鮮義坤1,李 果,李裕冬1,王承東,熊鐵一1,張貴權(quán)

(1.四川省自然資源科學(xué)研究院,四川 成都610041;2.大熊貓國(guó)家公園珍稀動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)國(guó)家林業(yè)和草業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 臥龍 623006；3.中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心,四川 臥龍623006)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)母乳不但具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和免疫功效,而且通過(guò)氣味方式傳遞某些信息,如引誘幼仔吸食等。目前，對(duì)圈養(yǎng)大熊貓乳汁的營(yíng)養(yǎng)成分[1-9]和活性物質(zhì)[10-12]已有部分研究,但揮發(fā)性有機(jī)成分和香氣成分國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

頂空(HS)—固相微萃取(SPME)技術(shù)始創(chuàng)于20世紀(jì)90年代,是一種分析揮發(fā)性化合物的前處理技術(shù);氣相色譜(GC)—質(zhì)譜(MS)聯(lián)用技術(shù)可對(duì)樣品中的揮發(fā)性組分進(jìn)行分離和鑒定。隨著這兩項(xiàng)技術(shù)的日臻完善,HS-SPME結(jié)合GC-MS開(kāi)辟了國(guó)內(nèi)外分析未知混合型揮發(fā)性成分的嶄新局面。由于具有操作簡(jiǎn)便、不加溶劑、用樣量少、靈敏度高、檢測(cè)高效、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn),HS-SPME-GC-MS分析法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥、化工、環(huán)保、探索生物奧秘、偵查案件等領(lǐng)域分析測(cè)定微量甚至痕量的揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)(VOCs)。鑒于大熊貓乳汁極為珍貴,樣品難以采集,本文在比較了多種分析測(cè)定方法的優(yōu)缺點(diǎn)之后,結(jié)合具體實(shí)際情況,優(yōu)選了當(dāng)今主流的HS-SPME-GC-MS方法用于測(cè)試圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的VOCs和香氣成分。

部分學(xué)者曾用HS-SPME-GC-MS方法分析過(guò)羊乳和牛乳中的揮發(fā)性化合物[13-15]、豬乳中的風(fēng)味物質(zhì)[16,17],為本項(xiàng)研究提供了可參考的方法。測(cè)試大熊貓乳汁中的VOCs,再細(xì)究VOCs中的香氣成分是在理論上探索大熊貓乳汁香氣成因和乳源性化學(xué)信息素的簡(jiǎn)捷路徑。本文旨在填補(bǔ)大熊貓乳汁香氣成分方面的資料空白,為研制圈養(yǎng)大熊貓幼仔專(zhuān)用誘食劑提供原料選擇的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試動(dòng)物

本文選擇4只健康狀況良好、泌乳機(jī)能正常的圈養(yǎng)大熊貓母獸(表1)作為研究對(duì)象。供試母獸飼養(yǎng)在中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心臥龍神樹(shù)坪基地(簡(jiǎn)稱(chēng)“大熊貓中心”),日糧以竹稈為主,以竹葉、窩窩頭、胡蘿卜、蘋(píng)果等為輔,自由采食和飲水,圈內(nèi)隨意活動(dòng),按照大熊貓中心既定的哺乳期飼養(yǎng)規(guī)程進(jìn)行日常飼喂和管理。

表1 供試大熊貓母獸基本信息與乳汁樣品采集日期

1.2 乳汁樣品采集、運(yùn)輸與保存

由大熊貓中心富有經(jīng)驗(yàn)的飼養(yǎng)員在大熊貓母獸非物理和非化學(xué)保定的狀態(tài)下采用人工擠乳法采集乳汁樣品。母獸產(chǎn)仔日期、人工采乳日期、采乳時(shí)母獸年齡與幼仔日齡、母獸呼名等基本信息見(jiàn)表1。乳樣直接擠入已清洗干凈并經(jīng)濕熱高溫(≥121℃,20min)滅菌除味的離心管(≥10mL)中,旋緊管帽,再用無(wú)味的封口膜纏繞帽口與管頸結(jié)合處數(shù)圈確保密封,以防止乳樣氣味散失和串入其他氣味;對(duì)乳樣管進(jìn)行標(biāo)注、登記、裝袋后盡快置于裝有20kg干冰的紙箱中,密封,采用汽車(chē)運(yùn)輸。上述樣品保存于四川省自然資源科學(xué)研究院種質(zhì)室-80℃冰箱中備用。根據(jù)免疫球蛋白含量的測(cè)定結(jié)果,有關(guān)文獻(xiàn)[11]認(rèn)為圈養(yǎng)大熊貓產(chǎn)后5天內(nèi)的乳汁才是真正意義上的初乳,5天后的乳汁應(yīng)為常乳。由表1可知,本文所用乳樣為產(chǎn)后10—56天的乳汁,屬常乳。

1.3 HS-SPME方法

取10mL乳樣置入20mL的頂空瓶中,加入3g NaCl(國(guó)產(chǎn)分析純,成都市科龍化工試劑廠),用密封墊和鋁蓋迅速密封頂空瓶,震蕩,以促進(jìn)NaCl溶解;將已老化的萃取頭(250℃下老化,SPME頭和手動(dòng)進(jìn)樣手柄均為美國(guó)Supelco公司出品)插入頂空瓶,推出萃取纖維頭至離液面約1cm處;將頂空瓶和萃取頭置于電熱恒溫水浴鍋內(nèi),固定,60℃或70℃分別頂空萃取1—4h(表2),其間每隔0.5h晃動(dòng)1次;縮回萃取纖維頭,拔出后快速插入GC進(jìn)樣口,推出萃取頭解吸。

