呂舸，周吉芳，楊杰，丁啟龍

(中國藥科大學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實驗教學(xué)中心，江蘇 南京 211198)

“Fork head”最初在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，作為一種潛在的轉(zhuǎn)錄因子，隨后證明其有翼狀DNA結(jié)合區(qū)域，此時意識到它可能是已發(fā)現(xiàn)的其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如HNF-3A，即現(xiàn)在的轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白A1(FOXA1)[1]。它存在于所有的真核生物中，在哺乳動物中叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族O亞族(FOXO家族)包括4個成員：FOXO1、FOXO3、FOXO4、FOXO6，在體內(nèi)廣泛表達，F(xiàn)OXO6最晚被發(fā)現(xiàn)，在結(jié)構(gòu)和功能上和其他3個差別較大[2]。FOXO家族均有一個由110個氨基酸構(gòu)成的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，結(jié)合到靶基因的TTGTTTAC序列，從而發(fā)揮作用，包括調(diào)節(jié)糖異生、細胞周期停滯、分化、DNA修復(fù)，自噬和細胞凋亡等。FOXO家族不同成員有不同的調(diào)節(jié)作用，F(xiàn)OXO1主要調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)，F(xiàn)OXO3是無脊椎動物、小鼠和人類中重要的調(diào)節(jié)壽命的因子，也和氧化應(yīng)激反應(yīng)和腫瘤抑制活性密切相關(guān)[3]。

機體氧化應(yīng)激狀態(tài)下會產(chǎn)生過多的活性氧簇(ROS)，ROS是電子軌道最外層有未配對電子的活性基團，包括自由基和一些強活性的分子?；钚匝踹^多產(chǎn)生會對機體產(chǎn)生危害，最初被認(rèn)為是有毒的，是有氧代謝的產(chǎn)物。但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)ROS可以作為信號傳導(dǎo)的“第二信使”，在細胞信號通路中扮演重要角色，特別是在應(yīng)激反應(yīng)下，體內(nèi)ROS會產(chǎn)生變化，對氧化應(yīng)激進行調(diào)節(jié)[4]。

FOXO是細胞內(nèi)應(yīng)激應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子，刺激編碼抗氧化蛋白基因的表達，對抗細胞內(nèi)的氧化反應(yīng)[5]。另一方面，ROS也能在多種水平調(diào)節(jié)FOXO的活性，包括轉(zhuǎn)錄后修飾和轉(zhuǎn)錄修飾[6]。本文就ROS對FOXO活性和蛋白基因表達的調(diào)節(jié)進行綜述。

1 ROS在FOXO轉(zhuǎn)錄后修飾中的作用

FOXO的活性受到多種轉(zhuǎn)錄后修飾和核質(zhì)穿梭的控制，最近FOXO合成的轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)節(jié)已經(jīng)成為了FOXO功能調(diào)節(jié)的一種新的方式。有證據(jù)表明FOXO轉(zhuǎn)錄后修飾的調(diào)節(jié)方式主要用于應(yīng)答應(yīng)激刺激，包括氧化應(yīng)激[5]。FOXO是各種激酶的底物，能夠被磷酸化、乙?；?、泛素化、糖基化和氧化等，這些修飾能夠影響FOXO的活性，如FOXO的DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活活性、亞基定位、以及和轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子結(jié)合。

