崔憶旋,趙 報,李佳會,柳申成,孫 哲,吳 俊,丁曉嬌,張雙雙,朱晨露,王楠楠,周蘭柱,王文忠

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科,蚌埠 233000;*通訊作者,E-mail:lanzhu-07@163.com;#共同通訊作者,E-mail:13955259093@163.com)

頭頸部腫瘤在人類腫瘤中較常見,下咽癌(hypopharyngeal carcinoma)作為一種少見的惡性腫瘤,約占頭頸部惡性腫瘤的3%-5%[1],其病理類型以鱗狀細胞癌為主,腺樣細胞癌少見。下咽癌生物學特性惡劣,發(fā)生部位隱蔽難察覺,且極易發(fā)生頸部淋巴結轉移[2,3],預后差,生存率低。對于下咽癌的治療,目前,同步放化療與靶向藥物治療已經比較普遍,既能控制病情,同時也能保留咽喉部功能。壞死性凋亡(necroptosis)為一種程序性調控的細胞壞死[4],主要調控分子為受體相互作用蛋白1(RIP1)和受體相互作用蛋白3(RIP3),通過其級聯(lián)反應進行相調控。近年來,由于化療藥物的大量使用,腫瘤細胞的耐藥性在逐漸提高,其主要表現(xiàn)為對藥物促凋亡的敏感性降低。而壞死性凋亡可不通過凋亡通路發(fā)揮藥效,提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。紫草素(shikonin)是從紫草中提取的一種萘醌類物質[5]。已有研究表明,紫草素能夠誘導食管癌[6]、膠質瘤[7]、肝癌[5]等多種腫瘤細胞發(fā)生壞死性凋亡,該作用的好處是可有效規(guī)避在化療過程中的耐藥問題[8]。但是紫草素對下咽癌細胞的作用尚未進行探討,本實驗主要探討紫草素對下咽癌細胞(Fadu)的死亡形式的影響及其可能機制,為下咽癌的臨床治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人下咽癌細胞Fadu購自美國ATCC公司,培養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學院藥學院生化實驗室。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(含EDTA)購自公司美國Hyclone公司,胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司,MTT試劑、雙染細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin Ⅴ-FITC/PI)、BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云天公司,Bcl-2、Bax、RIP1、RIP3蛋白抗體購自美國CST公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人下咽癌細胞Fadu培養(yǎng)于含15 %胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MTT實驗檢測細胞增殖

取對數期生長狀態(tài)良好的Fadu細胞接種入96孔板,調整每孔培養(yǎng)液為100 μl,細胞數為1×105。待細胞貼壁后加入濃度分別為0,2,4,6,8,10 μmol/L的紫草素,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至24,48,72 h,每孔加入15 μl MTT溶液,MTT濃度為5 g/L,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,小心吸去培養(yǎng)液,每孔加入150 μl DMSO,繼續(xù)培養(yǎng)30 min,在490 nm波長處用檢測吸光度值(OD490)。計算細胞存活率:細胞存活率(%)=實驗組OD490/對照組OD490×100%。取平均值繪制藥物劑量效應曲線,計算藥物的半數抑制濃度(IC50)。

1.4 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡

選取對數期生長狀態(tài)良好的Fadu細胞,以每孔35×104個細胞接種于6孔板,待次日貼壁后加入濃度分別為0 μmol/L(空白孔)、2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L的紫草素后,5% CO2培養(yǎng)24 h,用不含EDTA的胰酶消化細胞,其中空白孔分為4份,分別空白對照組、PI組、Annexin Ⅴ-FITC組以及對照組。600g離心5 min,PBS清洗2次,加入200 μl Annexin Ⅴ-FITC結合液混勻,加入1.5 μl Annexin Ⅴ-FITC染色液輕輕混勻,避光冰浴15 min;加入1.5 μl PI染色液,避光冰浴5 min,加入200 μl Annexin Ⅴ-FITC結合液混勻。用流式細胞儀測出細胞凋亡率,此實驗重復3次。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達水平

將對數期生長狀態(tài)良好的Fadu細胞以不同濃度的紫草素處理,濃度分別為0 μmol/L(對照組),2,4,6 μmol/L。48 h將細胞消化至離心管,PBS洗滌兩遍后加入70 μmol含有PMSF的裂解液,冰上裂解30 min,放入4 ℃冰箱過夜,次日離心30 min(12 000 r/min,30 min),取上清液。BCA法測出蛋白濃度,并計算出每組樣本所需上樣量。將蛋白總量相同的樣本加入到蛋白凝膠內,90 V恒壓待溴酚藍到達分離膠的底部后終止。80 V恒壓將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜。室溫搖床下用5%脫脂奶粉封閉2 h,使用TPBS洗滌5 min,重復3次。按1∶1 000的比例稀釋β-actin、Bcl-2、Bax、RIP1、RIP3一抗,搖床搖晃1 h,4 ℃孵過夜。用HRP標記的山羊抗兔(二抗)孵育2 h,ECL發(fā)光試劑盒顯影。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0軟件對實驗結果進行分析,實驗數據均以均數±標準差表示,各組間差異采用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組間差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紫草素對Fadu細胞的增殖抑制作用

