DisGeNET、ADHDgene、TTD及DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索與ADHD相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，利用Cytoscape3.2.1軟件構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并篩選核心網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。結(jié)果 ?共篩選出石菖蒲治療ADHD的化合物65個(gè)，與之相對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)25個(gè)。共涉及信號(hào)通路238條，按其生物功能富集分為7組，分別為腺苷酸環(huán)化酶-G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、磷脂酶C-G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、腺苷酸環(huán)化酶活性的調(diào)節(jié)、胺類物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控、平滑肌收縮功能及血管活性調(diào)節(jié)。結(jié)論 ?本研究初步驗(yàn)證了石菖蒲治療ADHD的藥理學(xué)作用機(jī)制，為進(jìn)一步從細(xì)胞生物學(xué)層面驗(yàn)證其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：石菖蒲;注意缺陷多動(dòng)障礙;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);成分-靶點(diǎn);信號(hào)通路;機(jī)制

中圖分類號(hào)：R272.974.93;R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2019）11-0095-06

Abstract： Objective To screen the targets and related signaling pathways of Acori Tatarinowii Rhizoma for attention deficit hyperactivity disorder （ADHD） using network pharmacology; To further clarify its mechanism of action. Methods TCMSP and TCM Database@Taiwan were used to screen the active components of Acori Tatarinowii Rhizoma. Disease targets associated with ADHD were retrieved from DisGeNET， ADHDgene， TTD， and DrugBank database. The Cytoscape 3.2.1 software was used to construct a compound-target network and screen the core network. Further analysis of GO function and KEGG pathway enrichment was conducted. Results Totally 65 compounds in Acori Tatarinowii Rhizoma were screened out， and 25 corresponding targets were screened out. There were 238 signaling pathways involved in 7 signaling pathways， which were adenylate cyclase-activating G-protein coupled receptor signaling pathway， monoamine transport， phospholipase C-activating G-protein coupled receptor signaling pathway， regulation of adenylate cyclase activity， regulation of amine transport， regulation of tube diameter and smooth muscle contraction. Conclusion This study preliminarily verifies the pharmacological mechanism of Acori Tatarinowii Rhizoma in treating ADHD， and has laid a foundation for further verification of its mechanism from the cellular biological level.

Keywords： Acori Tatarinowii Rhizoma; attention deficit hyperactivity disorder; network pharmacology; component-target; signaling pathways; mechanism

注意缺陷多動(dòng)障礙（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）是一種常見于兒童和青少年的神經(jīng)精神發(fā)育障礙類疾病，可持續(xù)到成年，其三大臨床核心癥狀為多動(dòng)、注意力不集中、沖動(dòng)。盡管目前的藥物治療，如興奮劑和抗抑郁劑，能夠改善ADHD的癥狀，但仍有約20%～40%的患者不能從中受益[1]。依據(jù)其臨床特征，ADHD與中醫(yī)學(xué)“躁動(dòng)”“臟躁”“健忘”等證較為相似，臨床醫(yī)家多從陰陽失衡[2]、臟腑失調(diào)[3]、氣陰兩虛[4]等方面進(jìn)行辨證論治，所用復(fù)方藥味雖多，但必用開竅醒神藥，其中以石菖蒲最為多見[5]。

石菖蒲首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，為天南星科多年生草本植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott的根狀莖，其味辛、苦，性微溫，入心、胃經(jīng)，具有化濕和胃豁痰、開竅醒神益智的功效。石菖蒲可舒利心氣以解郁寬中，開竅寧神，其清芬之性，走達(dá)諸竅而通之，使一身之氣起亟旋展，臨床廣泛用于癲癇、多動(dòng)癥、阿爾茨海默病、抑郁癥等神經(jīng)精神類疾病的治療[6]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，石菖蒲不僅對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有興奮-抑制的雙向調(diào)節(jié)作用，而且具有改善學(xué)習(xí)記憶、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能等多種藥理作用[7-8]。然而其安神定志、醒腦開竅的具體作用機(jī)制尚不明確。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，因此對(duì)中藥的相關(guān)研究必須采取整合策略，以多學(xué)科間的交叉融合為基礎(chǔ)，構(gòu)建新的研究體系[9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)與多向藥理學(xué)的基礎(chǔ)上提出的藥物設(shè)計(jì)思路[10]，其闡述的藥物與疾病靶點(diǎn)之間相互聯(lián)系，與中醫(yī)整體觀念等核心思想相一致。它強(qiáng)調(diào)了將生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)與藥物作用網(wǎng)絡(luò)整合，分析藥物在網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點(diǎn)或網(wǎng)絡(luò)模塊的關(guān)系，由尋找單一靶點(diǎn)轉(zhuǎn)向綜合網(wǎng)絡(luò)分析，借助高通量技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)可視化技術(shù)及網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)，構(gòu)建出由藥物與疾病基因之間復(fù)雜的交叉網(wǎng)絡(luò)[11]。通過網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)間的關(guān)系來分析網(wǎng)絡(luò)特性，進(jìn)一步闡明藥物作用機(jī)制。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，進(jìn)一步明確石菖蒲的有效成分及作用靶點(diǎn)，探討其改善ADHD核心癥狀的作用機(jī)制。

