董亞芬,申風(fēng)俊

(山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院消化科,太原 030001;*通訊作者,E-mail:919016603@qq.com)

肝纖維化是由各種急慢性肝臟損傷所導(dǎo)致的,以細(xì)胞外基質(zhì)在肝組織間質(zhì)過度沉積、降解減少所引起的一種病理改變,大量研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[1]?；钚匝醮?ROS)如超氧陰離子、過氧化氫或羥基自由基,是由先天免疫系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞“呼吸爆發(fā)”產(chǎn)生的,作為抵御入侵病原體的第一防御機(jī)制,是通過健康的肝臟產(chǎn)生幾種酶和非酶抗氧化系統(tǒng)來解毒的。但在肝臟疾病期間,這些抗氧化系統(tǒng)會(huì)變得枯竭,加劇肝臟炎癥[2],同時(shí)ROS在促進(jìn)自噬激活過程中起關(guān)鍵作用,因此抗氧化劑可顯著減少ROS的產(chǎn)生,阻止肝星狀細(xì)胞(HSC)活化過程中的自噬體和自噬通量的產(chǎn)生,從而起到抗纖維化的作用[3],因此抑制ROS介導(dǎo)的纖維生成可能產(chǎn)生巨大潛在的治療益處[4]。我們已知還原性谷胱甘肽(GSH)是主要的細(xì)胞抗氧化劑之一,能有效地清除氧自由基,解毒脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的親電性產(chǎn)物,并維持蛋白質(zhì)的巰基狀態(tài),增強(qiáng)抗氧化能力,從而減輕肝纖維化[5],恢復(fù)氧化應(yīng)激和抗氧化防御能力之間的平衡或者使其向抗氧化防御能力傾斜,可以保護(hù)肝臟免受進(jìn)一步的損傷,減緩或限制疾病的發(fā)展[6]。本實(shí)驗(yàn)通過建立四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化模型,測(cè)量肝纖維化形成過程中血清GSH、ROS水平,明確GSH及ROS在肝纖維化形成過程中的意義,以期為臨床防治肝纖維化提供新的理論依據(jù)與治療途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

清潔級(jí)健康雄性SD大鼠(180-210 g)購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;ROS比色法試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司;還原性谷胱甘肽比色法測(cè)試盒購于南京建成生物工程研究院;CCl4購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 動(dòng)物處理

將34只大鼠隨機(jī)分為2組,其中正常對(duì)照組6只,模型組28只,模型組給予皮下注射40% CCl4油劑,1周2次,對(duì)照組給予相同劑量油劑皮下注射,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。兩組大鼠均給予正常飲食。注射CCl4后的第2,4,6,8周各殺死模型組大鼠6只,模型組大鼠在建模5周及7周時(shí)各死亡2只,造模失敗,8周殺死對(duì)照組大鼠6只,留取血清及肝組織備用。

1.3 臨床病例

收集正常健康對(duì)照及乙肝肝硬化患者各20例,入選者禁食12-14 h,于晨起空腹采肘靜脈血5 ml注入試管中,4 ℃離心(3 000 r/min)分離血清,-80 ℃冰箱內(nèi)保存待測(cè)。正常健康組均為正常健康者并且無肝功能異常,肝炎病毒標(biāo)志均為陰性。乙肝肝硬化納入標(biāo)準(zhǔn):慢性乙型肝炎肝硬化的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《傳染病學(xué)(第8版)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn),即HBsAg陽性大于6個(gè)月,且目前HBsAg和/或HBV DNA仍為陽性,臨床表現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室檢查肝組織活檢影像學(xué)檢查證實(shí)存在肝硬化。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他肝炎病毒感染;②酒精性、藥物性、自身免疫等原因引起的肝硬化;③合并有肝臟以外的消化道疾病如感染、腹瀉或吸收不良等疾病;④合并肝臟以外的其他臟器功能障礙。

1.4 比色法測(cè)定血清中ROS及GSH濃度

血清ROS的檢測(cè):①根據(jù)ROS說明書配制標(biāo)準(zhǔn)品液;②加樣:向每個(gè)孔加入20 μl標(biāo)準(zhǔn)品或者待測(cè)樣品,向每個(gè)孔中加入100 μl底物工作液,并向每個(gè)孔中加入20 μl酶標(biāo)抗體工作液。搖動(dòng)和混勻后,將反應(yīng)板在37 ℃下放置15 min。③測(cè)值:在完成上述步驟后30 min內(nèi)使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度。④做標(biāo)準(zhǔn)曲線:以標(biāo)準(zhǔn)品2 000,1 000,500,250,125,62.5,31.2,0 nmol/ml為橫坐標(biāo),在縱坐標(biāo)上繪制OD值,并使用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。⑤根據(jù)樣本OD值分別計(jì)算相應(yīng)樣本的ROS的含量。

血清GSH檢測(cè):①根據(jù)GSH測(cè)試盒說明書測(cè)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液;②樣本前處理:取血清0.05 ml,加試劑一0.2 ml混勻,3 500 r/min,離心10 min,収上清液待測(cè);③加樣:根據(jù)說明書在空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測(cè)定孔中加入相應(yīng)的試劑,混勻,靜置5 min,405 nm處,酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值;④測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)OD值、空白OD值及病人血清OD值,再進(jìn)一步計(jì)算出血清中GSH的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理

肝組織HE染色、Masson三色染色結(jié)果顯示,正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞索排列整齊;模型組可見部分肝小葉結(jié)構(gòu)消失,纖維間隔包繞形成了假小葉,肝細(xì)胞可見大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖1)。