表2 乳汁樣品與香氣成分的探尋方法

1.4 GC-MS聯(lián)用分析

測(cè)試方法一:GC-MS聯(lián)用儀為QP 2010Plus(日本島津公司)。方法為:①GC條件。色譜柱為非極性石英毛細(xì)管柱(美國(guó)Agilent公司),型號(hào)為DB-5MS,規(guī)格30m×0.25mm×0.25μm,柱箱溫度40℃,進(jìn)樣溫度270℃,進(jìn)樣模式不分流,進(jìn)樣時(shí)間1min,載氣為高純氦氣,流量控制模式壓力49.5kPa,總流量16.0mL/min、柱流量1.0mL/min、線(xiàn)流量36.1cm/s,吹掃流量進(jìn)樣模式5.0mL/min,分流比10.0;程序升溫模式的起始溫度40℃,保持5min,以5℃/min速率升溫至80℃,保持5min,再以10℃/min速率升溫至280℃,保持15min。②MS條件。接口溫度220℃,離子源溫度200℃,電離方式為EI,電子能量70eV,質(zhì)量掃描范圍(m/z)23—500。③數(shù)據(jù)處理。主要利用GC-MS工作站軟件和自帶NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)。定性檢測(cè)需組分質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖的匹配度≥80%,結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律,同時(shí)參照保留時(shí)間推定乳汁中的VOCs。定量檢測(cè)按峰面積歸一化法儀器自動(dòng)計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量。

測(cè)試方法二:GC-MS聯(lián)用儀為Agilent 7890B-5977B(美國(guó)Agilent公司)。方法為:①GC條件。色譜柱為強(qiáng)極性石英毛細(xì)管柱(美國(guó)Agilent公司),型號(hào)為HP-INNOWax,規(guī)格30m×0.25mm×0.25μm,進(jìn)樣口溫度為250℃,載氣為高純氦氣,柱流量0.80mL/min,進(jìn)樣模式為分流,分流比為5∶1;程序升溫模式的起始溫度45℃,保持2min,以5℃/min速率升溫至120℃,再以10℃/min速率升溫至200℃,最后以15℃/min速率升溫至280℃,保持10min,解吸3min。②MS條件。傳輸線(xiàn)接口溫度250℃,離子源溫度230℃,離子源為EI,電子能量70eV,四極桿溫度150℃,質(zhì)量掃描范圍20—450amu。③數(shù)據(jù)處理。將采集到的質(zhì)譜圖經(jīng)GC-MS配套的計(jì)算機(jī)自動(dòng)檢索,初步鑒定成分物質(zhì),再與Wiley第11版譜庫(kù)和NIST2014版+2017版Library中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行人工檢索匹配,結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律人工解譜,匹配度≥80%同時(shí)參照保留時(shí)間推定乳汁中的VOCs,按峰面積歸一化法儀器自動(dòng)計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量?；蛟S因?yàn)槿︷B(yǎng)大熊貓乳汁的特殊化學(xué)性質(zhì),在檢出后剔除從色譜柱和SPME頭上掉下的硅氧烷等“外來(lái)”物質(zhì),不計(jì)入統(tǒng)計(jì)分析。

乳汁樣品與測(cè)試方法:為了探尋出圈養(yǎng)大熊貓乳汁中較多的香氣成分,在HS-SPME-GC-MS分析的總方法下,對(duì)不同的乳樣采用了不同的HP-SPME處理和GC-MS方法(表2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼仔10日齡時(shí)“娜娜”乳汁中的VOCs

按表2進(jìn)行樣品前處理(SPME60℃,4h)和GC-MS方法一測(cè)試。經(jīng)儀器分析,圈養(yǎng)大熊貓“娜娜”在幼仔10日齡時(shí)乳汁中的VOCs組成見(jiàn)表3、圖1。

表3 圈養(yǎng)大熊貓“娜娜”在幼仔10日齡時(shí)乳汁中的VOCs

圖1 “娜娜”在幼仔10日齡時(shí)乳汁中VOCs總離子流色譜圖

共測(cè)試出30種VOCs,其中可確定(匹配度≥80%,下同)的VOCs有24種,分別是環(huán)戊烷、3-甲基丁醛、1,4-二甲基苯、α-氰基芐醇、1-辛烯-3-醇、苯酚、1,2,4-三甲基苯、1-甲基-5-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯、3-乙基-2-甲基-1,3-己二烯、反式-2-辛烯醛、壬醛、1-甲基-2-異丙基苯、4-烯苯基甲苯、反式-1-丁烯基苯、叔丁基苯、甘菊環(huán)、1,3-二乙基-4-甲基苯、2,3-二氫-1,3-二甲基-1H-茚、1,2,3,4,5-五甲基苯、1-甲基萘、2-甲基萘、2,3-二甲基萘、2-乙基萘、1-乙基萘,歸類(lèi)于醇1種、酚1種、醛3種、烷烴1種、烯烴2種、芳香烴15種、含氮化合物1種,有7種成分(匹配度<80%的成分未計(jì)入,下同)也存在于羊乳[14]或牛乳[14,15]或豬乳[16,17]中。由表3、圖1可知,在幼仔10日齡時(shí)“娜娜”乳汁中排前五位的VOCs相對(duì)含量合計(jì)達(dá)76.35%,由高到低依次是3-甲基丁醛(48.77%)、苯酚(14.72%)、1-甲基萘(4.79%)、3,5,5-三甲基-2-環(huán)己烯-1-酮(有待進(jìn)一步確定,4.20%)、甘菊環(huán)(3.87%)。對(duì)“娜娜”哺乳仔獸10日齡時(shí)乳汁香氣的形成可能起到主要或主導(dǎo)作用的成分是3-甲基丁醛和苯酚。3-甲基丁醛具有尖刺的、青香、巧克力樣香氣[18],苯酚具有酚樣、藥香氣[18],與我們品評(píng)的圈養(yǎng)大熊貓乳汁具有青香氣息[19]大致相符。

