唐婷婷 趙曼曼

[摘要] 目的 研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及白細(xì)胞介素17（IL-17）在子宮內(nèi)膜癌患者中的表達(dá)及意義。 方法 選取2013年1月～2016年1月我院收治的20例子宮內(nèi)膜癌患者作為子宮內(nèi)膜癌組，另選取同期20名健康志愿者作為對(duì)照組，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平。采用realtime-PCR及ELISA檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3、抑制性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10（IL-10）及炎性細(xì)胞因子IL-17的水平。 結(jié)果 子宮內(nèi)膜癌患者外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平及Foxp3表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。同時(shí)子宮內(nèi)膜癌患者IL-10及IL-17的分泌水平也顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論 子宮內(nèi)膜癌患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞/Th17細(xì)胞間的平衡被打破，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能通過(guò)分泌IL-10參與調(diào)控子宮內(nèi)膜癌的病理進(jìn)程。

[關(guān)鍵詞] 子宮內(nèi)膜癌;調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;白細(xì)胞介素17;白細(xì)胞介素10

[中圖分類號(hào)] R737.33? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）27-0033-03

[Abstract] Objective To study the expression and significance of regulatory T cells and interleukin 17（IL-17） in the patients with endometrial cancer. Methods 20 patients with endometrial cancer who were admitted to our hospital from January 2013 to January 2016 were selected in the endometrial cancer group. Another 20 healthy volunteers during the same period of time were selected in the control group. Flow cytometry was used to detect regulatory T cell levels in peripheral blood of both groups. Real-time PCR and ELISA were used to detect the levels of regulatory T cell transcription factor Foxp3， inhibitory cytokine interleukin 10（IL-10） and inflammatory cytokine IL-17. Results The levels of regulatory T cells and the expression level of Foxp3 in peripheral blood of patients with endometrial cancer were significantly higher than those in the control group， and the differences were statistically significant（P<0.01）. At the same time， the secretion levels of IL-10 and IL-17 in the patients with endometrial cancer were significantly higher than those in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.01）. Conclusion The balance between regulatory T cells/Th17 cells in the patients with endometrial cancer is broken. Regulatory T cells may be involved in the regulation of the pathological process of endometrial cancer by secreting IL-10.

[Key words] Endometrial cancer; Regulatory T cells; Interleukin 17（IL-17）; Interleukin 10 （IL-10）

子宮內(nèi)膜癌發(fā)生于子宮內(nèi)膜上皮組織，是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。有研究顯示大量的免疫細(xì)胞及相關(guān)炎性因子浸潤(rùn)到腫瘤組織間質(zhì)中，對(duì)子宮內(nèi)膜癌的病理進(jìn)程發(fā)揮調(diào)控作用[2]。其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞最為引人關(guān)注。有研究者發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌患者腫瘤局部CD4+CD25+Treg比例增高，并認(rèn)為這種升高在一定程度上歸因于患者的年齡或絕經(jīng)后狀態(tài)[3]。研究證實(shí)Treg細(xì)胞表面分子GITR在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于外周血中的表達(dá)[4]。同時(shí)研究人員還發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌患者中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞/殺傷性T細(xì)胞比例高者，預(yù)后較差，無(wú)病生存期明顯縮短，提示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能是子宮內(nèi)膜癌的獨(dú)立預(yù)后因素[5]。

輔助性Th17型細(xì)胞以分泌白細(xì)胞介素17（IL-17）為特征，可通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞因子，參與構(gòu)成腫瘤微環(huán)境[6]?，F(xiàn)有研究顯示Th17細(xì)胞與子宮內(nèi)膜癌存在相關(guān)性，但其具體作用機(jī)制尚未闡明。盡管有研究顯示Th17細(xì)胞的數(shù)量及特異性細(xì)胞因子的水平隨腫瘤的進(jìn)展始終維持在高水平[7]，但也有研究證實(shí)子宮內(nèi)膜癌患者外周血血清中IL-17的水平并沒(méi)有顯著升高[8]。因此Th17在子宮內(nèi)膜癌患者中的表達(dá)及作用有待進(jìn)一步確證。同時(shí)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在子宮內(nèi)膜癌中的作用及其與Th17免疫反應(yīng)中的相互關(guān)系亟待研究。

1資料與方法

1.1一般資料

選自沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院2013年1月-2016年1月就診子宮內(nèi)膜癌患者20例，且經(jīng)病理學(xué)檢查確診。年齡32～59歲，平均（42.8±9.0）歲，均未進(jìn)行過(guò)放、化療及激素或免疫等抗腫瘤治療。對(duì)照組根據(jù)年齡匹配選取20名健康志愿者，年齡36～55歲，平均（44.6±8.5）歲。兩組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有被檢者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平? 采集各組研究對(duì)象外周血2.5 mL，置于EDTA抗凝管中，加入淋巴細(xì)胞分離液，離心，分離獲得PBMC，計(jì)數(shù)。取1×106 PBMC，加入anti-CD4-FITC及anti-CD25-APC進(jìn)行細(xì)胞表面染色，4℃，2 h。破膜固定后，加入anti-Foxp3-PE進(jìn)行胞內(nèi)染色，清洗，重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。anti-CD4-FITC、anti-CD25-APC及anti-Foxp3-PE均購(gòu)自美國(guó)BD bioscience公司。

