徐 浩,趙朝華,高興春,米亞靜,王傲迪,茍興春

(西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,西安 710021;*通訊作者,E-mail:gouxingchun@189.cn)

急性一氧化碳中毒(acute carbon monoxide poisoning,ACMP)是最常見(jiàn)的急性中毒[1,2]。重度的ACMP除引起較嚴(yán)重的心、腦、肝等重要臟器的損傷外,肺損傷也逐漸引起臨床的高度關(guān)注。吸入CO可刺激和損傷呼吸道及肺組織,其中最明顯的肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、肺間質(zhì)淤血和肺水腫導(dǎo)致的肺彌散功能下降,而輕度的急性肺損傷(acute lung injury,ALI)在臨床中很難觀察到肺部的病變情況,但如不重視ACMP肺損傷,特別是肺水腫將進(jìn)一步加重ACMP性缺氧損害[3]。高壓氧艙(hyperbaric oxygen chamber,HOC)治療ACMP具有很好的療效,但是對(duì)于部分重度ACMP患者在實(shí)施HOC治療中或出倉(cāng)后常出現(xiàn)病情加重現(xiàn)象,有時(shí)需中斷或改用其他治療方式[3]。對(duì)于ACMP導(dǎo)致的ALI重度彌散性缺氧治療中,能否應(yīng)用非HOC和非呼吸道供氧方法一直是臨床醫(yī)學(xué)研究的重要方面。自1999年來(lái),高氧平衡鹽溶液(hyperoxygenated banlanced salt solution,HBS)作為液體輔助供氧方法已被廣泛用于多種缺氧疾病的治療,多篇文章報(bào)道HBS對(duì)ACMP性心和腦損傷有一有療效[4,5],但否能有效防治ACMP誘導(dǎo)的ALI國(guó)內(nèi)外均沒(méi)有類(lèi)似研究。本研究選用SD大鼠腹腔注射CO急性中毒模型,探討HBS對(duì)急性ACMP誘導(dǎo)的ALI的治療作用,為臨床合理應(yīng)用HBS治療ACMP提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及ACMP模型

雄性SD大鼠(10W-12W)30只(生產(chǎn)許可證號(hào):XAYXDS(陜)2018169),清潔級(jí),體質(zhì)量230-310 g,西安醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為5組,每組6只。正常對(duì)照組(NC組)、ACMP無(wú)治療對(duì)照組(模型組)、HBS中毒治療組(H組)。H組再依據(jù)單次靜脈輸注HBS溶積分為：HBS 10 ml/kg(HBS10組)、HBS 15 ml/kg(HBS15組)和HBS 20 ml/kg(HBS20組)。實(shí)驗(yàn)前各組大鼠禁飲禁食時(shí)間均為6 h,各HBS治療組和模型組大鼠分別依據(jù)體質(zhì)量,參照文獻(xiàn)[6，7]腹腔注射CO染毒方法,按120 ml/kg抽取純度為99.999%的CO氣體(陜西沁藍(lán)化工科技有限公司,批號(hào):SXXLC20171789)腹腔注射建立中毒模型,NC組腹腔注射等量空氣。各組動(dòng)物均于腹腔注射CO后即刻進(jìn)行尾靜脈穿刺,1 h后通過(guò)留置針連接TCI微量輸液泵恒速輸注各組液體,輸注時(shí)間為30 min。

1.2 HBS制備

按照Xu等[8]的方法，本研究采用復(fù)方醋酸鈉注射液200 ml為基液，以純氧2-3 L/min氧流量連接管道輸入GY-型高氧液體治療儀(專(zhuān)利號(hào)ZL99.2.53947.1，陜準(zhǔn)99第2560027號(hào),中國(guó))快速置換氧處理15 min，制備成液體溶解氧含量為(58.6±2.8)mg/L，同時(shí)含有O3溶解量為(13.4±2.6)g/ml的HBS，應(yīng)用便攜測(cè)氧儀測(cè)(thermo scientific orion starTM，美國(guó))得溶解氧含量達(dá)20.0-30.0 mg/L。

1.3 血?dú)鈾z測(cè)

NC組動(dòng)物于腹腔注射空氣后1.5 h從動(dòng)脈抽取血液0.3 ml,模型組與各HBS治療組分別在靜脈輸注不同劑量的治療液體后(腹腔注射CO后1.5 h)即刻采取動(dòng)脈血液0.3 ml,各實(shí)驗(yàn)組采血時(shí)間均相同,應(yīng)用血?dú)夥治鰞x(AVL Compact 3,丹麥羅氏公司)檢測(cè)PaO2,PaCO2的變化。

1.4 生化指標(biāo)檢測(cè)