2.2 幼仔23日齡時(shí)“娜娜”乳汁1中的VOCs

按照表2進(jìn)行樣品前處理(SPME60℃,2h)和GC-MS方法二測(cè)試。經(jīng)儀器分析,圈養(yǎng)大熊貓“娜娜”在幼仔23日齡時(shí)乳汁中的VOCs組成見(jiàn)表4、圖2。

表4 圈養(yǎng)大熊貓“娜娜”在幼仔23日齡時(shí)乳汁1中的VOCs

注:—表示儀器未自動(dòng)算出，表5—8同。

共測(cè)試出36種VOCs,其中可確定的VOCs有22種,分別屬于醇5種、酚4種、醛4種、酮2種、羧酸4種、雜環(huán)化合物2種、烯烴1種,有12種成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或豬乳[17]中。由表4、圖2可知,在幼仔23日齡時(shí)“娜娜”乳汁中排前五位(含1個(gè)并列)的VOCs相對(duì)含量合計(jì)65.45%,由高到低依次是己醛(32.92%)、苯酚(9.92%)、2-甲基-3-丁烯-2-醇(7.58%)、1-戊烯-3-醇(5.73%)、己酸(4.65%)和戊醛(有待進(jìn)一步確定,4.65%)。對(duì)“娜娜”哺乳仔獸23日齡時(shí)乳汁香氣的形成可能起到主要或主導(dǎo)作用的成分是己醛和苯酚。己醛具有強(qiáng)烈的、青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香氣[18],苯酚具有酚樣、藥香氣[18],與我們品評(píng)的圈養(yǎng)大熊貓乳汁具有新鮮竹葉樣青香和新鮮竹稈樣青香[19]大致相符。在前一次VOCs測(cè)試分析的基礎(chǔ)上除3-乙基-2-甲基-1,3-己二烯、反式-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇、苯酚4種成分相同外,新發(fā)現(xiàn)了18種VOCs(匹配度<80%的成分未計(jì)入,下同),分別是:2-甲基-3-丁烯-2-醇、己醛、1-戊烯-3-醇、2-戊基呋喃、1-戊醇、1-辛烯-3-酮、2,3-辛二酮、順式-2-戊烯-1-醇、反式,反式-2,4-庚二烯醛、乙酸、苯甲醛、丁酸、己酸、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、2,6-雙(1,1-二甲基乙基)-4-(1-氧代丙基)苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、吲哚、苯甲酸。與上次測(cè)試相比,結(jié)果差異可能是因?yàn)椴捎昧瞬煌吞?hào)的SPME頭、不同極性的色譜柱、不同的泌乳時(shí)期以及不同廠家的GC-MS聯(lián)用儀所致。

圖2 “娜娜”在幼仔23日齡時(shí)乳汁1中VOCs總離子流色譜圖

2.3 幼仔23日齡時(shí)“娜娜”乳汁2中的VOCs

按表2進(jìn)行樣品前處理(SPME70℃,1h)和GC-MS方法二測(cè)試。經(jīng)儀器分析,圈養(yǎng)大熊貓“娜娜”在幼仔23日齡時(shí)乳汁中的VOCs組成見(jiàn)表5、圖3。

表5 圈養(yǎng)大熊貓“娜娜”在幼仔23日齡時(shí)乳汁2中的VOCs

共測(cè)試出30種VOCs,其中可確定的VOCs有20種,分別屬于醇3種、酚2種、醛4種、酮3種、羧酸5種、雜環(huán)化合物2種、烯烴1種,有12種成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或豬乳[17]中。由表5、圖3可知,在幼仔23日齡時(shí)“娜娜”乳汁中排前五位的VOCs相對(duì)含量合計(jì)為50.65%,由高到低依次為己醛(14.29%)、苯酚(13.01%)、戊醛(有待進(jìn)一步確定,10.27%)、己酸(6.58%)、1-辛烯-3-醇(6.50%)。對(duì)“娜娜”哺乳仔獸23日齡時(shí)乳汁香氣的形成可能起到主要或主導(dǎo)作用的成分是己醛和苯酚。己醛具有強(qiáng)烈的、青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香氣[18],苯酚具有酚樣、藥香氣[18],與我們品評(píng)的圈養(yǎng)大熊貓乳汁具有新鮮竹葉樣青香和新鮮竹稈樣青香[19]大致相符。在前兩次VOCs測(cè)試分析的基礎(chǔ)上又新發(fā)現(xiàn)了反式-2-戊烯醛、2-庚酮、2,5-辛二酮、順式-2-庚烯醛、順式-3-乙基-2-甲基-1,3-己二烯、辛酸6種VOCs。與上次測(cè)試相比,結(jié)果差異可能是因?yàn)镾PME溫度和時(shí)長(zhǎng)的不同所致。

2.4 幼仔56日齡時(shí)“嘉嘉”乳汁中的VOCs

按表2進(jìn)行樣品前處理(SPME70℃,2h)和GC-MS方法二測(cè)試。經(jīng)儀器分析,圈養(yǎng)大熊貓“嘉嘉”在幼仔56日齡時(shí)乳汁中的VOCs組成見(jiàn)表6、圖4。

