陳嘉晴，朱水容， 鐘毓 ，李曉琪，張小琳，楊玉瑩，何澤康，佘志剛，李春遠(yuǎn)

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院，廣東 廣州 510642；2. 中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

昆蟲種類約100多萬種，是植物的3倍，但對昆蟲共生菌代謝產(chǎn)物的研究較少[1]。一些結(jié)構(gòu)新穎、活性強(qiáng)烈的昆蟲共生菌代謝產(chǎn)物正陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[2-4]。中華稻蝗(OxyachinensisThunber)在我國各地均有分布，主要危害水稻、玉米、高粱、麥類等多種糧食作物。我們從中華稻蝗腸道中分離到了十多株共生菌，在對其中NigrosporasphaericaZMT05代謝產(chǎn)物研究中，得到了8個(gè)新化合物，包括6個(gè)環(huán)戊烯酮衍生物[5]，1個(gè)乙酰苯衍生物和1個(gè)吡咯烷酮衍生物[6]，均具有抗植物病原菌活性。本文繼續(xù)研究來自于中華稻蝗的另一株共生菌Fusariumsp. ZMT01固相培養(yǎng)代謝產(chǎn)物，共分離鑒定了8種化合物，分別為3-苯基-2-環(huán)戊烯-1-酮 (1)，2-羥基-3-苯基-2-環(huán)戊烯-1-酮 (2)，曲酸 (3)，曲酸單甲醚 (4)，(S)-5-羥基-2, 6-二甲基-4H-呋喃 [3, 4-g] 苯并吡喃-4, 8 (6H)-二酮 (5)，7, 8-二甲基苯并蝶啶-2, 4 (1H, 3H)-二酮(6), (9Z, 11E)-8,13-二羥基-9, 11-十八碳二烯酸(7)，豆甾- 7, 22-二烯-3β, 5α, 6α-三醇(8)。其中化合物1，2是首次以天然產(chǎn)物形式分離到，化合物2的波譜數(shù)據(jù)為首次報(bào)道，化合物5～7為首次從Fusarium屬分離到?；钚詼y試表明，化合物5對小麥赤霉菌 (FusariumgraminearumSchw.)和荔枝炭疽菌 (ColletotrichumgloeosporioidesPenz.)顯示強(qiáng)抗菌活性。

圖1 化合物1～8的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structures of compounds 1-8

1 結(jié)果與討論

化合物1的1H NMRδ7.68 (dd, 7.8, 2.4 Hz, 2H)，7.45～7.54 (m, 3H)表明分子中存在1個(gè)單取代苯環(huán)，3.06 (t, 4.8 Hz, 2H)，2.57 (t, 4.8 Hz, 2H)是2個(gè)連接在一起的亞甲基，6.59 (s, 1H)是雙鍵中的CH信號，同時(shí)表明與之相連的雙鍵碳為季碳。13C NMRδ209.6表明分子中存在1個(gè)酮羰基。以上結(jié)果結(jié)合質(zhì)譜，進(jìn)一步與文獻(xiàn)合成化合物3-苯基-2-環(huán)戊烯-1-酮波譜數(shù)據(jù)對照基本一致[7]，結(jié)構(gòu)得到確認(rèn)。該化合物以往未以天然產(chǎn)物的形式分離到過。

化合物2的1H NMRδ7.99 (d, 7.8 Hz, 2H), 7.46 (dd, 7.8, 7.2 Hz, 2H), 7.38 (t, 7.2 Hz, 1H)，表明分子中存在一個(gè)單取代苯環(huán)，2.87 (t, 4.8Hz, 2H), 2.48 (t, 4.8Hz, 2H)是兩個(gè)連接在一起的亞甲基，8.47(s, 1H)是OH信號，13C NMRδ202.8表明分子中存在1個(gè)酮羰基，剩余的不飽和碳表明分子中除了苯環(huán)外，還有1個(gè)雙鍵且該雙鍵的2個(gè)碳均為季碳。由此結(jié)合分子式，推測化合物2結(jié)構(gòu)為2-羥基-3-苯基-2-環(huán)戊烯-1-酮。進(jìn)一步測試熔點(diǎn)為192～194 ℃，與文獻(xiàn)對照基本一致[8]，結(jié)構(gòu)得到確定?；衔?以往未以天然產(chǎn)物的形式分離到過，其氫譜碳譜數(shù)據(jù)以往未見文獻(xiàn)報(bào)道。