1.2.2 realtime-PCR檢測(cè)組織Foxp3的表達(dá)水平? 患者行切除術(shù)后，取1 cm×1 cm×1 cm 新鮮腫瘤組織，液氮保存。對(duì)照組取診刮后子宮內(nèi)膜，PBS清洗后，液氮保存。Trizol法提取組織塊總RNA，應(yīng)用Takara RT kit 將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)肺組織中細(xì)胞因子Foxp3 mRNA的表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)合成由大連寶生物公司提供：Foxp3上游引物5-CCACCTGGAAGAACGCCAT-3，下游引物5-CACTTCTTGGTCCCTGTGGG-3。β-actin上游引物5-CATTCCAAATATGAGATGCGTTGT-3，下游引物5-GCTATCACCTCCCCTGTGTG-3。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)IL-17、IL-10的分泌水平? 抽取各組研究對(duì)象外周血，室溫靜置2 h，1500 rpm，離心30 min，分離上清，-70℃保存，待測(cè)。取100 μL稀釋的血清樣品或梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，加入預(yù)先包被好的96孔板中。室溫孵育2 h，PBS洗板3次。加入檢測(cè)抗體100 μL，室溫孵育2 h，PBS洗板3次。加入Streptavidin-HRP 100 μL，避光孵育20 min，洗板3次。加底物避光室溫孵育30 min，加終止液50 μL。利用酶標(biāo)儀，在450 nm處讀板計(jì)算蛋白濃度。

1.3 觀察指標(biāo)

記錄對(duì)比兩組標(biāo)本中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、Foxp3、IL-17及IL-10的表達(dá)水平，并分析上述指標(biāo)與子宮內(nèi)膜癌的密切關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)水平比較

為證實(shí)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在子宮內(nèi)膜癌病理進(jìn)程中是否發(fā)揮作用，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平，同時(shí)進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)水平。結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例及子宮內(nèi)膜癌患者局部組織中Foxp3的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 兩組外周血中IL-17及IL-10分泌水平比較

酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)對(duì)照組及患者外周血血清中細(xì)胞因子的分泌水平。結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌患者血清中IL-17及IL-10的分泌水平較對(duì)照組均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表2。

3討論

子宮內(nèi)膜癌作為最常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其致死率僅次于卵巢癌和宮頸癌，居?jì)D科惡性腫瘤的第三位[9]。近年來(lái)，研究顯示子宮內(nèi)膜癌間質(zhì)中浸潤(rùn)有大量的免疫細(xì)胞，免疫細(xì)胞與其所分泌的細(xì)胞因子共同構(gòu)成了腫瘤的微環(huán)境，同時(shí)它們?cè)谧訉m內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮舉足輕重的作用，但其具體調(diào)控機(jī)制尚不十分清楚[10]。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，以表達(dá)CD4、CD25及Foxp3為特征性表型，不僅能對(duì)抗外源性抗原，還可以抑制自身抗原的免疫應(yīng)答，從而輔助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別及清除[11]。同時(shí)有研究表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在婦科腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮了重要的作用。有研究顯示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)宮頸癌的免疫逃逸[12-13]，同時(shí)在卵巢癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤患者外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例也顯著升高[14-16]，但調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜癌的作用研究尚不足。

本研究中子宮內(nèi)膜癌患者外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量及功能均有明顯升高，表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與調(diào)控了子宮內(nèi)膜癌的病理進(jìn)程。進(jìn)一步檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌患者病灶組織中Foxp3的表達(dá)水平顯著升高，提示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞不僅在數(shù)量上顯著增加，而且其免疫調(diào)節(jié)功能也明顯上調(diào)。IL-10作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，是發(fā)揮免疫抑制功能的主要細(xì)胞因子，參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在子宮內(nèi)膜癌患者外周血中，IL-10的分泌水平顯著增加，表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能同樣通過(guò)分泌IL-10來(lái)發(fā)揮其對(duì)子宮內(nèi)膜癌病理進(jìn)程的調(diào)控作用。另一方面，以分泌IL-17為主要特征的Th17型免疫細(xì)胞被證實(shí)參與子宮內(nèi)膜的多種炎癥發(fā)生過(guò)程。本研究中子宮內(nèi)膜癌患者外周血中IL-17的分泌水平顯著升高，提示Th17型炎癥反應(yīng)在子宮內(nèi)膜癌患者中被大量誘導(dǎo)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞均顯著增加，意味著調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞間相互平衡被打破，形成了有利于腫瘤發(fā)展的免疫炎性微環(huán)境。

綜上所述，通過(guò)本文研究結(jié)果及臨床報(bào)道結(jié)果顯示， 子宮內(nèi)膜癌患者血清調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及 IL-17 水平較正常人群明顯升高，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及 IL-17 水平檢測(cè)有助于對(duì)子宮內(nèi)膜癌診斷及其治療，并且對(duì)病情發(fā)展程度判斷亦有一定的臨床價(jià)值。

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（收稿日期：2019-06-10）