圖3 “娜娜”在幼仔23日齡時(shí)乳汁2中VOCs總離子流色譜圖

表6 圈養(yǎng)大熊貓“嘉嘉”在幼仔56日齡時(shí)乳汁中的VOCs

共測(cè)試出20種VOCs,其中可確定的VOCs有10種,分別屬于酚1種、酮1種、羧酸4種、雜環(huán)化合物3種、芳香烴1種,有7種成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或豬乳[17]中。由表6、圖4可知,在幼仔56日齡時(shí)“嘉嘉”乳汁中排前五位的VOCs相對(duì)含量合計(jì)為99.18%,由高到低依次是2-丁酮(87.78%)、2-甲基-3-丁烯-2-醇(有待進(jìn)一步確定,4.21%)、3-戊酮(有待進(jìn)一步確定,3.54%)、己酸(2.81%)、苯酚(0.84%)。對(duì)“嘉嘉”哺乳仔獸56日齡時(shí)乳汁香氣的形成可能起到主要或主導(dǎo)作用的成分是2-丁酮。2-丁酮具有醚香、水果、樟腦、酮香氣[18],與我們品評(píng)的圈養(yǎng)大熊貓乳汁具有青香氣息[19]大致相符。在前三次VOCs測(cè)試分析的基礎(chǔ)上又新發(fā)現(xiàn)了2-丁酮、吡咯和1-甲基-2-吡咯烷酮3種VOCs。與上次測(cè)試相比,結(jié)果差異可能是因?yàn)閭€(gè)體遺傳、母獸年齡、泌乳階段、SPME時(shí)長(zhǎng)的不同所致。

圖4 “嘉嘉”在幼仔56日齡時(shí)乳汁中VOCs總離子流色譜圖

2.5 幼仔23日齡時(shí)“喜豆”乳汁中的VOCs

按表2進(jìn)行樣品前處理(SPME70℃,2h)和GC-MS方法二測(cè)試。經(jīng)儀器分析,圈養(yǎng)大熊貓“喜豆”在幼仔23日齡時(shí)乳汁中的VOCs組成見(jiàn)表7、圖5。

表7 圈養(yǎng)大熊貓“喜豆”在幼仔23日齡時(shí)乳汁中的VOCs

共測(cè)試出25種VOCs,其中可確定的VOCs有15種,分別屬于醇4種、酚2種、醛3種、酮1種、羧酸3種、雜環(huán)化合物1種、芳香烴1種,有11種成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或豬乳[17]中。由表7、圖5可知,在幼仔23日齡時(shí)“喜豆”乳汁中排前五位的VOCs相對(duì)含量合計(jì)為91.95%,由高到低依次是苯酚(46.15%)、己醛(18.87%)、2-戊酮(16.09%)、3-己烯-1-醇(5.97%)、己酸(4.87%)。對(duì)“喜豆”哺乳仔獸23日齡時(shí)乳汁香氣的形成可能起到主要或主導(dǎo)作用的成分是苯酚和己醛。苯酚具有酚樣、藥香氣[18],己醛具有強(qiáng)烈的、青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香氣[18],與我們品評(píng)的圈養(yǎng)大熊貓乳汁具有新鮮竹葉樣青香和新鮮竹稈樣青香[19]大致相符。在前四次VOCs測(cè)試分析的基礎(chǔ)上又新發(fā)現(xiàn)了乙醇、2-戊酮、1,3-二甲基苯、3-己烯-1-醇、苯甲醇、4-甲基苯酚、2,3-二氫苯并呋喃7種VOCs。與上次測(cè)試相比,結(jié)果差異可能是因?yàn)閭€(gè)體遺傳、母獸年齡、泌乳階段的不同所致。

圖5 “喜豆”在幼仔23日齡時(shí)乳汁中VOCs總離子流色譜圖

2.6 幼仔56日齡時(shí)“紳賓”乳汁中的VOCs

按照表2進(jìn)行樣品前處理(SPME60℃,4h)和GC-MS方法二測(cè)試。經(jīng)儀器分析,圈養(yǎng)大熊貓“紳賓”在幼仔56日齡時(shí)乳汁中的VOCs組成見(jiàn)表8、圖6。

表8 圈養(yǎng)大熊貓“紳賓”在幼仔56日齡時(shí)乳汁中的VOCs

(續(xù)表8)

序號(hào)保留時(shí)間(min)VOCs名稱(chēng)分子式分子量匹配度(%)相對(duì)含量(%)家畜乳汁中的檢出情況96.2583,7-二甲基癸烷C12H26170810.94106.521己醛C6H12O1009633.76牛乳[15]、豬乳[17]117.471十二酸甲酯C13H26O221481—127.735反式-2-戊烯醛C5H8O84870.72137.8651,4-二甲基苯C8H10106940.86羊乳和牛乳[14]、豬乳[17]148.6461-戊烯-3-醇C5H10O86721.91159.0882-庚酮C7H14O114890.92牛乳[15]169.163庚醛C7H14O114831.02179.243十二烷C12H26170911.56牛乳[14]189.5812-甲基十二烷C13H28184760.561910.1232-己烯醛C6H10O9883—2010.4172-戊基呋喃C9H14O138941.792110.5614,5-二甲基壬烷C11H24156741.642211.0541-戊醇C5H12O88904.03牛乳[15]2311.4771-甲基-2-異丙基苯C10H14134940.412411.9342-辛酮C8H16O12887—2512.079十五烷C15H32212491.04羊乳和牛乳[14]2612.4221-辛烯-3-酮C8H14O126781.102713.029反式-2-庚烯醛C7H12O112931.542813.1192,3-辛二酮C8H14O2142722.952914.900壬醛C9H18O142901.76羊乳[14]、牛乳[15]3015.2733-辛烯-2-酮C8H14O126870.343115.517順式-3-乙基-2-甲基-1,3-己二烯C9H16124870.613215.8602-辛烯醛C8H14O126962.823316.4271-辛烯-3-醇C8H16O128904.423416.5171-庚醇C7H16O116720.703516.845反式,反式-2,4-庚二烯醛C7H10O110950.333617.303乙酸C2H4O260640.33羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]、豬乳[17]3717.5472,4-庚二烯醛C7H10O110900.233818.2033,5-辛二烯-2-酮C8H12O124720.283918.353苯甲醛C7H6O106952.38羊乳和牛乳[14]、牛乳[17]4019.0741-辛醇C8H18O130910.554119.432反式,反式-3,5-辛二烯-2-酮C8H12O124300.454220.358苯甲腈C7H5N10383—牛乳[15]、豬乳[16]也檢出腈類(lèi)化合物4320.492反式-2-辛烯-1-醇C8H16O128500.304421.2931-壬烯-4-醇C9H18O142500.254521.373丁酸C4H8O288810.34羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]、豬乳[17]4621.631己酸烯丙酯C9H16O2156722.454722.507反式,反式-2,4-壬二烯醛C9H14O13850—豬乳[16,17]4823.567N-乙烯基吡咯烷酮C6H9NO11156—4923.9452-庚基呋喃C11H18O166640.665024.860反式,反式-2,4-癸二烯醛C10H16O152450.88牛乳[15]、豬乳[17]5125.890己酸C6H12O2116803.12羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]、豬乳[17]5226.129苯甲醇C7H8O10897—5327.497庚酸C7H14O213064—羊乳[13]、羊乳和牛乳[14]5428.084苯酚C6H6O94900.47羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]5528.303γ-壬內(nèi)酯C9H16O2156870.56牛乳[15]5628.861辛酸C8H16O2144970.56羊乳[13]、羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]、豬乳[17]5730.045壬酸C9H18O2158830.18羊乳[13]、羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]5830.249δ-壬內(nèi)酯C9H16O2156870.265931.129癸酸C10H20O2172940.19羊乳[13]、羊乳和牛乳[14]、牛乳[15]、豬乳[17]6032.776吲哚C8H7N11790—羊乳[14]