1.1 ROS影響FOXO蛋白的磷酸化修飾 磷酸化是FOXO轉(zhuǎn)錄后修飾的一種重要形式，它能夠影響FOXO的核質(zhì)穿梭和DNA結(jié)合。引起FOXO磷酸化的主要是上游信號級聯(lián),最重要的一條信號通路起始于胰島素受體和胰島素樣生長因子受體，通過作用于磷脂酰肌醇3′-激酶(PI3K)和絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)，引起FOXO的磷酸化失活以及出核[7]。ROS在胰島素受體(InsR)和胰島素樣生長因子受體(IDF1-R)級聯(lián)信號通路中能夠作用于多個位點，從而影響FOXO的磷酸化，影響FOXO的活性。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)能夠作用于胰島素受體，使其去磷酸化和失活。PTP在其活性位點上有一個氧化敏感型半胱氨酸，能夠被活性氧氧化，從而失活[8]。磷酸酶和張力蛋白同系物(PTEN)通過催化磷酸肌醇的3′-去磷酸化來減弱PI3K信號傳導(dǎo)，和PTP類似，PTEN也能夠被活性氧滅活，PTEN暴露在H2O2中時，在其活性部位形成二硫鍵，從而失去活性[9]。Akt也能夠被活性氧氧化，從而抑制其活性。AKt暴露在活性氧中能形成亞磺?；疉kt，與親電子試劑反應(yīng)，如與脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物4-羥基壬烯醛(HNE)邁克爾加成為敏感的半胱氨酸殘基，導(dǎo)致Akt抑制[10]。通常來說FOXO磷酸化后都會出核，并失活，但FOXO6通過PI3K-AKt通路磷酸化后，雖然失活，但卻仍在核內(nèi)[11]。

1.2 ROS影響FOXO蛋白的乙?；揎?FOXO賴氨酸的乙?；揎椖軌蛴绊慒OXO的活性和穩(wěn)定性，減弱FOXO的DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性，還會使FOXO易受磷酸化和出核的影響，同時賴氨酸的乙?；材軌蚍€(wěn)定FOXO，使其免于相同位點的泛素化[12]。氧化應(yīng)激造成的細胞內(nèi)ROS水平增加，特別是H2O2，是FOXO乙?；头核鼗年P(guān)鍵介質(zhì)。CREB結(jié)合蛋白CBP和P300是組蛋白乙?；傅膬蓚€亞型，ROS介導(dǎo)FOXO乙酰化的分子機制已經(jīng)被初步闡明，外源性加入的低濃度的(25 μmol·L-1)H2O2能夠促進p300/CBP乙酰轉(zhuǎn)移酶和FOXO4之間通過二硫鍵形成二聚體[13]，它們之間的連接通過FOXO4上的半胱氨酸殘基C477介導(dǎo)。這種FOXO的半胱氨酸殘基在人類和哺乳動物中都是高度保守的，因此氧化還原敏感的異二聚體，可能為H2O2誘導(dǎo)的FOXO乙?；臋C制。但是最近的研究發(fā)現(xiàn)，在FOXO3a上的半胱氨酸殘基，并不和乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合[14]。

2 ROS在FOXO基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的作用

2.1 ROS影響miRNA對FOXO蛋白表達的調(diào)節(jié) 目前，在一些病理生理過程中許多miRNA已經(jīng)被作為FOXO表達的調(diào)節(jié)因子，包括在抗原激活的TH淋巴細胞克隆擴增，老化期間造血干細胞(HSC)的維持，心臟肥大，和某些神經(jīng)退行性疾病中，都有此調(diào)節(jié)過程。許多直接作用于FOXO mRNA的miRNA也與腫瘤促進，生長或轉(zhuǎn)移有關(guān)：例如，在肺癌和黑色素瘤中miR-182靶向直接作用于FOXO3 mRNA[15];相同的FOXO3 mRNA也被miR-155靶向調(diào)控，促進胰腺癌中的氧化應(yīng)激[16]。

經(jīng)過初步研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激能夠抑制Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)信號通路被細胞因子的激活[17]，隨后又發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，STAT5↑/miR-182↑/FOXO1↓信號通路，可以被快速轉(zhuǎn)變?yōu)樯险{(diào)FOXO的表達(STAT5↓/miR-182↓/FOXO1↑)。將SK-N-MC人神經(jīng)母細胞瘤細胞暴露于300 μmol·L-1的H2O2中，會使STAT滅活，10倍下調(diào)miR-182，最終使FOXO1蛋白水平增加4倍[18]。

