□ 蔣 卉 南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院 萬 凱 揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院

革蘭氏陰性食源性致病菌作為最常見的病原菌，已成為嚴(yán)重威脅到食品安全和公眾健康。雖然高溫高壓可以殺死細(xì)菌，但細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖，LPS）不會(huì)隨著細(xì)菌的死亡而消失或被破壞，細(xì)菌死亡后釋放的LPS仍可能威脅人類健康。LPS由內(nèi)至外由3個(gè)部分共價(jià)連接：疏水的類脂A、核心寡糖和親水的O-抗原。LPS引起炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致多種感染或致命的膿毒性休克綜合癥[1-3]。研究表明，脂多糖可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[4-5]，促進(jìn)炎癥相關(guān)因子表達(dá)。但是不同種類革蘭氏陰性菌的LPS結(jié)構(gòu)不同，其免疫活性也有很大差別[6-8]。本文通過考察大腸桿菌O26:B6、腸炎沙門氏菌、銅綠假單胞菌10來源的LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞炎癥相關(guān)因子表達(dá)的情況，對(duì)不同來源食源性致病菌LPS的免疫活性進(jìn)行比較研究。

1 儀器與試劑

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

生物安全柜（美國Thermo公司）；3111型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公 司 ）；CFX96 Optics Module型擴(kuò)增儀（美國BIO-RAD公司）；UV5Nano超微量分光光度計(jì)（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Allegra X-30R離心機(jī)（美國BEXKMAN 公 司 ）；SpectraMaxμ M3多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；Axio Vert.A1倒置式顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

Raw264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM 培 養(yǎng) 基（C11995500BT）、胎牛血清（10099141C）購自美國Gibco公司；大腸桿菌O26:B6來源LPS（L2654）、腸炎沙門氏菌來源LPS（L7770）、銅綠假單胞菌10來源LPS（L9143）購自美國Sigma公司；Prime Script? RT reagent Kit with gDNA Eraser（RR047A）、TB Green ? Premix Dimer Eraser?（RR091A）購自Takara公司；總RNA提取試劑（B511321）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；CCK-8試劑（C0037）、一氧化氮檢測(cè)試劑盒（S0021）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-1α、iNOS和β-actin基因引物由南京金斯瑞生物工程有限公司合成。

表1 目的基因及內(nèi)參的引物序列表

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)液：90% DMEM，10%（v/v）胎牛血清。Raw264.7細(xì)胞于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于96孔板，每孔5 000個(gè)細(xì)胞。分別給予0（對(duì)照組）、0.001、0.01、0.1、1、10、100、1 000 ng/mL與10 000 ng/mL的大腸桿菌O26:B6、腸炎沙門氏菌、銅綠假單胞菌10來源LPS，于37 ℃、5% CO2的條件下處理24 h。提前4 h加入CCK-8溶液，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度。實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次。

2.3 細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-1α和iNOS mRNA的檢測(cè)

采用RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞中的炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-1α和iNOS mRNA的表達(dá)。相關(guān)基因引物序列見表1。

將細(xì)胞分為對(duì)照組（不加LPS）、大腸桿菌O26:B6來源LPS組（LPS終濃度0.1、1、10 μg/mL）、腸炎沙門氏菌來源LPS組（LPS終濃度0.1、1、10 μg/mL）、銅綠假單胞菌10來源LPS組（LPS終濃度0.1、1、10 μg/mL），每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2條件下處理6 h后倒掉孔板中的培養(yǎng)液液，收集孔板底部的細(xì)胞，用于提取總RNA。細(xì)胞總RNA按照UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說明操作，用UV5Nano超微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA純度和濃度。將符合A260/A280=1.8-2.0的RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作。將合成得到的cDNA作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)的儀器設(shè)置參數(shù)：Stage 1：預(yù)變性95 ℃、30 s循環(huán)1次；Stage 2：PCR 反應(yīng) 95 ℃、5 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s循環(huán)40次；Dissociation Stage：95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s循環(huán)1次。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)RT-qPCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，根據(jù)公式計(jì)算出目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平，計(jì)算公式[9]參考式（1）。

圖1 不同來源LPS刺激下Raw264.7細(xì)胞的存活率圖

2.4 NO的檢測(cè)

將細(xì)胞接種于96孔板，分別給予0（對(duì)照組）、0.001、0.01、0.1、1、10、100、1 000、10 000 ng/mL 的大腸桿菌O26:B6、腸炎沙門氏菌、銅綠假單胞菌10來源LPS于37 ℃、5%CO2條件下處理6 h、24 h，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用NO試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO穩(wěn)定氧化代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽（）水平。吸取50 μL上清液于96孔板中，按照一氧化氮檢測(cè)試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑，使用酶標(biāo)儀在540 m處測(cè)量各孔吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出NO的含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 LPS對(duì)Raw264.7細(xì)胞存活力的影響

經(jīng) 0.001、0.01、0.1、1、10、100、1 000、10 000 ng/mL的 大 腸桿菌O26:B6、腸炎沙門氏菌、銅綠假單胞菌10來源LPS刺激24 h后，Raw264.7細(xì)胞的生長并未受到影響，各組與空白對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見圖1）。因此，所選LPS濃度可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 不同來源食源性致病菌LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞表達(dá)IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-1α、iNOS mRNA的情況