共測(cè)試出60種VOCs,其中可確定的VOCs有39種,分別屬于醇4種、酚1種、醛11種、酮4種、羧酸5種、酯1種、內(nèi)酯2種、雜環(huán)化合物3種、含氮化合物1種、烷烴4種、烯烴1種、芳香烴2種,有17種成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或豬乳[17]中。

由表8、圖6可知,在幼仔56日齡時(shí)“紳賓”乳汁中排前五位的VOCs含量合計(jì)為54.45%,由高到低依次是己醛(33.76%)、2-丁酮(8.69%)、1-辛烯-3-醇(4.42%)、1-戊醇(4.03%)、戊醛(3.55%)。對(duì)“紳賓”哺乳仔獸56日齡時(shí)乳汁香氣的形成可能起到主要或主導(dǎo)作用的成分是己醛和2-丁酮。己醛具有強(qiáng)烈的青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香氣[18],2-丁酮具有醚香、水果、樟腦、酮香氣[18],與我們品評(píng)的圈養(yǎng)大熊貓乳汁具有新鮮竹葉樣青香和新鮮竹稈樣青香[19]大致相符。在前五次VOCs測(cè)試分析的基礎(chǔ)上又新發(fā)現(xiàn)了20種VOCs,分別是2-乙基呋喃、戊醛、3,6-二甲基癸烷、5-甲基癸烷、3,7-二甲基癸烷、十二酸甲酯、庚醛、十二烷、2-己烯醛、2-辛酮、反式-2-庚烯醛、3-辛烯-2-酮、2-辛烯醛、2,4-庚二烯醛、1-辛醇、苯甲腈、γ-壬內(nèi)酯、壬酸、δ-壬內(nèi)酯、癸酸。與上次測(cè)試相比,結(jié)果差異可能是因?yàn)閭€(gè)體遺傳、母獸年齡、泌乳階段、SPME時(shí)長(zhǎng)不同和嗅感香氣較強(qiáng)所致。

圖6 “紳賓”在幼仔56日齡時(shí)乳汁中VOCs總離子流色譜圖

2.7 圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的香氣成分

綜上所述,通過(guò)不同型號(hào)的SPME頭、不同的SPME溫度和時(shí)長(zhǎng)、不同的GC-MS聯(lián)用儀、不同類(lèi)型的毛細(xì)管柱、不同的程序升溫等乳樣前處理和儀器分析關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的變化對(duì)不同個(gè)體、不同年齡、不同泌乳階段、新鮮或不同凍藏天數(shù)的圈養(yǎng)大熊貓乳汁進(jìn)行了測(cè)試,旨在較多地探尋出圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的VOCs數(shù)量。上述6次測(cè)試結(jié)果共計(jì)測(cè)出112種VOCs(未計(jì)相互之間重復(fù)的成分),其中可確定的VOCs共有78種,分別屬于醇9種、酚5種、醛14種、酮8種、羧酸7種、酯1種、內(nèi)酯2種、雜環(huán)化合物6種、含氮化合物2種、烷烴5種、烯烴3種、芳香烴16種,可見(jiàn)圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的VOCs以芳香烴類(lèi)、醛類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)、羧酸類(lèi)等為主;有28種成分也存在于羊乳[13,14]或牛乳[14,15]或豬乳[16,17]中,分別屬于醇1種、酚4種、醛5種、酮3種、羧酸7種、內(nèi)酯1種、雜環(huán)化合物1種、烷烴1種、芳香烴5種,說(shuō)明大熊貓乳汁與家畜乳汁(羊乳或牛乳或豬乳)既有相同的成分,又存在50種VOCs的較大差異,這可能是因?yàn)榉N間遺傳、食物結(jié)構(gòu)、代謝類(lèi)型及分析方法等不同所致,也可能是大熊貓乳汁香氣與羊乳香氣、牛乳香氣、豬乳香氣有差異的直接原因。若將上述6次測(cè)試結(jié)果(表3—8、圖1—6)的VOCs相對(duì)含量排前五位的成分合并進(jìn)行算術(shù)平均計(jì)算,表明在幼仔10—56日齡時(shí)6—14歲的圈養(yǎng)大熊貓乳汁中平均相對(duì)含量較高(前十位)的VOCs是:己醛(16.64%)、2-丁酮(16.08%)、苯酚(14.11%)、3-甲基丁醛(8.13%)、己酸(3.15%)、戊醛(3.08%)、2-戊酮(2.68%)、2-甲基-3-丁烯-2-醇(1.97%)、1-辛烯-3-醇(1.82%)、3-己烯-1-醇(1.00%),這些成分對(duì)圈養(yǎng)大熊貓乳汁主要香氣韻調(diào)的形成可能起到主要或主導(dǎo)作用,由此可知醛類(lèi)(27.85%)和酮類(lèi)(18.76%)是圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣的重要貢獻(xiàn)物質(zhì)種類(lèi)。