2.2 ROS影響RNA結(jié)合蛋白對FOXO蛋白表達的調(diào)節(jié) HuR是一種AU富含元件(ARE)結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白，可特異性的結(jié)合靶RNA的ARE，參與細胞存活，細胞分裂，免疫應(yīng)答，能夠促進mRNA穩(wěn)定，并作為翻譯促進因子[19]。通常在細胞核內(nèi)，感受應(yīng)激刺激后(包括氧化應(yīng)激)，轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)。細胞暴露于氧化應(yīng)激環(huán)境中后，會使p38-MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)激活，之后直接或間接刺激HuR磷酸化，導(dǎo)致其與靶mRNA的結(jié)合和在細胞質(zhì)中的積聚。HuR本身也是氧化還原的感受器，HuR為同源二聚體時得到全部活性。三個HuR RNA識別位點中的第一個半胱氨酸殘基通過形成分子間二硫鍵促進同源二聚化[20]。因此氧化還原敏感的半胱氨酸，通過使HuR形成同源二聚體，應(yīng)答氧化應(yīng)激刺激。目前已在FOXO1 RNA的3′-UTR和內(nèi)含子區(qū)域鑒定出HuR結(jié)合位點[21]，而在FOXO3 mRNA中僅發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子中的HuR結(jié)合位點。HuR在MDA-MB-231乳腺癌細胞中過表達能夠穩(wěn)定FOXO1mRNA，提高FOXO1的蛋白水平。在5-氟尿嘧啶(5-FU)的應(yīng)激刺激下，會導(dǎo)致內(nèi)源性HuR上調(diào)，最終導(dǎo)致細胞FOXO1水平增加。5-FU誘導(dǎo)的細胞凋亡幾乎完全被同源siRNA介導(dǎo)的內(nèi)源性HuR敲除所抑制，并在HuR-siRNA存在下通過異位FOXO1的過表達而重新發(fā)揮作用。 總之，這些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)暴露于應(yīng)激刺激時，HuR介導(dǎo)FOXO1上調(diào)，從而誘導(dǎo)癌細胞凋亡。

第二個參與FOXO轉(zhuǎn)錄后修飾的RNA結(jié)合蛋白是Quaking(QKI)[22]。是mRNA剪切、轉(zhuǎn)移、穩(wěn)定和轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子，協(xié)助調(diào)節(jié)細胞分化和細胞周期，還起到腫瘤抑制的作用[23]。Galarneau和Richard[24]定義了QKI反應(yīng)元件(QRE)的共有序列(NACUAAY-N1-20-UAAY)，并使用生物信息學(xué)分析預(yù)測了小鼠中1 400個以上QKI mRNA靶標(biāo)。

在MCF- 7乳腺癌細胞中，F(xiàn)OXO1 mRNA的3′-UTR結(jié)合了miR-27a，miR-96、miR-182和QKI蛋白、HuR蛋白[25]。用反義抑制劑靶向抑制這些miRNA和敲除QKI，它們對內(nèi)源性FOXO1表達影響相同，都導(dǎo)致FOXO1 mRNA和蛋白質(zhì)水平的上調(diào)。對比HuR在FOXO1的mRNA 3′-UTR內(nèi)的結(jié)合位點ARE和QKI的結(jié)合位點QRE，發(fā)現(xiàn)在3′-UTR區(qū)域內(nèi)，第二個ARE與第三個QRE重疊。這種結(jié)合位點的排列提示了兩種調(diào)節(jié)蛋白對FOXO1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相互排斥的可能性。對MDA-MB-231乳腺癌細胞的5-FU處理導(dǎo)致FOXO1上調(diào)，同時上調(diào)HuR和下調(diào)QKI。 由此我們可以推測FOXO1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)涉及特定miRNA，HuR和QKI之間的功能性相互作用，以這種方式，F(xiàn)OXO1蛋白可以通過這些相互作用在轉(zhuǎn)錄后上調(diào)，以應(yīng)對各種應(yīng)激刺激，包括氧化應(yīng)激。

