蘇 晨，吳 芳，劉 星，孫佳盼，張建寧，梁嘉文，陶 軍，張小宇

高血壓前期是動脈血壓介于正常血壓和高血壓之間的狀態(tài)，是指收縮壓介于120～139 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和/或舒張壓介于80～89 mmHg，《中國高血壓防治指南2018》稱之為正常血壓高值，是動脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)的重要危險因素[1-3]。大量研究表明，高血壓前期即可存在血管內(nèi)皮損傷，表現(xiàn)為血管內(nèi)皮功能障礙和內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整性的喪失[4]。血管內(nèi)皮損傷是高血壓及其相關(guān)ASCVD發(fā)生發(fā)展的始動環(huán)節(jié)和關(guān)鍵病理生理基礎[5]。因此，維持血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)態(tài)，促進血管內(nèi)皮損傷的修復，對于降低高血壓前期相關(guān)ASCVD的發(fā)生風險具有重要價值。

內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是骨髓源性血管內(nèi)皮細胞的前體，能遷移并黏附于損傷的血管內(nèi)壁，定向分化為成熟內(nèi)皮細胞，實現(xiàn)血管再內(nèi)皮化，是內(nèi)源性血管損傷修復的關(guān)鍵機制[6-7]。然而，在高血壓、衰老、糖尿病等多種心血管疾病危險因素存在時，循環(huán)EPCs內(nèi)皮修復能力低下[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓前期病人的循環(huán)EPCs數(shù)量減少，血管內(nèi)皮修復能力減退[10-11]。因此，積極尋找安全有效提高EPCs的再內(nèi)皮化能力方法，促進高血壓前期血管內(nèi)皮損傷的修復，有望在一定程度上降低高血壓及其相關(guān)ASCVD的發(fā)生風險。

黃連素是一種從傳統(tǒng)中草藥“黃連”中提取的異喹啉類生物堿，又名為“小檗堿”，長期在臨床上用于治療胃腸道感染和腹瀉[12-13]。近年來，越來越多的研究證實黃連素具有改善內(nèi)皮功能、保護血管、抗氧化等作用[14-15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃連素干預可以上調(diào)健康志愿者循環(huán)EPCs的數(shù)量和功能活性，改善內(nèi)皮功能[16-17]。趨化因子受體 4(chemokine receptor 4，CXCR4)目前被認為在EPCs的歸巢和損傷內(nèi)皮的再內(nèi)皮化中發(fā)揮重要作用[18]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)高血壓病病人EPCs的功能下降與CXCR4的下調(diào)有關(guān)[19]。黃連素是否能改善高血壓前期病人EPCs內(nèi)皮修復能力，及其是否與CXCR4相關(guān)尚不清楚。因此，本研究旨在探討黃連素對高血壓前期病人EPCs的內(nèi)皮修復能力的影響及其可能的機制，為黃連素的臨床應用提供新的實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 初次診斷為高血壓前期(診室血壓：收縮壓120 ～139 mmHg和/或舒張壓80～89 mmHg)且未服用任何藥物的病人10例，均為男性，平均血壓130.5/78.6 mmHg；年齡30～60(46.6±5.6)歲；不伴有其他心血管危險因素。本研究通過中山大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，所有入組研究對象知情同意并簽署知情同意書。

1.2 EPCs分離和培養(yǎng) 抽取高血壓前期病人30 mL外周靜脈血，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral mononuclear cells，PBMNCs)，并重懸于含20%胎牛血清及配套生長因子(EGM-2)的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(EBM-2)中，接種于細胞培養(yǎng)板，置于含5%CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每3 d更換1次新鮮培養(yǎng)基；于倒置相差顯微鏡下連續(xù)動態(tài)觀察細胞形態(tài)變化。培養(yǎng)至7 d左右的貼壁細胞即為實驗所用的EPCs。

1.3 EPCs的鑒定 取培養(yǎng)7 d的 EPCs，采用免疫熒光染色法和流式細胞技術(shù)進行鑒定。DiI-ac-LDL(美國Invitrogen公司)/FITC-lectin(美國Sigma公司)染色雙陽性鑒定為EPCs。流式細胞技術(shù)通過測定EPCs表面CD34、KDR、CD31(美國BD公司)表達鑒定EPCs。

1.4 黃連素預處理 黃連素原粉(美國圣地亞哥ALEXIS BIOCHEMICALS)溶于溶劑(50%甲醇和50%雙蒸水)，加入培養(yǎng)基后終濃度為2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，保證最終溶劑在培養(yǎng)基中濃度<1%。不同濃度黃連素預處理EPCs 8 h，用于后續(xù)實驗。

