孫華庚,劉丹,劉岱琳,王媚,劉瑩
(1.天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司,天津300457;2.中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院軍事藥學(xué)教研室,天津300309)
人參(Panax ginseng C.A.Mey.)為五加科植物人參的干燥根和根莖,具有大補(bǔ)元?dú)?,?fù)脈固脫,補(bǔ)脾益肺,生津止渴,安神益智的功效[1]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示人參具有抗腫瘤、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、降低肝損傷、抗病毒及輔助免疫作用[2]。2012 年,國家衛(wèi)生部印發(fā)了關(guān)于批準(zhǔn)人參(人工種植)為新資源食品的公告,為我國人參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展拓寬了道路。隨著人參功效研究的日漸深入,國際市場對于人參及其提取物的需求大幅提升,我國人參產(chǎn)業(yè)進(jìn)入了新的發(fā)展時期。然而,人參及其提取物中殘留的農(nóng)藥種類繁多,不易降解,且普遍具有致突變、致癌、致畸的作用。因此,人參提取物中去除農(nóng)藥殘留的工藝研究具有重大現(xiàn)實(shí)意義。本文簡要地綜述了近年來人參提取物中農(nóng)藥殘留去除工藝的研究概況和發(fā)展趨勢[3-4]。
人工種植的人參生長周期一般為5 年~7 年,種植密度大,生長周期長,發(fā)生病蟲害的可能性相對較大,參農(nóng)在迫不得已的情況下可能通過追加各種農(nóng)藥來盡可能地降低經(jīng)濟(jì)損失,而各種農(nóng)藥殘留便在植物體內(nèi)不斷累積。消費(fèi)者在攝取其功效成分的同時,往往不同程度的攝入了農(nóng)藥殘留,其毒性和潛在危害不容忽視[5-6]。
人參及其提取物中的農(nóng)藥殘留按其化學(xué)成分主要可分為有機(jī)氯類農(nóng)藥、有機(jī)磷類農(nóng)藥、有機(jī)氮類農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥等[7]。不同種類的農(nóng)藥殘留毒性各不相同,危害各異。對農(nóng)藥殘留的種類、用途、毒性及其危害總結(jié)見表1。
表1 農(nóng)藥的分類及危害Table 1 Classification and harm of pesticides
為了保護(hù)消費(fèi)者的利益,各國政府根據(jù)各自國情規(guī)定了人參及其提取物中農(nóng)殘的限量,并據(jù)此進(jìn)行監(jiān)管。美國、日本及歐洲國家已經(jīng)建立了較為完善的農(nóng)藥殘留監(jiān)控體系,往往會根據(jù)人參制品的用途,分別按照食品和藥品區(qū)別監(jiān)管。歐洲對于作為食品的人參提取物,適用歐洲議會及理事會規(guī)例第396/2005 號(Regulation NO. 396/2005 of the European Parliament and of the Council,EC396/2005),檢測 400 多項農(nóng)殘,限量各不相同,整體上尺度相對寬松;對于作為藥品的人參提取物,歐洲藥典與美國藥典所規(guī)定的農(nóng)殘項目是相同的,都是檢測70 項,且限量一致。