未來的實驗需要確定這兩種影響是否是獨立的，即在一個實驗中同時miRNA抑制和QKI敲除是否具有加性效應(yīng)并導(dǎo)致FOXO1上調(diào)增多。 另外，miRNA和QKI的作用可以相互關(guān)聯(lián)，然后預(yù)期僅針對一種因子(例如靶向miRNA)的治療也會阻止另一種因子(例如QKI)與3′-UTR的結(jié)合。

2.3 ROS影響p53對FOXO蛋白表達的調(diào)節(jié) 腫瘤抑制蛋白p53能夠維持基因組完整性。為了調(diào)節(jié)細胞應(yīng)激產(chǎn)生的DNA損傷，野生型p53協(xié)調(diào)了許多基因的轉(zhuǎn)錄，并通過靶基因的差異激活將細胞導(dǎo)向細胞周期停滯、衰老或凋亡，防止DNA繼續(xù)受損。最近有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑制因子p53是FOXO3a的上游調(diào)節(jié)因子。順鉑和銀杏葉的藥理學(xué)研究表明，化療藥物誘導(dǎo)的ROS增加了癌基因C-myc[26],升高的C-myc水平抑制p21Cip1的p53-反式激活，抑制細胞周期停滯，但不影響促凋亡基因PUMA的p53-反式激活，從而導(dǎo)致細胞凋亡激活。

除了ROS和p53通過信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)之間的相互作用，ROS的直接作用也可能影響p53的激活。p53的穩(wěn)定性和活性受到多種共價翻譯后修飾的影響，如磷酸化、乙?；?、甲基化、泛素化等。p53的磷酸化，甲基化和乙?；ǔ?dǎo)致其穩(wěn)定，積累和活化。在這些翻譯后修飾中，ROS與p53介導(dǎo)的磷酸化有關(guān)，通過蛋白激酶，包括p38α-MAPK，共濟失調(diào)毛細血管擴張癥突變蛋白(ATM)和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)。然而，這些蛋白激酶的激活不一定是ROS特異性的，這些蛋白激酶是響應(yīng)DNA損傷的信號傳導(dǎo)途徑的常見下游效應(yīng)物。由于存在含有氧化還原敏感型的半胱氨酸(Cys)，p53本身具有氧化還原活性。在p53 DNA結(jié)合域中存在兩個半胱氨酸簇，其對于p53與其共有序列的特異性結(jié)合是必需的。Cys 124、135、141、182和277位于p53的DNA結(jié)合域，構(gòu)成了氧化還原調(diào)制的結(jié)構(gòu)平臺。

從理論上講，蛋白質(zhì)中有多種可能的氧化巰基結(jié)構(gòu)，包括磺酸(-SOH)，二硫化物(-S-S-)，次磺酰胺(-SNR1R2)，亞磺酸(-SO2H)和磺酸(-SO3H)。已經(jīng)觀察到用氧化劑處理p53能夠取消它的DNA結(jié)合活性。最近的研究確定了p53氧化的作用位點，發(fā)現(xiàn)在氧化劑處理后GSH會與Cys124、Cys124結(jié)合，連接通過二硫鍵與p53連接，降低p53的DNA結(jié)合活性，該過程可被抗氧化劑逆轉(zhuǎn)[27]。