化合物313C NMR數(shù)據(jù)表明分子中存在1個(gè)羰基，2個(gè)雙鍵，1H NMRδ4.29 (s, 2H) 結(jié)合13C NMR數(shù)據(jù)表明分子中存在1個(gè)與季碳連接的連羥基的亞甲基，1H NMRδ9.07 (s, 1H)是羥基信號，進(jìn)一步與相對分子質(zhì)量對照，表明分子還有1個(gè)氧原子且具有單環(huán)結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對照基本一致[9]，因此鑒定化合物3為曲酸。

化合物4的氫譜碳譜數(shù)據(jù)與化合物3十分類似，主要區(qū)別在于化合物41H NMR中少了δ9.07 (s, 1H) 的羥基信號，而多了3.64 (s, 3H) 的甲氧基信號，結(jié)合質(zhì)譜及13C NMRδ56.1的碳信號，表明化合物4為化合物3羥基甲醚化的產(chǎn)物。在此基礎(chǔ)上與文獻(xiàn)波譜數(shù)據(jù)對照基本一致[9]，鑒定為曲酸單甲醚。

化合物51H NMRδ2.52 (s, 1H) 為連不飽和雙鍵碳的甲基信號，5.73 (q, 6.6 Hz, 1H) 是連氧的次甲基，1.67 (d, 6.6 Hz, 3H) 是甲基，從偶合常數(shù)判斷與該次甲基相互連接，δ13.43 (s, 1H) 是羥基，δ6.37和7.83是兩個(gè)芳環(huán)質(zhì)子。13C NMRδ184.0是與雙鍵共軛的羰基碳信號，168.2是酯羰基，9.7, 18.2為甲基，76.5為連氧的次甲基, 剩余均為sp2雜化碳，由此結(jié)合分子量推斷該化合物可能為取代有2個(gè)甲基、1個(gè)羥基的色原酮并五元內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步與文獻(xiàn)波譜數(shù)據(jù)及比旋光度對照基本一致[10]，鑒定化合物5為(S)-5-羥基-2, 6-二甲基-4H-呋喃[3, 4-g] 苯并吡喃-4, 8 (6H)-二酮。

化合物6通過高分辨質(zhì)譜HRESIMSm/z: 243.0887 [M+H]+確定分子式為C12H10N4O2，不飽和度為10，1H NMR譜δ11.84 (s, 1H) 和11.67 (s, 1H) 是酰亞氨基質(zhì)子信號，δ7.92 (s, 1H)，δ7.71 (s, 1H)是芳香質(zhì)子信號，δ2.49 (s, 3H) 和δ2.46 (s, 3H) 是兩個(gè)甲基質(zhì)子信號。13C NMRδ160.7, 150.1為兩個(gè)酰亞胺羰基，20.2, 19.6為兩個(gè)甲基，剩余的芳香碳結(jié)合分子式及所含的氮原子數(shù)推測分子具有苯并蝶啶骨架，在此基礎(chǔ)上與文獻(xiàn)波譜數(shù)據(jù)對照基本一致[11]，鑒定化合物6為7, 8-二甲基苯并蝶啶-2, 4 (1H, 3H)-二酮。

化合物71H NMR譜δ6.51 (dd, 11.3, 15.2 Hz, 1H), 5.75 (dd, 15.1, 6.6Hz, 1H)為E式雙鍵， 6.05 (dd, 11.2, 11.0, 1H), 5.39 (dd, 9.0, 11.0, 1H)為Z式雙鍵，4.64 (dt, 6.6, 8.8, 1H), 4.19 (dt, 6.6, 6.8 Hz, H-13, 1H)為連羥基的CH，0.89 (t, 7.2, 3H)結(jié)合 1.31～2.34的信號表明分子骨架為一條長鏈，分子硅膠薄層層析展開拖尾，表明具有羧基，在此基礎(chǔ)上結(jié)合相對分子質(zhì)量推測可能結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)波譜數(shù)據(jù)對照基本一致[12]，鑒定為 (9Z, 11E)-8,13-二羥基-9, 11-十八碳二烯酸。