2.2 肝纖維形成過程中血清中ROS及GSH水平的變化

隨造模時(shí)間的延長(zhǎng),肝纖維化的逐漸形成和發(fā)展,血清ROS及GSH的水平整體呈增高的趨勢(shì),6周時(shí)達(dá)到最高,8周時(shí)有所下降,且模型組大鼠2,4,6,8周血清ROS均較對(duì)照組升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);GSH水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表1)。

2.3 正常組及肝硬化組血清ROS及GSH的變化

肝硬化患者血清ROS濃度明顯高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),肝硬化患者血清GSH濃度與正常組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

2.4 相關(guān)性分析

將大鼠血清中ROS與GSH結(jié)果進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析,結(jié)果顯示ROS與GSH之間存在正相關(guān)(r=0.81,P=0.006)。

圖1 肝組織HE染色、Masson三色染色 (×40)

表1 兩組血清ROS及GSH水平比較

Table 1 Comparison of ROS and GSH in serum between two groups

組別nROS(μg/ml)GSH(μmol/L) 對(duì)照組 模型組2周 模型組4周 模型組6周 模型組8周666661.56±0.841.84±0.69?1.72±0.65?2.48±1.14?1.82±0.46?15.58±8.4218.39±6.8017.17±6.5024.80±11.4018.23±4.58

與對(duì)照組相比,*P<0.05

組別nROS(μg/ml)GSH(μmol/L) 正常組 肝硬化組202055.01±40.0990.32±56.74?0.425±0.1070.577±0.233

與正常組比較,*P<0.05

3 討論

肝纖維化是一個(gè)病理生理過程,是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生。任何肝臟損傷在肝臟修復(fù)愈合的過程中都有肝纖維化的過程,如果損傷因素長(zhǎng)期不能去除,纖維化的過程長(zhǎng)期持續(xù)就會(huì)發(fā)展成肝硬化[7],無論其病因如何,肝纖維化通常以氧化組織損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、HSC激活和過度膠原沉積為特征[8]。大量的臨床經(jīng)驗(yàn)證實(shí),停止纖維化過程可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化。事實(shí)上,在去除病因后,可能會(huì)出現(xiàn)肝纖維化甚至肝硬化的解決方案[9,10],在一般情況下,修復(fù)氧化應(yīng)激和抗氧化能力之間的平衡,甚至向一個(gè)更強(qiáng)的抗氧化能力,能保護(hù)肝臟免受進(jìn)一步的損傷和延緩疾病進(jìn)展。ROS是參與肝纖維化發(fā)病機(jī)制的分子事件的介質(zhì),這些過程導(dǎo)致細(xì)胞損傷,并引發(fā)炎癥反應(yīng),釋放多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,觸發(fā)靜息的肝星狀細(xì)胞活化及轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞,進(jìn)而開始過度合成結(jié)締組織蛋白,特別是膠原,不受控制的廣泛纖維化導(dǎo)致肝小葉結(jié)構(gòu)變形,最終導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)的血清ROS的水平整體呈上升趨勢(shì),至8周末有所下降,可能是由于隨著肝臟功能的損害加重,抗氧化因子如GSH等被大量消耗,機(jī)體無法清除產(chǎn)生的大量ROS,導(dǎo)致其明顯升高,而在肝纖維化后期,眾多促肝纖維化激活因子的活化,使ROS的促纖維化作用弱化,表達(dá)水平下降,這一結(jié)論表明ROS在肝纖維化的形成過程中發(fā)揮著重要的作用。

還原性谷胱甘肽(GSH)是肝臟中合成的硫醇和三肽分子,是參與解毒的親電試劑和清除自由基,以及抑制ROS的形成,解毒反應(yīng)性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,維持蛋白質(zhì)巰基狀態(tài)的主要細(xì)胞抗氧化劑[9]。同時(shí)由于肝臟對(duì)谷胱甘肽周轉(zhuǎn)和器官間谷胱甘肽內(nèi)穩(wěn)態(tài)起主要作用,因此肝硬化不僅會(huì)影響谷胱甘肽的內(nèi)源性生產(chǎn)和利用,還會(huì)導(dǎo)致這種抗氧化營(yíng)養(yǎng)素的過度消耗,在生理?xiàng)l件下,谷胱甘肽還原酶利用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作為還原輔因子,將氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原回GSH,然而,在嚴(yán)重的氧化應(yīng)激中,當(dāng)谷胱甘肽還原酶的能力被抑制或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)被耗盡時(shí),GSSG的積累導(dǎo)致氧化還原防御能力降低[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果肝纖維化過程中血清還原性谷胱甘肽較對(duì)照組升高,但升高不明顯,可能與GSSG的積累相關(guān),GSH本身隨著肝纖維化的加重使其自身被耗竭,故血清中GSH僅輕度升高。

本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察了血清中GSH、ROS的動(dòng)態(tài)變化,ROS的可能有促纖維化作用,GSH可能有抗纖維化作用;此外本研究發(fā)現(xiàn)GSH及ROS存在正相關(guān)關(guān)系,說明可能存在GSH通過抑制ROS的產(chǎn)生,修復(fù)氧化應(yīng)激和抗氧化能力之間的平衡,來保護(hù)肝臟免受進(jìn)一步的損傷和延緩纖維化進(jìn)展,同時(shí)肝硬化患者血清GSH、ROS水平與健康正常者相比逐漸升高,這進(jìn)一步表明肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展可能與GSH、ROS有關(guān)。在肝硬化的治療中,GSH抗氧化能力降低和炎癥反應(yīng)增加,是臨床醫(yī)生應(yīng)該考慮的問題。由此可見早期使用抗氧化劑GSH可能作為肝纖維化治療的一個(gè)靶點(diǎn)。