3 ROS對FOXO的調(diào)節(jié)與FOXO轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子

轉(zhuǎn)錄共激活因子PGC-1α是碳水化合物和脂質(zhì)代謝以及線粒體生物合成和功能的上游調(diào)節(jié)因子，并且能夠在不同的系統(tǒng)里調(diào)節(jié)FOXO的活性[28]。PGC-1α通過與FOXO1a共同作用，正向調(diào)節(jié)空腹誘導(dǎo)的肝臟糖異生。相似的，F(xiàn)OXO1a誘導(dǎo)的肝細胞中硒蛋白P(SelP)的表達也能夠通過與PGC-1α共同作用而加強[29]。在內(nèi)皮細胞和骨骼肌細胞中，PGC-1α也可以與FOXO3a共同作用調(diào)節(jié)抗氧化蛋白的表達[30]。

在腎臟中，高脂飲食引起的腎臟脂毒性與胰島素抵抗和血脂異常有關(guān)，可能是由于FOXO3a和PGC-1α的下調(diào)和氧化應(yīng)激增加。給藥自由基清除劑TEMPOL,通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt-FOXO信號傳導(dǎo)來預(yù)防腎損傷[30]，改善了高脂飲食誘導(dǎo)的腎損傷，這可能是由于FOXO3a和PGC-1α的上調(diào)導(dǎo)致了對氧化應(yīng)激和脂肪細胞凋亡的保護作用[31]。轉(zhuǎn)錄輔因子和賴氨酸脫甲基酶(KDM)通過與FOXO共同作用能夠誘導(dǎo)抗氧化防護基因的表達，這表明該復(fù)合物的主要作用是維持氧化應(yīng)激抗性基因的基礎(chǔ)表達，而不是它們對外源氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響[32]。該結(jié)果進一步表明，F(xiàn)OXO進入不同的染色質(zhì)環(huán)境和核微環(huán)境可能依賴于不同的輔助因子。

4 總結(jié)與展望

雖然氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，但低生理濃度的ROS，特別是過氧化氫，已成為激素和生長因子介導(dǎo)的細胞代謝控制中不可缺少的信號分子。FOXO的活性和細胞氧化還原狀態(tài)本質(zhì)上是相互聯(lián)系的，F(xiàn)OXO充當(dāng)細胞氧化還原傳感器，通過磷酸化，乙?；头核鼗诜g后進行修飾，對氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響FOXO細胞質(zhì)核穿梭、FOXO穩(wěn)定，最終影響FOXO靶基因的轉(zhuǎn)錄。ROS也能夠在轉(zhuǎn)錄水平影響FOXO的表達，miRNA和p53是FOXO的上游信號分子，ROS能夠間接通過控制他們的活性來調(diào)節(jié)FOXO的表達。HuR和QKI是RNA結(jié)合蛋白，能夠與FOXO的RNA結(jié)合控制FOXO的轉(zhuǎn)錄，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，HuR和QKI相互作用，使FOXO蛋白在轉(zhuǎn)錄后上調(diào)，以應(yīng)對氧化應(yīng)激刺激。

此外，F(xiàn)OXO還能以氧化還原敏感的方式與其他蛋白(包括共調(diào)節(jié)因子和抗氧化酶)相互作用，并且有一些證據(jù)表明FOXO基因表達本身具有氧化還原敏感性調(diào)節(jié)作用。另一方面，一些FOXO靶基因是抗氧化酶，它們通過催化歧化和減少超氧化物和過氧化氫來影響細胞內(nèi)和細胞外氧化還原狀態(tài)。 FOXO介導(dǎo)的基因表達的最終結(jié)果影響氧化損傷后的細胞命運，誘導(dǎo)凋亡細胞死亡或細胞周期停滯和隨后的修復(fù)過程。在生理條件下，F(xiàn)OXOs參與細胞分化，能量代謝，調(diào)節(jié)營養(yǎng)穩(wěn)態(tài),在與氧化應(yīng)激相關(guān)的一些病理條件下FOXO過度活化可能增加2型糖尿病的代謝紊亂或癌癥。所以需要繼續(xù)深入研究ROS對FOXO活性和表達的影響，從而能夠進一步明確疾病的發(fā)病機制，為研發(fā)新的藥物提供思路。