化合物8氫譜和碳譜數(shù)據(jù)表明屬于甾醇類化合物，δ5.24(dd, 15.0, 7.2 Hz, 1H), 5.18(dd, 15.0, 8.4 Hz, 1H)為甾醇側(cè)鏈的反式雙鍵，5.09(d, 2.4 Hz, 1H)是雙鍵質(zhì)子，0.99(d, 6.0 Hz, 3H), 0.88(d, 6.6 Hz, 3H), 0.82(d, 7.2 Hz, 3H), 0.80(d, 7.2 Hz, 3H)是4個(gè)連在CH上的甲基, 0.54(s, 3H)，0.91(s, 3H)是2個(gè)連在季碳上的甲基，4.50(d, 5.4 Hz, 1H), 4.23(d, 5.4 Hz, 1H), 3.59(s, 1H)在滴加重水后信號消失，表明為3個(gè)羥基，前兩者連接在CH上，后者連接在季碳上，在此基礎(chǔ)上與文獻(xiàn)波譜數(shù)據(jù)對照基本一致[13]，鑒定為豆甾-7, 22-二烯-3β, 5α, 6α-三醇。

用文獻(xiàn)二倍稀釋法[14]測試化合物1～7對小麥赤霉菌及荔枝炭疽菌活性(陽性對照三唑酮對兩菌最小抑菌濃度MIC分別為150和50 μg/mL)，結(jié)果表明化合物5對兩菌的MIC分別為150，50 μg/mL，與陽性對照持平。此外化合物6對兩菌MIC分別為300，200 μg/mL， 化合物3對荔枝炭疽菌的MIC為400 μg/mL，其余測試結(jié)果MIC均大于400 μg/mL。以上結(jié)果表明化合物5和6可作為抗上述植物病原真菌的先導(dǎo)化合物開展深入研究。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑與實(shí)驗(yàn)儀器

AV 600核磁共振波譜儀(Bruker Biospin AG)，MDS SCIEX APCI 2000液質(zhì)聯(lián)用儀，Horiba SEPA-300旋光儀，X4精密顯微熔點(diǎn)儀(北京中儀博騰科技有限公司)。GF254薄層層析硅膠、200～300目柱層析硅膠(青島海洋化工公司)，Sephadex LH-20凝膠(GE Healthcare)，其他常規(guī)試劑均為分析純。

2.2 菌種

真菌Fusariumsp. ZMT01分離自中華稻蝗的腸道，通過PCR擴(kuò)增真菌核糖體ITS基因區(qū)段并與NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫中編碼為KM231809.1菌株對比(相似度99%)得到鑒定[15]，植物病原菌小麥赤霉菌和荔枝炭疽菌引種自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，保藏于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院。

2.3 菌種發(fā)酵培養(yǎng)及分離

采用大米固相培養(yǎng)基 (1 000 mL 錐形瓶，每瓶含大米80 g，水100 mL) 靜置培養(yǎng)30 d，共培養(yǎng)100瓶。將培養(yǎng)物用乙醇提取4次，減壓濃縮，得到提取物35 g。提取物經(jīng)常規(guī)真菌代謝產(chǎn)物分離流程[16]，包括正相硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度淋洗分段，再經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，Sephadex LH-20凝膠色譜和重結(jié)晶純化后得到化合物1(18 mg)，2(15 mg)，3(8 mg)，4(8 mg)，5(6 mg)，6(15 mg)，7(12 mg)，8(25 mg)，9(100 mg)，10(80 mg)。

2.4 抗真菌活性測試

采用二倍稀釋法[14]測試化合物1～7對小麥赤霉、荔枝炭疽的抗菌活性，記錄結(jié)果時(shí)間為28 ℃下小麥赤霉菌培養(yǎng)24 h，荔枝炭疽菌培養(yǎng)48 h，用三唑酮作為抗真菌的陽性對照，無菌生長的樣品濃度即為最小抑菌濃度(MIC)值。

2.5 化合物的物理和波譜數(shù)據(jù)