從圈養(yǎng)大熊貓乳汁中測(cè)出的VOCs幾乎都有一定的氣味，或淡或濃，或香或臭，但有些氣味物質(zhì)沒(méi)有通過(guò)甚至沒(méi)有進(jìn)行食品安全評(píng)估，不能用作食品級(jí)單體香原料。圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的香氣成分是從上述測(cè)定的112種VOCs中篩選出國(guó)際國(guó)內(nèi)公認(rèn)、法規(guī)允許在食品中添加并可購(gòu)買(mǎi)的單體呈香物質(zhì)(即狹義上的香氣成分，下同)見(jiàn)表9。結(jié)果顯示:圈養(yǎng)大熊貓乳汁中可確定的香氣成分有46種,分別歸類(lèi)于醇9種、酚3種、醛12種、酮7種、羧酸7種、酯1種、內(nèi)酯2種、雜環(huán)化合物4種、芳香烴1種,可見(jiàn)圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的香氣成分以醛類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)、羧酸類(lèi)、雜環(huán)化合物等為主,醛類(lèi)香氣成分對(duì)圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣的形成可能起到重大作用。

表9 圈養(yǎng)大熊貓乳汁中測(cè)出的香氣成分、香氣特征及其國(guó)內(nèi)外食品應(yīng)用的法規(guī)狀態(tài)

(續(xù)表9)

香氣成分測(cè)出的圈養(yǎng)大熊貓乳樣編號(hào)123456FEMA編號(hào)香氣特征[18,20-23]國(guó)內(nèi)外食品應(yīng)用的法規(guī)狀態(tài)中國(guó)美國(guó)歐盟日本反式-2-辛烯醛※※?3215尖刺的、脂肪、肉香、青香氣√√√√壬醛※???※※2782脂肪、花香、蠟香、柑橘香氣√√√√1-甲基萘※3193類(lèi)似萘、樟腦香氣√√××2-乙基呋喃?※3673豆香、面包、麥芽、溶劑樣、焦糊香氣√√×√2-甲基-3-丁烯-2-醇※※??無(wú)××√×己醛※※※※2557強(qiáng)烈的、青香、木香、草香、蔬菜、肉香、水果香氣√√√√2-庚酮?※?※2544水果、青香、奶油、奶酪香氣√√√√1-戊烯-3-醇※???3584尖刺的、蔬菜、熱帶水果、芥末香氣√√√√2-戊基呋喃※※※3317果香、青香、壤香、骨粉香、根香香氣√√√√1-戊醇※※※※2056蘋(píng)果、香蕉、酵母、酒香香氣√√√√1-辛烯-3-酮※※??3515蘑菇、油膩的氣息√√√√2,3-辛二酮※??4060甜的、奶油香√√√√順式-2-戊烯-1-醇※4305香蕉、青香、橡膠氣息×√√×3-辛烯-2-酮??※3416壤香、蘑菇、肉、椰子香氣√√√√反式,反式-2,4-庚二烯醛※※3164青香、脂肪、水果、辛香香氣√√√√乙酸※※※??2006尖刺的、醋香氣√√√√苯甲醛※※?※※2127杏仁、果香、粉香、堅(jiān)果香氣√√√√丁酸※※※※※2221牛奶、奶油、黃油、奶酪、果香香氣√√√√己酸※※※※※2559強(qiáng)烈的、腐臭奶酪香氣√√√√2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚※2184烘烤谷物香氣,抗氧化劑、防腐劑╳×√××辛酸?※※※※2799甜的、干酪、脂肪、青草、油脂香氣√√√√壬酸?※2784脂肪、蠟、奶酪、椰子香氣√√√√吲哚※※※※2593溫和的、動(dòng)物糞便香氣√√√√苯甲酸※※2131極弱的膏香√√√×2-丁酮?※※2170醚香、水果、樟腦、酮香氣√√√√戊醛??※3098令人愉快的、面包、巧克力香氣√√√√吡咯※3386甜的、令人作嘔的香氣√√√√乙醇※2419有酒的氣息╳×√√×2-戊酮※2842甜的、醚香、香蕉、水果香氣√√√√3-己烯-1-醇※無(wú)藥草香氣××√√苯甲醇※※2137甜的、花香、果香香氣√√√√4-甲基苯酚※2337藥、酚樣香氣√√√√十二酸甲酯※2715蠟、油、奶油、椰子、蘑菇、葡萄酒、脂肪香氣√√√√2-己烯醛※2560青香、辛香、蘋(píng)果、脂肪、青草、醛香香氣√√√√2-辛酮※2802脂肪、花香、青香、牛奶、奶酪香氣√√√√反式-2-庚烯醛※3165青香、果香、脂肪、肉香、家禽香氣√√√√2-辛烯醛※3215尖刺的、脂肪、肉香、青香氣√√√√2,4-庚二烯醛※3164青香、脂肪、水果、辛香香氣√√√√1-辛醇※2800青香、柑橘、甜橙、醛香、甜花香、蠟香香氣√√√√γ-壬內(nèi)酯※2781脂肪、椰子、奶油香氣√√√√δ-壬內(nèi)酯※3356甜的、椰子、脂肪、牛奶、奶油、堅(jiān)果香氣√√√√癸酸※2364脂肪、腐臭的香氣√√√√具※/有FEMA編號(hào)/√物質(zhì)總數(shù)61915813304441444340具?/無(wú)FEMA編號(hào)/╳物質(zhì)總數(shù)17646425236合計(jì)呈香物質(zhì)總數(shù)726211219344646464646