然而,美國政府相關(guān)機(jī)構(gòu),如美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)、美國國家環(huán)境保護(hù)局(Environmental Protection Agency,EPA)、美國農(nóng)業(yè)部(U-nited States Department of Agriculture,USDA)等,在執(zhí)法過程中具有較大的自主權(quán),會從各自角度出發(fā)檢測相關(guān)的農(nóng)殘項目,其中以FDA 最為嚴(yán)格,農(nóng)殘檢測項目多達(dá)500 多項,限量通常被認(rèn)為是0.001 mg/kg~0.01 mg/kg,成為守衛(wèi)海關(guān)的一柄利劍。日本“肯定列表制度”將食用人參歸類于胡蘿卜,農(nóng)藥殘留項目標(biāo)準(zhǔn)多達(dá)200 多項,限量各不相同,部分項目較寬松,個別項目相當(dāng)嚴(yán)格。例如,日本肯定列表中的腐霉利限量為0.5 mg/kg,是美國藥典限量的5 倍;而其中五氯硝基苯的限量為0.02 mg/kg,為美國藥典限量的1/50,已經(jīng)十分接近最為嚴(yán)格的FDA 限量。日本藥典對于人參原藥材和人參粉末只控制總六六六和總滴滴涕,限量為0.2 mg/kg。日本漢方生藥制劑協(xié)會(Japan Kampo Medicines manufacturers Association,JKMA)制定的《漢方制劑生藥制劑農(nóng)藥殘留自主基準(zhǔn)(2006)》中規(guī)定了8 種農(nóng)藥的限量。以優(yōu)質(zhì)高麗參著稱的韓國則對包括人參提取物在內(nèi)的鮮參、干參、紅參共制訂了28 種農(nóng)藥的最大殘留限量[18]。
與發(fā)達(dá)國家相比,我國人參及其提取物的農(nóng)藥殘留監(jiān)管相對薄弱,2015 版藥典中僅規(guī)定了人參原藥材中總六六六、總滴滴涕、五氯硝基苯、六氯苯、七氯、艾氏劑、氯丹7 種有機(jī)氯類農(nóng)藥的殘留限量。同時,也規(guī)定了人參提取物中總六六六、總滴滴涕、五氯硝基苯3項有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留限量[19]。
由此可見,人參提取物生產(chǎn)工藝中必須要采用行之有效的農(nóng)藥殘留去除工藝,才能保證使用滿足中國藥典農(nóng)殘限量的人參原料通過優(yōu)化的生產(chǎn)工藝生產(chǎn)出符合國內(nèi)外農(nóng)藥殘留監(jiān)管規(guī)定的人參提取物產(chǎn)品。
人參提取物化學(xué)成分復(fù)雜,其中殘留的農(nóng)藥種類多樣,理化性質(zhì)各異,研究人員在利用各種技術(shù)手段去除農(nóng)藥殘留的同時,往往也會對其有效成分造成損失。據(jù)文獻(xiàn)報道人參提取物中農(nóng)藥殘留的去除方法主要有吸附法、大孔樹脂法、液液分配法、超臨界流體萃取法、超臨界與大孔樹脂聯(lián)用法、亞臨界淋洗法、生物法、輻照法。
吸附法去除農(nóng)藥殘留是利用具有孔道或夾層結(jié)構(gòu)的介質(zhì)吸附物料溶液中游離的農(nóng)藥殘留,吸附介質(zhì)常選用活性炭、硅藻土等。但是吸附劑在去除殘留農(nóng)藥的同時,也會吸附提取物中的活性成分如人參皂苷等。因此在選用吸附劑開發(fā)農(nóng)藥殘留去除工藝時要慎重考察其生產(chǎn)成本及有效成分的損耗。近年來,本領(lǐng)域研究人員也在不斷嘗試對吸附介質(zhì)的改良,以期獲得具有良好農(nóng)藥殘留去除效果又能盡可能降低有效成分損失率的優(yōu)質(zhì)吸附劑。