1 ?資料與方法

1.1 ?藥物化學(xué)成分收集與篩選

本研究以“石菖蒲”為關(guān)鍵詞，通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/ tcmsp.php，V2.3）和TCM Database@Taiwan（http：//tcm. cmu.edu.tw/，更新至2014年3月25日）檢索石菖蒲的所有化學(xué)成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)[12]。

對(duì)所檢出的石菖蒲化學(xué)成分進(jìn)行篩選。篩選條件：口服生物利用度（OB）≥30%[12]，血腦屏障滲透度（BBB）≥-0.3[13]。其中，OB是藥物吸收、分布、代謝、排泄（ADME）等特性研究中重要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，較高的OB可減少用藥量，同時(shí)在一定程度內(nèi)減少藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。此外，ADHD病因研究提示其多與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)紊亂有關(guān)，對(duì)于治療ADHD的藥物而言，BBB是影響其生物利用度的另一個(gè)關(guān)鍵因素。因此，本研究選用OB和BBB作為篩選石菖蒲活性成分的指標(biāo)。

1.2 ?疾病靶點(diǎn)篩選

通過DisGeNET（http：//www.disgenet.org，V5.0）、ADHDgene（http：//adhd.psych.ac.cn/，更新至2014年2月14日）、TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/ttd/，更新至2017年9月12日）及DrugBank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/，V5.1.0）檢索與ADHD相關(guān)的基因。

1.3 ?藥物與疾病關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選后的石菖蒲化學(xué)成分作用靶點(diǎn)及ADHD疾病靶點(diǎn)錄入Cytoscape3.2.1軟件。存在交集的蛋白質(zhì)很有可能是石菖蒲活性成分治療ADHD的靶點(diǎn)。由于靶點(diǎn)信息來源不統(tǒng)一，故使用Uniprot數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）對(duì)得到的靶點(diǎn)信息進(jìn)行校正，獲得人類相關(guān)靶點(diǎn)的Uniprot ID。采用Cytoscape3.2.1軟件的Network Analysis插件，以平均自由度為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)石菖蒲治療ADHD的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯Y選核心網(wǎng)絡(luò)。

1.4 ?富集分析

利用Cytoscape3.2.1軟件的ClueGO和CluePedia插件對(duì)篩選出的核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，探討石菖蒲化學(xué)成分的靶點(diǎn)通過調(diào)控目標(biāo)基因功能和信號(hào)通路改善ADHD核心癥狀的作用機(jī)制。

2 ?結(jié)果

2.1 ?藥物活性成分

以O(shè)B≥30%、BBB≥-0.3作為篩選條件，共得到石菖蒲的活性化學(xué)成分63個(gè)。值得注意的是，elemicin和gamma-asarone兩成分的OB<30%，但二者均為石菖蒲較為重要的活性成分[14-15]。因此，本研究共納入65個(gè)石菖蒲活性成分（TCM Database@Taiwan數(shù)據(jù)庫檢索相關(guān)結(jié)果已涵蓋在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果內(nèi)），具體見表1。

2.2 ?藥物與疾病的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

本研究通過比對(duì)從TCMSP數(shù)據(jù)庫納入的篩選后石菖蒲活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)和從DisGeNET、ADHDgene、TTD及DrugBank數(shù)據(jù)庫收集的ADHD疾病靶點(diǎn)，共得到石菖蒲-ADHD共同作用靶點(diǎn)25個(gè)。石菖蒲-ADHD的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖1。

2.3 ?藥物與疾病的化合物-靶點(diǎn)核心網(wǎng)絡(luò)