1.5 EPCs遷移功能實驗 將培養(yǎng) 7 d的 EPCs用0.25%胰酶消化，重懸于不含血清的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(EBM-2)中并進行細胞計數(shù)，采用Transwell法檢測EPCs的遷移功能。24孔板中加入 500 μL EBM-2 培養(yǎng)基及100 ng/mL SDF-1后置入改良Boyden小室，將2×104個EPCs加入改良Boyden小室上室。24孔板置于含5%CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)24 h，取走改良Boyden小室，4%多聚甲醛固定后用DAPI對細胞進行染色，倒置熒光顯微鏡下取5個視野觀察并計數(shù)24孔板中的細胞數(shù)。

1.6 EPCs黏附功能實驗 將用1 ng/mL腫瘤壞死因子-α(TNF-α)預處理12 h的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)接種于六孔板中，細胞密度為2×105/mL，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，EPCs消化重懸后用CellTracker-Dil熒光探針(美國ThermoFisher公司)進行孵育，并調(diào)整細胞密度至1×105/mL，加入上述HUVECs中，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育3 h，吸去未貼壁的細胞，4%多聚甲醛固定后用DAPI進行染色，倒置熒光顯微鏡下觀察并計算黏附于HUVECs的EPCs數(shù)量。

1.7 Western Blot實驗 采用 Western Blot 檢測不同濃度黃連素處理后CXCR4的表達水平。培養(yǎng)7 d的 EPCs 經(jīng)預冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后，用細胞裂解液于冰上裂解30 min，裂解產(chǎn)物離心(12 000 r/min離心20 min)后進行蛋白含量測定(BCA法)。取30 μg蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，用CXCR4抗體[CXCR4(1∶1 000)單克隆抗體，購自Abcam公司]識別結(jié)合，以相應的二抗和Bio-Rad凝膠成像儀檢測CXCR4蛋白表達。

1.8 頸動脈內(nèi)皮損傷模型的建立和EPCs再內(nèi)皮化能力的檢測 頸動脈內(nèi)皮損傷模型的建立參照既往已發(fā)表的文獻[18]。取8～10周齡雄性BALB/c-nu/nu裸鼠，體重約20 g，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，體視顯微鏡下分離頸總動脈及頸外動脈，采用直徑0.36 mm的冠狀動脈介入導絲在左頸總動脈內(nèi)旋轉(zhuǎn)并來回推送3次，損傷頸總動脈內(nèi)皮。建模成功后經(jīng)尾靜脈注入高血壓前期病人未處理和5.0 μmol/L 黃連素預處理的 EPCs。3 d后經(jīng)尾靜脈注射伊文思藍染色液(evans blue)，取出頸總動脈，將動脈條用生理鹽水沖洗干凈后縱向切開內(nèi)膜朝上置于載玻片上，正置顯微鏡拍照觀察再內(nèi)皮化情況，內(nèi)皮缺失處被伊文思藍染色液 染成藍色，內(nèi)皮完整部位不著色，利用Image J軟件對染色區(qū)域行定量分析。

1.9 Western Blot蛋白測定 采用 Western Blot 檢測不同濃度黃連素處理后CXCR4蛋白的表達情況。 培養(yǎng)7 d EPCs 經(jīng)預冷的PBS洗滌后，用細胞裂解液于冰上裂解 30 min。將全細胞裂解產(chǎn)物離心(12 000 r/min離心20 min)后進行蛋白含量測定。取30 μg蛋白進行 SDS-PAGE并轉(zhuǎn)膜，用CXCR4相應的特異性一抗[CXCR4(1∶1 000)單克隆抗體，購自Abcam公司]識別結(jié)合，以相應的熒光二抗和ECF蛋白印跡分析儀檢測CXCR4蛋白表達。

1.10 統(tǒng)計學處理 所有統(tǒng)計分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行，使用GraphPad Prism 8軟件繪制統(tǒng)計圖。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，單因素方差分析(ANOVA)進行多組間差異分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 高血壓前期病人EPCs的免疫熒光鑒定和流式細胞技術(shù)鑒定 培養(yǎng)7 d后，熒光顯微鏡下可以觀察到DiI-ac-LDL(紅)和FITC-UEA-1(綠)雙陽性的細胞，即培養(yǎng)的EPCs，藍色：核DAPI染色(見圖1A)。培養(yǎng)7 d的細胞經(jīng)流式細胞儀進行細胞表型檢測，結(jié)果：CD34(45.3±5.2)%，CD31(91.4±6.1)%，KDR(85.8±6.6)%，與本課題組和前期文獻報道[20-21]一致，鑒定為 EPCs(見圖1B)。

圖1 EPCs的免疫熒光及流式細胞鑒定

2.2 黃連素對高血壓前期病人EPCs遷移功能的影響 以不同濃度黃連素預處理高血壓前期病人EPCs 8 h，與對照組比較，2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L的黃連素預處理可明顯增加高血壓前期病人EPCs的遷移能力(P<0.05)，其中5 μmol/L組效果最為明顯。詳見圖2。