各組大鼠于腹腔注射CO或空氣后24 h,取右肺中葉和復(fù)葉稱重,加入10倍生理鹽水研磨后,以4 000 r/min離心10 min后取上清液,參照TNF-α、IL-6檢測(cè)試劑盒(欣博盛有限公司,中國(guó))、MDA和T-SOD檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所,中國(guó))說(shuō)明書(shū)檢測(cè)步驟進(jìn)行。

1.5 肺組織病理學(xué)檢測(cè)

在麻醉狀態(tài)下所有動(dòng)物從左心室灌注生理鹽水500 ml和4%多聚甲醛后,取左肺置于4%甲醛溶液中固定48 h,經(jīng)脫水透明、浸蠟、包埋和切片,進(jìn)行HE染色光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

腹腔注射CO 120 ml/kg后10 min,模型組和各HBS組大鼠均出現(xiàn)不同程度的CO中毒現(xiàn)象,表現(xiàn)為撞籠和煩躁等現(xiàn)象。而CO中毒后15 min均出現(xiàn)睡眠、昏迷、抽搐或者癱瘓,口唇和耳緣呈明顯的櫻桃紅色,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)死亡。

2.1 HBS對(duì)PaO2和SaO2的影響

血?dú)鈹?shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果表明腹腔注射CO，各實(shí)驗(yàn)組大鼠的PaO2和SaO2與NC組比較呈現(xiàn)不同程度的降低(P<0.01)，其中模型組降低最明顯，SaO2由96.8%±2.5%下降到63.4%±2.3%，PaO2由(94.7±1.9)mmHg下降到(42.8±2.1)mmHg。HBS各組SaO2和PaO2與模型組比較均顯著提高(P<0.01)，其中HBS15和HBS20組的PaO2與HBS10組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖1，2)。

與NC組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01

與NC組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與HBS10組比較,△P<0.05

2.2 HBS對(duì)肺組織IL-6和TNF-α的影響

CO中毒各組大鼠肺組織IL-6和TNF-α含量與NC組比較均明顯升高(P<0.01)，但各HBS治療組IL-6和TNF-α含量顯著低于模型組,HBS10組與模型組比較明顯降低(P<0.05),HBS15組和HBS20組進(jìn)一步下降(P<0.01)。與HBS10組比較，HBS20組IL-6和TNF-α含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，HBS15組IL-6和TNF-α含量均低于HBS10組而高于HBS20組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，見(jiàn)表1)。

2.3 HBS對(duì)肺組織T-SOD和MDA的影響

檢測(cè)結(jié)果顯示,CO中毒能顯著降低肺組織T-SOD水平,同時(shí)增加MDA含量,各中毒組與NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。HBS治療組可提高肺組織T-SOD水平,降低MDA含量,各HBS組與模型組比較有明顯差異(P<0.05或P<0.01)。HBS20組T-SOD水平低于HBS10組,MDA含量高于HBS10組(P<0.05),HBS10和H5組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表2)。

組別nIL-6(pg/ml)TNF-α(pg/ml)NC組6 615.8±66.4149.3±15.8模型組61793.8±74.7?411.5±22.4?HBS10組61586.9±81.5?#362.2±22.2?#HBS15組61453.5±76.1?##328.6±19.8?##HBS20組61391.3±68.2?##△308.7±18.7?##△

與NC比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與HBS10組比較,△P<0.05

組別nT-SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)NC組6272.7±21.53.7±0.2模型組6136.9±22.6?5.5±0.3?HBS10組6165.8±17.9?#4.6±0.2?#HBS15組6178.5±23.8?##4.2±0.3?##HBS20組6196.3±21.2?##△3.7±0.3?##△

與NC比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與HBS10比較,△P<0.05

2.4 HBS對(duì)肝病理形態(tài)學(xué)的影響

急性CO中毒后,光鏡下模型組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡間質(zhì)和肺泡內(nèi)可見(jiàn)少量紅細(xì)胞和大量的炎性粒細(xì)胞聚積。HBS治療后肺泡滲出液和肺泡間質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞和炎性粒細(xì)胞明顯減少,HBS20組肺組織結(jié)構(gòu)基本接近正常,僅有少量粒細(xì)胞和紅細(xì)胞滲出(見(jiàn)圖3)。