采用Cytoscape3.2.1插件Network Analysis以平均自由度為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，共得到石菖蒲活性成?個(gè)（8、13、32、37、46、47、51號(hào)）及相關(guān)治療靶點(diǎn)21個(gè)，見表2。石菖蒲治療ADHD的化合物-靶點(diǎn)-疾病核心網(wǎng)絡(luò)見圖2。

2.4 ?信號(hào)通路分析

本研究采用Cytoscape3.2.1軟件的ClueGO和CluePedia插件對(duì)石菖蒲治療ADHD的化合物-靶點(diǎn)-疾病核心網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，共發(fā)現(xiàn)信號(hào)通路238條（見圖3）。按其生物功能富集分析結(jié)果分為7組，分別為腺苷酸環(huán)化酶-G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、磷脂酶C-G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、腺苷酸環(huán)化酶活性的調(diào)節(jié)、胺類物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控、平滑肌收縮功能及血管活性調(diào)節(jié)。見圖4。

3 ?討論

為進(jìn)一步探究石菖蒲改善ADHD核心癥狀的化合物及其作用的疾病靶點(diǎn)與信號(hào)通路之間的關(guān)系，本研究以O(shè)B和BBB為篩選條件，從TCMSP、TCM Database@Taiwan數(shù)據(jù)庫篩選出石菖蒲的活性成分，從DisGeNET、ADHDgene、TTD及DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索與ADHD相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，兩者映射比對(duì)后，以平均自由度為標(biāo)準(zhǔn)，確定了石菖蒲治療ADHD的化合物-靶點(diǎn)核心網(wǎng)絡(luò)，涉及信號(hào)通路238條。本研究篩選出的石菖蒲治療ADHD的作用靶點(diǎn)已被證實(shí)參與了本病的發(fā)生發(fā)展過程[16]，包括單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、5-羥色胺、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體、單胺氧化酶、乙酰膽堿等。富集分析表明，石菖蒲治療ADHD的大多數(shù)潛在靶點(diǎn)與神經(jīng)遞質(zhì)受體的活性和轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中不可或缺的介質(zhì)，GPCR編碼基因的突變被認(rèn)為是ADHD發(fā)病的重要因素，另外，從GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度來看，聚集在前額葉皮層和紋狀體的GPCR呈現(xiàn)出多態(tài)性，這種多態(tài)性有助于其通過下調(diào)兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)及5-羥色胺的再攝取過程，從而發(fā)揮控制多動(dòng)癥狀及減緩認(rèn)知損害的作用[17]。神經(jīng)活性配體受體通路和5-羥色胺能突觸功能證實(shí)了神經(jīng)遞質(zhì)配體和受體之間的各種相互作用，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)改變與其密切相關(guān)[18-19]。cAMP信號(hào)通路通過影響AC-cAMP-PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)性神經(jīng)遞質(zhì)（多巴胺、去甲腎上腺素和5-羥色胺）影響人類認(rèn)知功能[20]。研究表明，蛋白激酶G（PKG）介導(dǎo)了cGMP的一些神經(jīng)元效應(yīng)[21]，而且cGMP-PKG是調(diào)節(jié)蛋白磷酸酶、細(xì)胞內(nèi)鈣水平和神經(jīng)遞質(zhì)受體以發(fā)揮神經(jīng)功能的關(guān)鍵分子位點(diǎn)[22]。

由此可見，即便是單味藥，其發(fā)揮藥效的化合物成分種類、作用靶點(diǎn)及機(jī)制也較為復(fù)雜繁多，增加了中藥研究的難度。多成分、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)治療疾病是中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)所在，隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的興起，中醫(yī)藥防治疾病的優(yōu)勢(shì)日益受到關(guān)注，但同時(shí)亦存在物質(zhì)基礎(chǔ)不明、作用靶點(diǎn)不明、療效機(jī)制不明的發(fā)展困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)借助高通量數(shù)據(jù)分析，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，可一次性處理非單一成分、靶點(diǎn)、途徑的復(fù)雜通路，適用于中藥作用機(jī)制的現(xiàn)代研究。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)石菖蒲的多成分、多靶點(diǎn)與ADHD疾病靶點(diǎn)之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行分析，在臨床療效確定的基礎(chǔ)上，初步驗(yàn)證了石菖蒲治療ADHD的藥理學(xué)作用機(jī)制，為進(jìn)一步從細(xì)胞生物學(xué)層面深入研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] USTUN B， ADLER L A， RUDIN C， et al. The World Health Organization adult attention-deficit/hyperactivity disorder self-report screening scale for DSM-5[J]. JAMA Psychiatry，2017，74（5）：520-526.