如圖2所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)各濃度大腸桿菌O26:B6、腸炎沙門氏菌來源LPS刺激6 h后炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-1α、iNOS mRNA的表達(dá)量均有顯著升高（p＜0.05，n=3），IL-6 mRNA的表達(dá)量有一定程度的升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（1 μg/mL和10 μg/mL腸炎沙門氏菌來源LPS處理組除外）。與對(duì)照組相比，銅綠假單胞菌10來源LPS刺激6 h后僅有10 μg/mL LPS處理組的iNOS mRNA的表達(dá)量有顯著升高（p＜0.05，n=3），其余組各種炎癥因子稍有升高，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

刺激Raw264.7細(xì)胞6 h后，大腸桿菌O26:B6來源LPS組與腸炎沙門氏菌來源LPS組相比，各種炎癥因子mRNA的表達(dá)量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而銅綠假單胞菌10來源LPS組的各種炎癥因子mRNA的表達(dá)量（0.1 μg/mL LPS處理組的IL-6 mRNA的表達(dá)量除外）均顯著低于大腸桿菌O26:B6來源LPS組、腸炎沙門氏菌來源LPS組（p＜0.05，n=3）。

不同來源食源性致病菌LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞表達(dá)IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-1α和iNOS mRNA的量有所差異。銅綠假單胞菌10來源LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞表達(dá)炎癥相關(guān)因子的能力明顯低于大腸桿菌O26:B6來源LPS、腸炎沙門氏菌來源LPS。大腸桿菌O26:B6來源LPS與腸炎沙門氏菌來源LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞表達(dá)炎癥相關(guān)因子的能力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.3 不同來源食源性致病菌LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞釋放NO的情況

采用Griess法檢測(cè)了分別在大腸桿菌O26:B6、腸炎沙門氏菌、銅綠假單胞菌10來源LPS刺激6 h、24 h下Raw264.7細(xì)胞釋放NO的情況。研究結(jié)果如圖3所示，在相同的LPS濃度下，大腸桿菌O26:B6來源LPS與腸炎沙門氏菌來源LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生的NO量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；大腸桿菌O26:B6、腸炎沙門氏菌來源LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生的NO量明顯多于銅綠假單胞菌10來源的LPS（p＜0.05，n=3）。隨著刺激時(shí)間的延長，Raw264.7細(xì)胞NO釋放量增加。刺激6 h時(shí)，不同來源LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞釋放NO具有明顯的劑量依賴性（見圖3a）。值得注意的是，刺激24 h時(shí)，各濃度大腸桿菌O26:B6、腸炎沙門氏菌來源LPS誘導(dǎo)后Raw264.7細(xì)胞的NO釋放量均呈現(xiàn)較高水平，而銅綠假單胞菌10來源LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞釋放NO依然具有明顯的劑量依賴性（見圖3b）。這說明，長時(shí)間的LPS刺激可使Raw264.7細(xì)胞NO的釋放量穩(wěn)定，且不再與LPS濃度相關(guān)。

圖2 不同來源LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞表達(dá)炎癥相關(guān)因子的情況圖

圖3 不同來源LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞釋放NO的情況圖

4 討論

LPS為革蘭氏陰性菌的主要成分，是介導(dǎo)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合癥的主要啟動(dòng)因子[10]。巨噬細(xì)胞可分為經(jīng)典的M1型、M2型巨噬細(xì)胞，還有腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、CD169+巨噬細(xì)胞、TCR+巨噬細(xì)胞[11]。當(dāng)細(xì)胞接受LPS刺激時(shí)，LPS通過巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體4（TLR4）來活化核轉(zhuǎn)錄因子KappaB（NF-κB），發(fā)生經(jīng)典的M1型巨噬細(xì)胞激活，從而誘導(dǎo)大量的炎癥因子和細(xì)胞因子的表達(dá)[12]，包括TNT-α、IL-6和IL-1α等產(chǎn)生炎癥[13-15]，并能夠高表達(dá)誘生型一氧化氮酶（iNOS）。

本文選擇Raw264.7巨噬細(xì)胞（M1）為細(xì)胞模型，初步研究了不同來源食源性致病菌LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-1α、iNOS mRNA的表達(dá)及NO的釋放情況。結(jié)果表明，銅綠假單胞菌10來源LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞表達(dá)炎癥相關(guān)因子的能力及NO的釋放明顯低于大腸桿菌O26:B6來源LPS、腸炎沙門氏菌來源LPS。這與革蘭氏陰性菌LPS的結(jié)構(gòu)，主要與類脂A的結(jié)構(gòu)有關(guān)。類脂A?；潭葘?duì)LPS與巨噬細(xì)胞中MD-2和TLR4的結(jié)合具有很大的影響[16-17]，進(jìn)而影響LPS的免疫活性。雖然所有革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁均有LPS，但是脂多糖的結(jié)構(gòu)是不同的。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大部分腸桿菌科細(xì)菌的LPS均含有六個(gè)?；淸6]，如大腸桿菌、沙門氏菌等。而銅綠假單胞菌10來源的LPS含有五個(gè)酰基鏈[7-8]。六?；ê辛鶄€(gè)酰基鏈）類脂A表現(xiàn)出的免疫活性最強(qiáng)[6]。與之相比，五酰化類脂A活性要低100倍，而四?；愔珹無活性[7-8]。故銅綠假單胞菌10來源的LPS是一種較弱的TLR4受體激動(dòng)劑，其免疫活性較弱。來自腸桿菌科的食源性致病菌LPS可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子mRNA的高表達(dá)，具有較強(qiáng)的免疫活性。