馬海波[20]以有機(jī)陽離子為改性劑制備有機(jī)蒙脫土,對人參提取液中4 種有機(jī)氯農(nóng)藥(五氯硝基苯,α-六六六,艾氏劑,pp′-滴滴涕)開展吸附試驗研究。采用該方法制備的有機(jī)蒙脫土對4 種有機(jī)氯農(nóng)藥濃度均為0.12 mg/kg 的人參提取液進(jìn)行動態(tài)吸附后,α-六六六的去除率達(dá)到99%以上,其余3 種有機(jī)氯農(nóng)藥均未被檢出,去除率達(dá)到100%。測試結(jié)果表明,有機(jī)蒙脫土對人參提取液中有機(jī)氯農(nóng)藥的去除具有非常良好且穩(wěn)定的效果,對農(nóng)藥的總?cè)コ蔬_(dá)到99%以上,人參總皂苷在吸附過程的損失率小于4%。
該文章只報道了4 種有機(jī)氯農(nóng)藥的去除效果,但人參提取物中農(nóng)藥殘留種類復(fù)雜,吸附介質(zhì)對于不同農(nóng)藥殘留的吸附性能往往存在差異,能否逐一有效清除尚有待考證。本法可作為人參提取物去除農(nóng)藥殘留工藝的組成部分,或在污染情況明確,且程度較輕的批次中單獨(dú)使用,如遇到嚴(yán)重污染批次可能還需要其他方法配合使用。
大孔樹脂是一種具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子材料,利用范德華力和多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的篩選性,在吸附能力和網(wǎng)孔篩選能力的雙重分離作用下,使欲分離的成分以其分子結(jié)構(gòu)特性及洗脫液解析能力的不同得以分離。大孔吸附樹脂分離技術(shù)主要應(yīng)用于皂苷、黃酮、生物堿等成分的富集上,近年來用于重金屬雜質(zhì)和農(nóng)藥殘留物脫除。
崔麗麗等[21]用LKS-11 型大孔吸附樹脂分析不同來源的人參提取物中農(nóng)藥腐霉利的脫除效果。采用靜態(tài)和動態(tài)吸附法考察大孔吸附樹脂的吸附性能、解吸條件,并最終確定了最佳工藝為0.1 g/mL 樣品溶液通過LKS-11 型大孔樹脂,解吸時先以2 BV 水洗脫,繼以4 BV70%乙醇洗脫。研究結(jié)果表明LKS-11 對人參提取物中的腐霉利具有良好的去除效果,腐霉利脫除率和產(chǎn)品回收率均在90%以上,工藝穩(wěn)定可行。
盧曉燕[22]通過靜態(tài)和動態(tài)吸附研究不同型號大孔樹脂對西洋參提取物中有機(jī)氯農(nóng)殘的吸附情況,從83種國產(chǎn)樹脂和2 種進(jìn)口樹脂中篩選出編號為ZCJ36的國產(chǎn)樹脂對7 種有機(jī)氯農(nóng)藥(六六六、林丹、七氯、五氯苯胺、五氯硝基苯、甲基五氯苯基硫醚、滴滴涕)有優(yōu)良吸附能力。通過正交試驗確定最優(yōu)化工藝條件,并進(jìn)行了放大試驗,結(jié)果表明生產(chǎn)工藝穩(wěn)定,產(chǎn)品的皂苷含量大于6.0%,每種農(nóng)藥殘留小于0.01 mg/kg,均能滿足技術(shù)要求。
大孔吸附樹脂具有吸附容量大、選擇性好、易于解吸附、預(yù)處理方便等許多優(yōu)點(diǎn)。用于農(nóng)藥殘留的去除,只使用水和乙醇,對產(chǎn)品不產(chǎn)生溶劑污染,生產(chǎn)運(yùn)行成本低,去除農(nóng)藥殘留效率好,產(chǎn)品回收率高,適宜在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。如工藝設(shè)計得當(dāng),亦可在去除農(nóng)殘的同時提高人參提取物的總皂苷含量,使產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)一步提升。然而,對于反復(fù)使用的大孔樹脂,某些微量的農(nóng)殘會在樹脂上產(chǎn)生蓄積,一定批次后存在被乙醇解析的風(fēng)險,對產(chǎn)品造成污染。同時,為盡量避免農(nóng)藥蓄積,用于加強(qiáng)樹脂再生所排放的酸液和堿液,需經(jīng)污水處理達(dá)標(biāo)后才能進(jìn)入排水管網(wǎng),相關(guān)費(fèi)用也應(yīng)列入產(chǎn)品成本。