3 討論

CO中毒是指短時(shí)間吸入過(guò)量CO與循環(huán)血液中的血紅蛋白(Hb)結(jié)合后,形成大于氧合血紅蛋白(HbO2)親和力200-300倍的碳氧血紅蛋白(HbCO),當(dāng)空氣中CO濃度超過(guò)0.05%,或達(dá)到百萬(wàn)分之667時(shí)可導(dǎo)致血液中50%的Hb轉(zhuǎn)變?yōu)镠bCO,從而引起全身嚴(yán)重的缺氧造成多器官的損害。早在1983年,Perrot等[9]首次報(bào)道了7例ACMP所致心衰竭原因是急性肺水腫,因而提示在ACMP治療過(guò)程中應(yīng)注意輸液量的控制。吸入的CO可刺激和損傷呼吸道,導(dǎo)致呼吸道黏膜急性充血、水腫、分泌物增加、氣道阻力增高,甚至誘發(fā)支氣管痙攣、肺水腫從而加重缺氧[10]。由ACMP引起肺水腫的誘發(fā)因素較多,其重要原因之一是CO可導(dǎo)致肺表面活性物質(zhì)功能下降,同時(shí)CO中毒性缺氧可引起肺血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加,肺微血管內(nèi)大量的液體進(jìn)入肺間質(zhì)造成肺間質(zhì)水腫而加重彌散性缺氧,肺水腫是CO中毒損傷的主要病理改變。

A.NC組；B.模型組；C.HBS10組；D.HBS15組；E.HBS20組

本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，ACMP能明顯降低PaO2和SaO2，肺組織T-SOD活性降低，MDA含量明顯升高，炎性因子IL-6和TNF-α含量釋放增多，提示ACMP性缺氧導(dǎo)致肺組織抗氧能力下降，而引發(fā)自由基與大量的炎性因子對(duì)肺泡壁及肺間質(zhì)進(jìn)一步損傷，從而加重肺水腫，本研究病理學(xué)表現(xiàn)為肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間質(zhì)和肺泡內(nèi)可見(jiàn)少量紅細(xì)胞和大量的炎性粒細(xì)胞聚積。進(jìn)入體內(nèi)的CO還進(jìn)一步與細(xì)胞色素還原型氧化酶二價(jià)鐵產(chǎn)生結(jié)合，從而阻斷電子傳遞鏈抑制細(xì)胞呼吸，這對(duì)機(jī)體各種細(xì)胞都具有毒性作用，因中毒機(jī)制比較復(fù)雜，至今尚未完全清楚。此外，CO中毒引起的缺氧能夠直接激活炎性細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，產(chǎn)生釋放多種自由基及炎性介質(zhì)啟動(dòng)全身炎癥反應(yīng)(systemic inflammatory response，SIRS)，重度ACMP還可引發(fā)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，肺臟作為MODS中最易受累的器官，提示在ACMP救治過(guò)程中應(yīng)特別重視急性肺損傷的預(yù)防和治療，以防止進(jìn)一步發(fā)展為MODS而危及患者生命[11,12]。

高壓氧(hyperbaric oxygen,HBO)治療ACMP具有很好的療效,其特點(diǎn)是具有清醒快、治愈率高、并發(fā)癥少優(yōu)點(diǎn),對(duì)于重癥ACMP應(yīng)給予充分HBO治療約20-30次治療中發(fā)現(xiàn)有部分病人在應(yīng)用HBO治療過(guò)程出現(xiàn)病情加重的現(xiàn)象,因此根據(jù)高HBO治療原則和部分臨床觀察,臨床上對(duì)于重癥ACMP伴發(fā)ARDS患者建議慎用HBO治療[13]。本研究采用含有高濃度溶解氧的HBS,其液體中溶解氧的含量達(dá)到55-60 mg/L,為臨床常用醫(yī)用液體如5%葡萄糖注射液、0.9%氯化鈉注射液或復(fù)方醋酸鈉注射液內(nèi)溶解氧含量3.5-3.8 mg/L高15倍以上[14]。大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果均表明,HBS對(duì)油酸、光氣、急性失血性休克、單肺通氣、低壓缺氧、心肺腦復(fù)蘇、心肌缺血、腦缺血等多種原因引起的缺血缺氧性損傷都顯示良好的治療效果,其主要作用機(jī)制是HBS進(jìn)血液能迅速增加血液溶解氧水平,從而提高PaO2和SaO2,緩解機(jī)體缺氧癥狀[15-17]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,應(yīng)用CO氣體腹腔注射的中毒方法,在CO中毒后30 min靜脈輸注HBS液體后,血液溶解氧的含量顯著升高,表現(xiàn)為各HBS組的PaO2和SaO2均明顯高于模型,并具有劑量依賴關(guān)系,而且PaO2的提高趨勢(shì)優(yōu)于SaO2,可能與COHb親和力強(qiáng)與解離速度慢有關(guān),然而PaO2的提高可明顯緩解機(jī)體的缺氧狀態(tài),緩解因ACMP而造成的缺氧損傷。本研究表明靜脈輸注HBS對(duì)CO中毒及其誘發(fā)的ALI具有很好的治療效果。