MTT結果顯示,隨紫草素濃度(0,2,4,6,8,10 μmol/L)的增加Fadu細胞存活率降低,且隨時間的增加(24,48,72 h),Fadu細胞存活率逐漸降低,表明紫草素對Fadu細胞的作用具有濃度依賴性和時間依賴性(見圖1)。作用24,48,72 h的IC50值分別為6.012,4.120,3.939 μmol/L,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖1)。

2.2 紫草素對Fadu細胞凋亡的影響

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染結果顯示,紫草素濃度為0(對照組),2,4,6 μmol/L時,細胞的凋亡率分別為13.75%±0.7%,29.7%±0.6%,42.1%±0.3%,53.1%±0.8%。隨著紫草素濃度的增加,細胞的凋亡率在增加,不同濃度紫草素組凋亡率與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖2)。由此可知,紫草素有誘導Fadu細胞凋亡作用。

2.3 紫草素對Fadu細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及壞死性凋亡相關蛋白RIP1、RIP3表達的影響

檢測結果表明,紫草素可下調凋亡抑制蛋白Bclκ2的表達和上調凋亡誘導蛋白Bax的表達進而誘導Fadu細胞凋亡,與此同時,上調壞死性凋亡的關鍵蛋白RIP1、RIP3誘導Fadu細胞發(fā)生壞死(P<0.05,見圖3)。

紫草素濃度4,6,8,10 μmol/L時3個時間點兩兩比較,*P<0.05

圖2 不同濃度紫草素對Fadu細胞凋亡的影響

3 討論

近年來隨著化療藥物的大量使用,腫瘤細胞耐藥性增強,臨床急需一種副作用小且抗癌作用強的藥物。相關研究表明,紫草素具有保肝、降血糖、抑菌、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)靜、免疫調節(jié)、抗腫瘤及促進傷口愈合[9,10]等作用。

本實驗的目的是探究紫草素對下咽癌細胞(Fadu)的增殖抑制和死亡形式的影響,由MTT實驗可看出,紫草素可隨時間和劑量抑制Fadu細胞的增殖。細胞凋亡的重要調控因子Bcl-2家族蛋白,包括凋亡抑制蛋白和凋亡誘導蛋白,前者主要有Bcl-2、Mcl1、Bcl-2XL等。凋亡抑制蛋白具有保持線粒體膜完整性的功能,而凋亡誘導蛋白能夠促使凋亡因子如細胞色素C、細胞凋亡誘導因子、第二線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑等的釋放,最終通過激活caspase激酶而導致細胞凋亡。本實驗采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法檢測紫草素對Fadu細胞凋亡的影響,結果發(fā)現(xiàn),紫草素能夠顯著誘導Fadu細胞發(fā)生凋亡,凋亡機制為下調凋亡抑制蛋白Bcl-2和上調凋亡誘導蛋白Bax的表達。壞死(necrosis)通常被視為意外和不受管制的細胞事件。然而,越來越多的證據表明,細胞凋亡等壞死可以通過調節(jié)機制來實施。Hitomi等[11]描述了一個廣泛的基因網絡,它介導一種稱為壞死性凋亡(necroptosis)的程序性壞死形式,其通過多種因子調節(jié),并且主要取決于RIP1的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。RIP1通過激酶依賴性和非依賴性功能調節(jié)細胞死亡和炎癥[12-14]。RIP1、RIP3最后通過磷酸化[15-17]的方式形成復合體(necrosome)[18],誘導細胞的壞死性凋亡。而本研究Western blot結果表明紫草素能夠上調壞死標志蛋白RIP1、RIP3蛋白的表達,表明紫草素可以誘導Fadu細胞發(fā)生壞死。

本實驗表明不同濃度紫草素對Fadu細胞有增殖抑制及誘導其凋亡和壞死的作用,規(guī)避了常規(guī)化療藥物會產生耐藥性的弊端,為下咽癌術前及術后化療提供了新思路,但詳細機制尚未得到進一步驗證,有待于后續(xù)試驗者證明。