[2] 顧國祥，韓新民，袁海霞，等.基于陰陽理論探討兒童多動(dòng)癥的病機(jī)[J].遼寧中醫(yī)雜志，2018，45（3）：512-514.

[3] 李亞平，馬融，魏小維，等.兒童注意缺陷多動(dòng)障礙的中醫(yī)辨證研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2013，40（4）：720-723.

[4] 劉玉清，王俊宏，劉玲佳，等.王俊宏教授治療氣陰兩虛型兒童注意力缺陷多動(dòng)障礙經(jīng)驗(yàn)[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2017，32（10）：1902-1906.

[5] 倪新強(qiáng)，韓新民，尹東奇，等.基于數(shù)據(jù)挖掘的注意缺陷多動(dòng)障礙中醫(yī)用藥規(guī)律研究[J].中國中藥雜志，2015，40（6）：1185-1191.

[6] 宋禎彥，王珊珊，賀旭，等.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究石菖蒲治療神經(jīng)退行性疾病的作用機(jī)制[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（8）：848-855.

[7] MAO J， HUANG S， LIU S， et al. A herbal medicine for Alzheimer's disease and its active constituents promote neural progenitor proliferation[J]. Aging Cell，2015，14（5）：784-796.

[8] SHIN J W， CHEONG Y J， KOO Y M， et al. α-Asarone ameliorates memory deficit in lipopolysaccharide-treated mice via suppression of pro-inflammatory cytokines and microglial activation[J]. Biomol Ther （Seoul），2014，22（1）：17-26.

[9] 李從林，王博龍.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的益母草作用機(jī)制分析[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2018，25（12）：102-106.

[10] HOPKINS A L. Network pharmacology[J]. Nat Biotechnol，2007， 25（10）：1110-1111.

[11] 蔣文儀，包藝運(yùn)，都廣禮.網(wǎng)絡(luò)中藥藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息， 2018，35（5）：122-126.

[12] 范文濤，王倩.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的石菖蒲-郁金藥對(duì)治療抑郁癥作用機(jī)制研究[J].中國中藥雜志，2018，43（12）：2607-2611.

[13] TATTERSALL M H， SODERGREN J E， DENGUPTA S K， et al. Pharmacokinetics of actinoymcin D in patients with malignant melanoma[J]. Clin Pharmacol Ther，1975，17（6）：701-708.

[14] WANG Z， WANG Q， YANG B， et al. GC-MS method for determination and pharmacokinetic study of four phenylpropanoids in rat plasma after oral administration of the essential oil of Acorus tatarinowii Schott rhizomes[J]. J Ethnopharmacol，2014，155（2）：1134-1140.

[15] WANG Y， LI F， YANG F Q， et al. Simultaneous determination of α-， β- and γ-asarone in Acorus tatarinowii by microemulsion electrokinetic chromatography with [BMIM]PF6 as oil phase[J]. Talanta，2012，101：510-515.

[16] MARTIN J， HAMSHERE M L， STERGIAKOULI E， et al. Genetic risk for attention-deficit/hyperactivity disorder contributes to neurodevelopmental traits in the general population[J]. Biol Psychiatry，2014，76（8）：664-671.

[17] XIE K， GE S， COLLINS V E， et al. Gβ5-RGS complexes are gatekeepers of hyperactivity involved in control of multiple neurotransmitter systems[J]. Psychopharmacology （Berl），2012， 219（3）：823-834.

[18] KONG Y， LIANG X， LIU L， et al. High throughput sequencing identifies microRNAs mediating α-synuclein toxicity by targeting neuroactive-ligand receptor interaction pathway in early stage of drosophila Parkinson's disease model[J]. PLoS One， 2015，10（9）：e0137432.

[19] DAUBERT E A， CONDRON B G. Serotonin：a regulator of neuronal morphology and circuitry[J]. Trends Neurosci，2010，33（9）：424-434.

[20] BOZZI Y， DUNLEAVY M， HENSHALL D C. Cell signaling underlying epileptic behavior[J]. Front Behav Neurosci，2011，5：45.

[21] WANG X， ROBINSON P J. Cyclic GMP-dependent protein kinase and cellular signaling in the nervous system[J]. J Neurochem，1997， 68（2）：443-456.

[22] BOLLEN E， PUZZO D， RUTTEN K， et al. Improved long-term memory via enhancing cGMP-PKG signaling requires cAMP-PKA signaling[J]. Neuropsychopharmacology，2014，39（11）：2497-2505.