與對照組比較，*P<0.05，n=6

2.3 黃連素對高血壓前期病人EPCs黏附功能的影響 以不同濃度黃連素預處理高血壓前期病人EPCs 8 h，與對照組比較，2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L的黃連素預處理可明顯增加高血壓前期病人早期EPCs的黏附能力(P<0.05)，其中5 μmol/L組效果最為明顯。詳見圖3。

與對照組比較，*P<0.05，n=6

2.4 黃連素對高血壓前期病人EPCs血管內(nèi)皮修復能力的影響 建立裸鼠頸動脈內(nèi)皮拉脫損傷模型，移植未處理和5 μmol/L黃連素預處理的高血壓前期病人EPCs至頸動脈內(nèi)皮拉脫損傷模型裸鼠體內(nèi)，與未處理組比較，5 μmol/L黃連素預處理可明顯提高EPCs的在體再內(nèi)皮化能力(P<0.05)。詳見圖4。

與對照組比較，*P<0.05，n=6

2.5 黃連素對高血壓前期病人EPCs的CXCR4蛋白表達影響 以終濃度為2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L黃連素預處理高血壓前期病人EPCs 8 h后，Western Blot 檢測 EPCs 表面 CXCR4蛋白表達，結(jié)果顯示黃連素預處理可增加高血壓前期病人EPCs 的CXCR4蛋白表達(P<0.05)，其中5 μmol/L最為明顯，且CXCR4的增多趨勢與黃連素對EPCs的遷移和黏附的影響一致。詳見圖5。

與對照組比較，*P<0.05，n=6

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)高血壓前期病人存在著EPCs數(shù)量和功能下降，這可能是導致高血壓前期病人血管內(nèi)皮修復能力下降、血管內(nèi)皮損傷的細胞生物學機制之一[22-24]。因此尋找安全有效上調(diào)EPCs的再內(nèi)皮化能力的方法，是高血壓前期血管損傷修復的重要策略，對于減少高血壓前期病人遠期進展為高血壓及其相關(guān)血管疾病有重要意義。

黃連素自傳統(tǒng)中藥黃連中提取，在臨床上長期用于治療腸道感染和腹瀉，大量的研究證實黃連素具有降血壓、降血脂、抗動脈粥樣硬化相關(guān)炎癥等作用，在心腦血管疾病治療領域顯示出良好的應用前景[13，25-27]。但黃連素是否能改善高血壓前期病人EPCs的內(nèi)皮修復能力及其相關(guān)機制尚不清楚。

本研究招募初診斷未經(jīng)藥物治療的高血壓前期病人10例，探討了黃連素對高血壓前期病人EPCs體外遷移、黏附功能以及在體再內(nèi)皮化能力的影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，黃連素預處理后高血壓前期病人EPCs體外遷移和黏附功能明顯增強。同時，通過構(gòu)建裸鼠頸動脈內(nèi)皮拉脫損傷模型評價EPCs的再內(nèi)皮化能力，結(jié)果顯示經(jīng)黃連素預處理后的高血壓前期病人EPCs修復血管內(nèi)皮損傷的能力明顯改善。

國內(nèi)外以及課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)CXCR4在調(diào)控EPCs的歸巢和再內(nèi)皮化能力中發(fā)揮重要作用[18，21，28]。為了進一步探討黃連素改善高血壓前期病人EPCs血管內(nèi)皮修復能力的可能分子機制，本研究對黃連素處理后高血壓前期病人EPCs的CXCR4蛋白表達進行檢測，結(jié)果顯示不同濃度的黃連素處理后，EPCs表面的CXCR4蛋白表達明顯上調(diào)，提示黃連素改善高血壓前期EPCs的內(nèi)皮修復能力可能與促進CXCR4的表達有關(guān)。

本研究也存在一定局限性，首先僅在體外細胞實驗和動物實驗中觀察了黃連素對高血壓前期病人EPCs內(nèi)皮修復能力的影響，后續(xù)有待臨床研究進一步證實黃連素對高血壓前期病人的血管保護作用。其次對于黃連素改善高血壓前期病人EPCs修復能力的機制探討，僅測定了黃連素對CXCR4蛋白表達的影響，未進行進一步深入的探討。

綜上所述，本研究顯示，黃連素可以改善高血壓前期病人外周血EPCs的體外遷移和黏附功能以及體內(nèi)再內(nèi)皮化能力，CXCR4可能參與了黃連素對高血壓前期EPCs內(nèi)皮修復能力的影響。為黃連素改善高血壓前期EPCs血管損傷修復能力提供了新的實驗依據(jù)，為進一步發(fā)揮黃連素在高血壓及其ASCVD防治中的作用提供了新的證據(jù)。有關(guān)的臨床研究及具體機制仍有待進一步的探索。