液液分配法即溶劑萃取法,利用目標(biāo)成分與雜質(zhì)在互不相溶的兩相中分配系數(shù)的差異,達(dá)到分離提純目的。將該方法應(yīng)用于人參提取物去除農(nóng)殘,可先將人參提取物溶于水,再用乙酸乙酯、環(huán)己烷等溶劑萃取水溶液中的農(nóng)藥殘留。一般情況下,只要選擇適當(dāng)?shù)妮腿┻M(jìn)行多次萃取,均可取得良好的去殘效果。
中國專利《一種脫除人參提取物中殘留農(nóng)藥腐霉利的方法》(201310105162.7)[23]公開了以正己烷、乙酸乙酯和丙酮的混合物為萃取劑,對人參提取物中農(nóng)藥腐霉利進(jìn)行脫除的方法,按照此法去除農(nóng)藥殘留前后腐霉利殘留由1 mg/kg~3 mg/kg 降至0.01 mg/kg 以下,產(chǎn)品回收率為88%~89%。該專利方法對脫除人參提取物中腐霉利殘留具有一定的效果,但其產(chǎn)品中的溶劑殘留情況并未公開,其安全性需要被考慮。
韓國建國大學(xué)孫成勛等[24]嘗試使用安全無毒的大豆油通過兩相分配色譜,去除人參提取物水溶液中的農(nóng)藥殘留。并使用氣相色譜電子俘獲檢測器和氣相色譜氮磷檢測器對腐霉利、毒死蜱、六六六等4 大類共15 種農(nóng)殘進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗,結(jié)果顯示農(nóng)殘的平均轉(zhuǎn)移率可達(dá)(105.5±6.6)%。同時,人參提取物水溶液中的干物質(zhì)也有一定程度的損失。該方法操作便捷,去農(nóng)殘效果良好,但由于大豆油系一次性使用,成本難以過關(guān),不具備產(chǎn)業(yè)化可行性。
液液分配法用于去除人參提取物中的農(nóng)殘,適合產(chǎn)業(yè)化放大,效果明確,但對于個別易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象的樣品,則需要長時間靜置或進(jìn)行離心,往往也會影響農(nóng)殘檢測的回收率和重現(xiàn)性。同時有機(jī)溶劑易燃易爆,對企業(yè)消防管理級別要求相當(dāng)高,而殘留在產(chǎn)品中的萃取溶劑,也會一定程度的危害消費(fèi)者的身體健康。因此,無論從安全生產(chǎn)角度還是產(chǎn)品安全性角度考慮,該法均不是最佳方法。
超臨界流體萃取是一種新型的萃取技術(shù),多選用超臨界二氧化碳作為萃取劑,安全環(huán)保、簡便高效、選擇性強(qiáng)。由于超臨界二氧化碳流體的擴(kuò)散特性,該技術(shù)對于人參提取物粉末或浸膏中農(nóng)藥殘留難以取得令人滿意的脫除效果,故文獻(xiàn)報道中研究人員往往致力于應(yīng)用本技術(shù)降低或清除人參原料中的農(nóng)殘,如需進(jìn)一步獲得低農(nóng)殘或無農(nóng)殘的人參提取物,則對超臨界去農(nóng)殘后的人參原料進(jìn)行提取即可。
李淑芬等[25]采取超臨界二氧化碳流體萃取技術(shù)研究人參中農(nóng)藥殘留六六六的脫除工藝,考察了萃取壓力、溫度和夾帶劑等因素對去農(nóng)殘效果的影響。在最佳工藝參數(shù)下,人參樣品中的六六六殘留由1.43 mg/kg快速降至0.04 mg/kg,證實(shí)了應(yīng)用超臨界技術(shù)去除人參中農(nóng)藥殘留的工藝可行性。
李學(xué)洋[26]在前人工作的基礎(chǔ)上,運(yùn)用超臨界二氧化碳流體中試萃取技術(shù)脫除人參中多種有機(jī)氯農(nóng)殘。試驗研究中進(jìn)一步對夾帶劑的種類進(jìn)行了優(yōu)選,并對超臨界二氧化碳流體中試萃取裝置的參數(shù)進(jìn)行了選擇調(diào)試。采用氣相色譜電子俘獲檢測器對萃余物的總六六六、總滴滴涕、五氯硝基苯的殘留量進(jìn)行了檢測,同時對人參皂苷流失量進(jìn)行了考察,從而綜合評價不同夾帶劑因素影響下,農(nóng)殘的脫除率與皂苷損失率的關(guān)系。最終采用10%乙醇作夾帶劑,人參總皂苷損失量低于3%,可以實(shí)現(xiàn)一次脫除農(nóng)殘92%以上。