注:香氣成分僅限于可在食品中使用的、已商品化的單體呈香物質(zhì)即單體香原料,以本文表3—8出現(xiàn)的先后為序;FEMA為Flavor and Extract Manufactures Association of the United States的縮寫(xiě),FEMA編號(hào)在國(guó)際上普遍采用;國(guó)內(nèi)外食品應(yīng)用的法規(guī)狀態(tài)匯總資料來(lái)源于我國(guó)臺(tái)灣香料協(xié)會(huì),2017年12月22日網(wǎng)上發(fā)布;※表示匹配度≥80%;?表示匹配度<80%;√表示允許食品中使用;×表示禁止食品中使用。

3 討論

3.1 圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣成因

圈養(yǎng)大熊貓乳汁是有香氣的。我們?cè)鴮?duì)7只圈養(yǎng)大熊貓的乳汁進(jìn)行過(guò)香氣品鑒,含有新鮮竹葉樣青香、新鮮竹稈樣青香、乳香氣、奶腥氣、乳脂香、奶甜氣、酸香氣等[19]。測(cè)試結(jié)果表明，圈養(yǎng)大熊貓乳汁的這些香氣均有物質(zhì)基礎(chǔ),盡管呈香物質(zhì)的探尋還不徹底,某些香氣成分種類(lèi)可能還不全面,但基本能說(shuō)明圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣形成的直接物質(zhì)原因。從表9可知,具有青香氣息的物質(zhì)最多,達(dá)14種,分別是:3-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇、反式-2-辛烯醛、己醛、2-庚酮、2-戊基呋喃、反式,反式-2,4-庚二烯醛、辛酸、2-己烯醛、2-辛酮、反式-2-庚烯醛、2-辛烯醛、2,4-庚二烯醛、1-辛醇,其中己醛為圈養(yǎng)大熊貓乳汁中平均相對(duì)含量(6次測(cè)試的算術(shù)平均值)最高的香氣成分,因其香氣閾值較低,對(duì)圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣有重大貢獻(xiàn),這就不難解釋為什么圈養(yǎng)大熊貓乳汁具有較強(qiáng)的新鮮竹葉樣青香氣和新鮮竹稈樣青香氣,這些成分可能共同構(gòu)成了圈養(yǎng)大熊貓乳汁的特征性香氣。乳香氣可能與丁酸、己酸、δ-壬內(nèi)酯、癸酸等有關(guān),奶腥氣可能與己醛、2-己烯醛[24]、1-戊烯-3-醇、1-辛烯-3-醇[25]等有關(guān),乳脂香氣可能與庚醛、反式-2-辛烯醛、壬醛、反式,反式-2,4-庚二烯醛、辛酸、壬酸、2-己烯醛、2-辛酮、反式-2-庚烯醛、2-辛烯醛、2,4-庚二烯醛、γ-壬內(nèi)酯、δ-壬內(nèi)酯、癸酸等有關(guān),奶甜氣可能與2,3-辛二酮、辛酸、吡咯、2-戊酮、苯甲醇、1-辛醇、δ-壬內(nèi)酯等有關(guān),酸香氣主要與乙酸等揮發(fā)性羧酸有關(guān)?？梢?jiàn)圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的某種香氣并非單獨(dú)由1種香氣成分引起,而是多種呈香物質(zhì)相互作用(協(xié)同增效或抵消減弱)結(jié)果的綜合表象。圈養(yǎng)大熊貓個(gè)體間乳汁香氣可能因?yàn)檫z傳、年齡、泌乳階段、食物結(jié)構(gòu)等因素的不同而存在一定差異[19],是因?yàn)椴煌谌殡A段、不同年齡、不同個(gè)體的VOCs種類(lèi)數(shù)量及其相對(duì)含量不盡相同所致(表3—8),這在圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣成分的探尋結(jié)果得到驗(yàn)證(表9)。這些香氣成分可能來(lái)源于圈養(yǎng)大熊貓機(jī)體尤其是母獸乳腺物質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物或最終產(chǎn)物,也可能從食物中經(jīng)機(jī)體血液轉(zhuǎn)移到乳汁中[26]。

3.2 圈養(yǎng)大熊貓乳源性化學(xué)信息素芻議

用HS-SPME-GC-MS法從圈養(yǎng)大熊貓乳汁中測(cè)定出的有機(jī)化學(xué)物質(zhì)和香氣成分都有揮發(fā)的物理特性,不但可在空氣中向外擴(kuò)散,而且香氣成分還有不同韻調(diào)、不同強(qiáng)度的香氣,可向幼仔傳遞某些信息,因此圈養(yǎng)大熊貓乳汁的香氣具備化學(xué)信息素的功能,稱(chēng)之為乳源性化學(xué)信息素。表9中選列出的呈香物質(zhì)多為調(diào)香師常用的單體香原料，我們的調(diào)香實(shí)踐證實(shí)，即使呈香物質(zhì)數(shù)量相同,只要有1種呈香物質(zhì)添加量不一樣,香氣就有一定程度的差異,甚至香型發(fā)生改變。圈養(yǎng)大熊貓乳汁中如此多的呈香物質(zhì)再加上每種呈香物質(zhì)的含量變化可組編出很多種不同韻調(diào)的香氣,形成不同個(gè)體、不同年齡、不同泌乳階段的個(gè)性化香氣或特征性香氣。據(jù)此認(rèn)為圈養(yǎng)大熊貓乳源性化學(xué)信息素并非簡(jiǎn)單的1種呈香物質(zhì),而是由多種揮發(fā)性呈香物質(zhì)組成的,以某種香氣形式供幼仔憑借日益發(fā)育成熟的嗅覺(jué)來(lái)感知和識(shí)別,達(dá)到遺留標(biāo)記或傳遞某種信息的目的。大熊貓成體的視力較差[27],幼體的嗅覺(jué)發(fā)育早于聽(tīng)覺(jué)和視覺(jué)[28],由于幼仔熟悉了各自母親的乳汁氣味,才有可能發(fā)生“各找各媽”的母子之間互動(dòng)現(xiàn)象。乳源性化學(xué)信息素除標(biāo)記自己的幼仔和哺乳地點(diǎn)外,主要作用是激發(fā)幼仔采食欲望,吸引幼仔前去吸乳,或許還有其他未被人們知曉的功效。