化合物1：C11H10O，白色粉末狀固體，MS (ESI)m/z: 159.1 [M+H]+,1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.68 (dd, 7.8, 2.4 Hz, 2H), 7.45～7.54 (m, 3H), 6.59 (s, 1H), 3.06 (t, 4.8 Hz, 2H), 2.57 (t, 4.8 Hz, 2H)；13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ209.6, 174.1, 134.3, 131.5, 129.0, 127.6, 126.9, 35.4, 28.8。

化合物2：C11H10O2，白色粉末狀固體，θmp192～194 ℃, MS (ESI)m/z: 175.1 [M+H]+,1H NMR (600 MHz, acetone-d6)δ8.47(s, 1H), 7.99 (d, 7.8 Hz, 2H), 7.46 (dd, 7.8, 7.2 Hz, 2H), 7.38 (t, 7.2 Hz, 1H), 2.87 (t, 4.8Hz, 2H), 2.48 (t, 4.8Hz, 2H)；13C NMR (150 MHz, acetone-d6)δ202.8, 150.3, 137.2, 135.7, 129.6, 129.3, 128.2, 31.7, 23.7。

化合物3：C6H6O4，無色晶體，MS (ESI)m/z: 143.0 [M+H]+,1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ9.07 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 6.34 (s, 1H), 5.68 (s, 1H), 4.29 (s, 2H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ173.9, 168.1，145.7, 139.3, 109.9, 59.5。

化合物4: C7H8O4，無色針狀晶體，MS (ESI)m/z: 187.2 [M+H]+,1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ8.08 (s, 1H), 6.30 (s, 1H), 5.68 (s, 1H), 4.29 (s, 2H), 3.64 (s, 3H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ172.9, 168.1,147.9, 139.1, 109.9, 59.3, 56.1。

化合物6：C12H10N4O2，淡黃色無定型粉末。HRESIMSm/z: 243.088 7 [M+H]+,1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ11.84 (s, 1H), 11.67 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 2.49 (s, 3H), 2.46 (s, 3H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ160.7, 150.1, 146.5, 144.7, 141.6, 138.9, 138.4, 130.2, 128.7, 125.9, 20.2, 19.6。

化合物7: C18H32O4，黃色油狀物，MS (ESI)m/z: 313.2 [M+H]+,1H NMR (600 MHz, CDCl3):δ6.51 (dd, 11.3, 15.2 Hz, 1H), 6.05 (dd, 11.2, 11.0, 1H), 5.75 (dd, 15.1, 6.6 Hz, 1H), 5.39 (dd, 9.0, 11.09, 1H), 4.64 (dt, 6.6, 8.8, 1H), 4.19 (dt, 6.6, 6.8 Hz, H-13, 1H), 2.34 (t. 7.6 Hz, 2H), 1.64 (m, 2H), 1.62 (m, 1H), 1.56 (m, 1H), 1.52 (m, 1H), 1.49 (m, 1H), 1.37 (m, 6H). 1.31 (m, 6H), 0.89 (t, 7.2, 3H).13C NMR (125 MHz, CDCl3):δ165.8, 138.1, 134.1, 129.3, 125.1, 72.7, 67.7, 37.2, 37.0, 33.6, 31.7, 28.7, 28.6, 25.0, 24.8, 24.4, 22.6, 14.0。

化合物8：為無色針狀晶體。1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ5.24(dd, 15.0, 7.2 Hz, 1H), 5.18(dd, 15.0, 8.4 Hz, 1H), 5.09(d, 2.4 Hz, 1H), 4.50(d, 5.4 Hz, 1H), 4.23(d, 5.4 Hz, 1H), 3.77(m, 1H), 3.59(s, 1H), 3.38(brs, 1H), 2.04～1.84(m, 6H), 1.84～1.76(m, 1H), 1.69～1.63(m, 2H), 1.62～1.22(m, 11H), 0.99(d, 6.0 Hz, 3H), 0.91(s, 3H), 0.88(d, 6.6 Hz, 3H), 0.82(d, 7.2 Hz, 3H), 0.80(d, 7.2 Hz, 3H), 0.54 (s, 3H)；13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ139.61 135.42, 131.43, 119.37, 74.42, 72.23, 65.88, 55.32, 54.19, 43.03, 42.24, 42.03, 40.17, 40.02, 38.91, 36.62, 32.43, 31.24, 27.73, 22.58, 21.29, 21.04, 19.72, 19.43, 17.74, 17.29, 12.03。