該方法技術(shù)先進(jìn),操作簡單,生產(chǎn)周期短,去農(nóng)殘效果良好,不引入、不產(chǎn)生有毒有害物質(zhì),二氧化碳可以回收循環(huán)利用,安全不污染環(huán)境。雖然大生產(chǎn)設(shè)備一次性投入較高,但若能合理配置產(chǎn)能,積極開發(fā)去農(nóng)殘系列產(chǎn)品,該技術(shù)仍具有較為光明的產(chǎn)業(yè)化前景。
超臨界與大孔樹脂聯(lián)用脫除人參提取物中農(nóng)藥殘留,是先采用大孔樹脂吸附人參提取物溶液中的農(nóng)藥殘留和人參皂苷,再利用超臨界二氧化碳流體和適當(dāng)?shù)膴A帶劑將大孔樹脂吸附的農(nóng)藥殘留和人參皂苷分別在不同組分中洗脫下來,從而達(dá)到分離農(nóng)殘和有效成分的目的,最終獲得脫殘的人參提取物的方法。
李廣濤[27]從5 種大孔樹脂中篩選得到最適合本工藝的D-101-1 型樹脂,用以吸附人參提取物溶液中的農(nóng)藥殘留和人參皂苷。優(yōu)化確定了該樹脂脫除人參提取物中腐霉利和回收人參皂苷的最佳工藝條件。其中,腐霉利的脫除采用丙酮體積分?jǐn)?shù)為40%的丙酮-正己烷混合溶劑作為夾帶劑,夾帶劑流速為1.5 mL/min,超臨界二氧化碳流體的洗脫溫度55 ℃,洗脫壓力25 MPa,洗脫時間2 h;人參皂苷的回收采用無水乙醇作夾帶劑,夾帶劑流速1 mL/min,超臨界二氧化碳流體的洗脫溫度為60 ℃,洗脫壓力20 MPa,洗脫時間1.5 h,此條件下,人參皂苷提取物中腐霉利含量為0.008 9 mg/kg,脫除率為99.98%;人參皂苷的平均回收率為92.48%。經(jīng)循環(huán)使用試驗證明,D-101-1 型大孔樹脂在使用后不經(jīng)任何額外的再生處理直接連續(xù)循環(huán)使用6 次,人參皂苷提取物產(chǎn)品中腐霉利含量為0.068 9 mg/kg,低于0.1 mg/kg,人參皂苷回收率在90%以上。
該方法將大孔樹脂吸附法和超臨界法有機(jī)的結(jié)合在一起,巧妙地解決了超臨界法無法直接脫除人參提取物粉末或浸膏中農(nóng)藥殘留,大大簡化了人參提取物脫殘的工藝步驟,脫殘效果極佳,人參皂苷回收率也較高,即使在直接循環(huán)利用6 次后仍能保持較高的脫殘率和皂苷回收率。該技術(shù)如能進(jìn)一步深入優(yōu)化工藝參數(shù),降低有機(jī)溶劑的殘留,將更具產(chǎn)業(yè)化前景。
與超臨界原理相似,亞臨界流體萃取也可以被應(yīng)用于去除人參提取物中的農(nóng)藥殘留。所用丙烷具備易揮發(fā)、溶解性強(qiáng)、臨界壓力遠(yuǎn)低于二氧化碳等優(yōu)勢。
張民[28]利用亞臨界丙烷萃取技術(shù)脫除人參提取物中的有機(jī)氯農(nóng)藥殘留,通過正交試驗確定了最佳萃取條件:萃取壓力8 MPa、萃取時間120 min、萃取溫度65 ℃、溶劑流量2.94 kg/h。在此條件下,人參提取物中的γ-六六六和op-滴滴涕脫除率接近100%,pp-滴滴涕、四氯硝基苯的脫除率大于54%,但對β-六六六、五氯硝基苯的脫除效果不佳。萃取后人參皂甙損失率小于6.53%。
雖然該技術(shù)對部分農(nóng)殘有較高的脫除率,且植物有效成分損失較小,但對于其他農(nóng)殘的脫除效果無法令人滿意。同時,所用丙烷為易燃易爆氣體,對安全生產(chǎn)無疑是一大隱患。
生物法降解農(nóng)藥殘留主要包括微生物降解和酶法降解。