3.3 圈養(yǎng)大熊貓乳汁中VOCs測(cè)試結(jié)果影響因素

因圈養(yǎng)大熊貓乳汁的稀缺性,難以采得大量乳樣進(jìn)行多方法多途徑探究其香氣成分,如有機(jī)溶劑蒸餾提取法需乳量較多,故采用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用法測(cè)試圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的VOCs是切實(shí)可行的，能探尋出圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的香氣成分，上述的測(cè)試結(jié)果也證實(shí)了該方法的可靠性。但不同的SPME溫度和時(shí)長(zhǎng)、SPME型號(hào)、GC-MS聯(lián)用儀生產(chǎn)廠家和新舊程度、程序升溫、解吸時(shí)間長(zhǎng)短、毛細(xì)管柱類(lèi)型和長(zhǎng)度、譜庫(kù)是否最新版本、自動(dòng)檢索還是人工檢索,都會(huì)有不同的結(jié)果,且圈養(yǎng)大熊貓哺乳母獸的日糧構(gòu)成、泌乳階段、健康狀況、年齡、遺傳因素等自身?xiàng)l件,采集樣品時(shí)的氣溫等環(huán)境因子也是重要影響因素。嗅感圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣較強(qiáng)時(shí),測(cè)試效果較好,這在圈養(yǎng)大熊貓“紳賓”乳汁的測(cè)試結(jié)果(表8)得到佐證。本文是按照表2方法取得的結(jié)果,但我們相信圈養(yǎng)大熊貓乳汁中VOCs遠(yuǎn)不止這些成分。由于此前未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外有關(guān)圈養(yǎng)大熊貓乳汁中VOCs和香氣成分方面的報(bào)道,我們僅在這方面進(jìn)行了首次探索性研究,可供以后分析圈養(yǎng)大熊貓乳汁中的VOCs和探究圈養(yǎng)大熊貓乳源性化學(xué)信息素參考。

3.4 圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣成分的應(yīng)用意義

圈養(yǎng)大熊貓乳汁氣味具有獨(dú)特性,在特征性香氣方面有別于牛乳、羊乳等哺乳動(dòng)物的乳汁。若用其它動(dòng)物乳汁或奶粉補(bǔ)飼或全飼大熊貓幼仔,因風(fēng)味差異,缺少母乳的特有香氣,幼仔不熟悉這些乳汁或奶粉的氣味,會(huì)造成一段時(shí)間不愿采食,影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入,導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育減緩甚至健康水平下降?？筛鶕?jù)圈養(yǎng)大熊貓乳汁的風(fēng)味特征[19]和上述測(cè)出的香氣成分,模擬圈養(yǎng)大熊貓乳汁的天然香氣,調(diào)制大熊貓幼仔專(zhuān)用誘食劑,讓人工乳、代用奶、窩窩頭等食物具有“媽媽”的乳味,使幼仔采食過(guò)程具有安全感、親切感和幸福感,緩解從自然母乳向人工食物變換而引起的應(yīng)激反應(yīng),增強(qiáng)幼仔采食欲望。圈養(yǎng)大熊貓幼仔專(zhuān)用誘食劑在本質(zhì)上就是人工仿制的大熊貓乳源性化學(xué)信息素，遵照圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣的共同特點(diǎn)，采用多種香原料調(diào)制而成，以某種強(qiáng)度的母乳樣香氣賦予大熊貓幼仔的人工食物，吸引幼仔采食，便于人工乳和代用奶的平穩(wěn)使用，利于幼仔食物由液態(tài)向固態(tài)的漸進(jìn)過(guò)渡，也有助于破解大熊貓幼仔的化學(xué)生態(tài)覓食效應(yīng)之謎。

本研究結(jié)果不僅為圈養(yǎng)大熊貓乳汁香氣的形成找到了部分直接物質(zhì),也為研制圈養(yǎng)大熊貓幼仔專(zhuān)用誘食劑提供了部分原料選擇的依據(jù)。表9所列46種單體呈香物質(zhì)中有5種是我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)----食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)(GB 2760-2014)中不允許使用的，分別是2-甲基-3-丁烯-2-醇、順式-2-戊烯-1-醇、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、乙醇、3-己烯-1-醇,因此在調(diào)制圈養(yǎng)大熊貓幼仔專(zhuān)用誘食劑時(shí)應(yīng)規(guī)避使用上述5種呈香物質(zhì),其余41種均可作為單體香原料，在嚴(yán)格遵守國(guó)家有關(guān)規(guī)定的前提下酌情酌量選用。

(致謝:本研究的實(shí)施過(guò)程中,中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心的有關(guān)領(lǐng)導(dǎo)和科研動(dòng)管處黃炎教授級(jí)高級(jí)工程師、屈元元工程師在批準(zhǔn)采集乳樣時(shí)給予了支持,臥龍神樹(shù)坪基地的董超、楊長(zhǎng)江、曾文、程建斌等同仁在乳樣采集時(shí)熱情相助,四川大學(xué)分析測(cè)試中心的丁小東副研究員、中國(guó)科學(xué)院成都分院分析測(cè)試中心的胡靜副研究員、農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所的周正工程師在成分分析和推定方面提供了幫助,在此一并深表謝意！)