王寅[29]利用微生物發(fā)酵得到的一種被稱為“比亞酶”的生物活性酶降解人參中有機(jī)磷農(nóng)殘。該酶可以與殘留的農(nóng)藥發(fā)生反應(yīng),并迅速破壞其有毒成分結(jié)構(gòu),使有毒的農(nóng)藥大分子變?yōu)闊o毒、可溶于水的小分子,降解后的溶液無毒,不會產(chǎn)生二次污染。采用該酶降解23 種有機(jī)磷農(nóng)藥平均降解率均可達(dá)到70 %以上,降解效果較好,為人參中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的生物法降解提供理論依據(jù)。
王麗坤等[30]從西洋參種植基地的土壤中分離一株桿菌,利用它對培養(yǎng)基中添加的有機(jī)氯農(nóng)藥進(jìn)行降解試驗,結(jié)果表明該菌株對有機(jī)氯農(nóng)藥能夠起到一定的降解作用,如能將其應(yīng)用于人參種植,將為降低人參原料中的有機(jī)氯殘留提供一種新的思路。
輻照法降解農(nóng)藥殘留是利用放射性同位素或電子加速器等產(chǎn)生的各種高能射線,使農(nóng)藥的各種化學(xué)鍵在高能量射線的作用下發(fā)生斷裂,從而降解成小分子的過程。
陳其勇等[31]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,考察了不同輻照劑量下,人參口服液中多種殘留農(nóng)藥的降解率變化情況,試驗結(jié)果表明,輻照劑量在0~15 kGy范圍內(nèi),大部分農(nóng)藥降解率隨輻照劑量的增加而增高,吡蟲啉及甲氰菊酯的降解較為明顯效,降解率分別達(dá)到93.2 %及50.8 %;所選8 種有機(jī)磷農(nóng)藥在2 kGy~10 kGy 安全區(qū)間內(nèi)降解率有波動中增大的趨勢,殺撲磷、地蟲硫磷、二嗪磷、伏殺硫磷降解率均大于30%。由此可見,電子束輻照可在一定程度上降解人參口服液中的農(nóng)藥殘留,但其中各種農(nóng)殘降解情況參差不齊。而關(guān)于輻照對于人參口服液中有效成分的影響,文中并未涉及。
綜上所述,本文在近年來的文獻(xiàn)調(diào)研并結(jié)合自身工作實(shí)際總結(jié)了人參提取物中農(nóng)藥殘留的常規(guī)去除方法,涵蓋吸附去除、大孔樹脂柱色譜、液液分配法、超臨界流體萃取法、超臨界與大孔樹脂聯(lián)用法、亞臨界淋洗法、生物法、輻照法等方法,這些方法可以單獨(dú)使用,也可聯(lián)合應(yīng)用,有效去除農(nóng)藥殘留,研究技術(shù)涉及材料學(xué)、物理化學(xué)和生物化學(xué)等多個學(xué)科。研究者在選用合適的去除方法時要充分考查生產(chǎn)原料、生產(chǎn)成本、安全性、環(huán)境保護(hù)、有效成分的損耗率及農(nóng)藥殘留的去除率等重要指標(biāo),綜合評判農(nóng)藥殘留去除工藝的可操作性及其經(jīng)濟(jì)性,從而選取行之有效的農(nóng)藥殘留去除工藝。
中草藥是國之瑰寶,而人參是百草之王,隨著人們對于健康的渴求日益強(qiáng)烈,以人參提取物為代表的植物提取物在全世界范圍內(nèi)受到越來越廣泛的關(guān)注,相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)也日趨嚴(yán)格,其中尤以農(nóng)藥殘留最為重要。積極開發(fā)切實(shí)可行,便捷高效,安全環(huán)保,且具有產(chǎn)業(yè)化前景的人參提取物中除農(nóng)藥殘留的工藝方法,不僅能夠促進(jìn)人參提取物產(chǎn)品的升級換代,也可以為眾多植物提取物解決農(nóng)藥殘留問題提供重要示范,從而帶動中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)進(jìn)入一個新的發(fā)展時期。